인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

본 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 다능성 줄기세포를 완전히 색소화된 성숙한 멜라닌 세포로 분화시키는 것입니다. 이 방법은 멜라닌 세포 발달 과정 중의 핵심 인자들을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 본 프로토콜을 통해 질병 발생 과정에서 잘못 작용하는 인자들을 식별할 수 있으며, 신약 개발 과정에서 중요한 약물을 스크리닝할 수 있습니다.

본 프로토콜의 주요 장점은 완전히 색소화된 멜라닌 세포를 대량으로 생산할 수 있다는 점입니다. 환자로부터 멜라닌 세포를 분리하는 경우에는 일반적으로 얻어지는 세포 수가 상대적으로 적습니다. 젤라틴성 단백질을 소분하여 냉동 보관한 후, 1 mL 분주액을 해동하여 19 mL의 DMEM f12에 재현탁합니다.

그다음, 이 혼합물 5 mL를 10 cm 조직 배양 접시 하나에 넣습니다. 이러한 플레이트를 여러 개 준비한 후, 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이어서, 배양 접시에 15 µg/mL PO가 포함된 PBS를 추가하여 PO, laminin 및 fibronectin이 코팅된 플레이트를 준비하기 시작합니다.

그런 다음 플레이트를 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 이후 용액을 흡입하여 제거하고 1X PBS로 디쉬를 3회 세척합니다. 1 µg/mL의 mouse laminin 1과 2 µg/mL의 fibronectin이 포함된 PBS 10 mL를 첨가하여 코팅을 계속합니다.

그런 다음, 이전에 설명한 대로 디쉬를 배양합니다. 먼저, 10 centimeter 디쉬에 PBS로 희석한 0.1% gelatin을 넣습니다. 그리고 이를 상온에서 5분 동안 둡니다.

플레이트 코팅이 진행되는 동안, 냉동된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 37 °C 항온수조에 넣어 빠르게 해동합니다. 다음으로, 디쉬 내의 젤라틴을 흡입하여 제거하고, 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM을 사용하여 cm²당 약 50,000개의 세포 밀도로 MEF를 분주합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 배지를 흡입하여 제거하고 준비된 MEF 플레이트를 1X PBS로 세척합니다.

미리 준비한 hPSCs(인간 다능성 줄기 세포)가 포함된 hESC 배지 10 milliliters를 10 centimeter 디시에 넣습니다. 디시당 5 million cells의 밀도로 세포를 분주한 후, 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다. 매일 10 milliliters의 신선한 hESC 배지로 세포에 영양을 공급합니다.

분화를 시작하기 전에, 분화된 세포가 포함된 것으로 보이거나 경계가 불규칙하거나 중심부가 투명한 콜로니가 있는지 플레이트를 검사하십시오. 층류 후드 내의 해부 현미경 하에서 피펫을 사용하여 이러한 불규칙한 콜로니를 기계적으로 제거합니다. Matrigel과 같은 젤라틴성 단백질로 코팅하려면, 반복적인 냉동-해동 사이클을 피하기 위해 먼저 단백질을 1 mL씩 분주하여 냉동하십시오.

그 다음, 1 mL의 동결 분주액을 해동하고 19 mL의 DMEM f12로 재현탁합니다. 이 혼합물 5 mL를 10 cm 디쉬에 분주하고 상온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 세포를 분주하기 직전에 젤라틴성 단백질을 즉시 흡입하여 제거하고 DMEM F12로 세척합니다. 디쉬가 코팅되는 동안 hPSCs의 합류도가 약 80%인 플레이트를 선택합니다.

hESC 배지를 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 PBS로 세포를 세척합니다. PBS를 제거한 후, 플레이트에 0.05% trypsin-EDTA 3 mL를 첨가합니다.

MEF가 단일 세포로 떨어지기 시작하는 것이 현미경으로 관찰될 때까지 2분 동안 디쉬를 수평으로 격렬하게 흔듭니다. 이 과정 동안 hPSC 콜로니는 플레이트에 부착된 상태로 유지되어야 합니다. MEF가 떨어져 나왔으나 hPSC 콜로니가 분리되기 전 단계에서 트립신을 흡입하여 제거합니다.

그런 다음, ROCK 억제제인 10 µM Y-27632 dihydrochloride가 포함된 hESC 배지 10 mL를 플레이트에 첨가합니다. 이후 콜로니 위에서 피펫팅을 통해 세포를 떼어냅니다. 다음으로 젤라틴 단백질이 코팅된 디쉬로 옮긴 후 용액을 흡입하여 제거합니다.

응집물을 제거하기 위해 이 디쉬를 DMEM f12로 세척합니다. 그리고 여기에 hPSCs를 1:2 비율로 플레이팅합니다. 그 다음, 10 µM Y-27632 dihydrochloride가 포함된 hESC 배지를 10 mL까지 플레이트에 추가합니다.

세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. ROCK 억제제가 첨가된 배지를 사용하여 매일 세포에 영양을 공급하십시오. hPSC가 80% 합류도(confluency)에 도달하면 신경 분화를 시작하고, 이 시점을 0일차로 지정하십시오.

분화를 시작하기 위해 0일 차와 1일 차에 MP 억제제인 100 nanomolar LDN-193189와 activin 및 Nodal 억제제인 10 micromolar SB 431542가 포함된 KSR 분화 배지 10 milliliters를 세포에 공급합니다. 2일 차에는 동일한 농도의 BNP, activin 및 Nodal 억제제에 Wnt 작용제인 3 micromolar CHIR99021을 추가한 배지로 교체하여 계속 진행합니다. 그 후 3일 차에는 10 micromolar SB 431542와 3 micromolar CHIR99021만 보충된 KSR 분화 배지를 세포에 공급합니다.

75% KSR 분화 배지와 3 µM의 Wnt 작용제가 포함된 25% N2 분화 배지의 혼합물을 준비합니다. 4일 차와 5일 차에 이 액체 15 mL를 세포에 공급합니다. 다음으로 6일 차와 7일 차에는 50% KSR 분화 배지와 50% N2 분화 배지의 혼합물에 3 µM CHIR99021, 25 ng/mL BMP4 및 100 nM EDN3를 보충한 배지 15 mL를 세포에 공급합니다.

그 후, 8일째와 9일째에는 6일째와 7일째에 사용한 것과 동일한 농도의 인자들이 첨가된 25% KSR 분화 배지와 75% N2 분화 배지 혼합액 20 milliliters를 세포에 공급합니다. 10일째에는 3 micromolar CHIR99021, 25 nanograms per milliliter BMP4 및 100 nanomolar EDN3가 함유된 N2 분화 배지 20 milliliters를 세포에 공급하여 신경 분화를 계속 진행합니다. 11일째에, 이전에 PO laminin 1과 fibronectin으로 코팅된 디쉬에서 용액을 흡입하여 제거합니다.

그 다음 플레이트의 뚜껑을 연 채로 조직 배양 후드 내에 약 10분에서 15분 동안 두어 완전히 건조시킵니다. 11일 차 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척하십시오. 그 후, 디쉬에 세포 분리 용액 4 mL를 첨가하고 37 °C에서 25분 동안 배양합니다.

배양 후, 디쉬에 5 mL의 완전 멜라닌세포 배지를 추가합니다. 그리고 세포가 플레이트에서 떨어져 나올 때까지 파이펫으로 수동으로 상하 혼합하여 세포를 재현탁합니다. 현탁액을 15 mL 튜브로 옮기고 200 Gs에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 가라앉힙니다. Trypan Blue 배제법과 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 센 후, 2X10⁶ cells/mL 밀도의 완전 멜라닌세포 배지에서 세포를 재현탁합니다.

건조된 코팅 접시 위에 세포 현탁액 10 µL 방울을 분주합니다. 방울들이 서로 닿지 않으면서도 가깝게 위치해야 하며, 가장자리가 뚜렷하고 퍼지지 않도록 합니다. 세포가 부착될 수 있도록 상온에서 10~20분 동안 그대로 둡니다.

그 후, 부착된 세포가 떨어지지 않도록 주의하며 full melanocyte medium 10 milliliters를 디쉬에 천천히 첨가합니다. 그런 다음 디쉬를 인큐베이터로 옮깁니다. 2~3일마다 full melanocyte medium으로 세포에 배지를 공급합니다.

첫 번째 주가 끝날 때쯤 세포 군집에서 색소 침착이 관찰될 것으로 예상됩니다. 일주일에 한 번, 앞서 설명한 대로 세포 분리 용액을 처리하여 세포를 계대 배양하십시오. 세포를 수집하고 원심 분리한 후, 일반 Neurobasal 배지로 두 번 세척하십시오.

그 다음, PO, lamanin 1 및 fibronectin이 코팅된 디쉬의 완전 멜라닌세포 배지(full melanocyte medium)에 세포를 1:6 비율로 재분배합니다. 분화 약 30일 후 세포는 짙은 색소 침착을 띠게 되며, 이는 고밀도로 플레이팅하거나 계대 배양 시 펠렛(pellet) 상태에서 쉽게 확인할 수 있습니다.

여기에 제시된 이미지는 서술된 분화 프로토콜의 11일 차까지 배양하여 세포를 재도말하기 전의 형질전환 psox10 GFP 인간 배아줄기세포주를 명시야(bright field)로 촬영한 것입니다. 이러한 배양물에서는 세포들이 어둡고 뚜렷한 능선 형태를 이루고 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이 배양물들의 GFP 신호를 평가했을 때, 해당 어두운 능선 부위에 sox10 양성 세포들이 농축되어 있었습니다.

sox10은 신경능선 줄기세포에 의해 상향 조절되고 멜라노블라스트에서 유지되는 전사 인자이므로, 이러한 결과는 이 분화 방법이 11일 차까지 결과적으로 멜라닌 세포로 분화될 세포들을 농축시켰음을 시사합니다. 이에 대한 증거로, 프로토콜 20일 차의 배양물에는 무색소 세포, 성숙 중인 세포 및 완전히 성숙한 유색소 멜라닌 세포가 포함되어 있었습니다. 25일 차에도 배양물에서 동일한 유형의 세포들이 관찰되었습니다.

이러한 제조물 내에 성숙 및 색소 형성 멜라닌 세포가 존재함은 두 가지 멜라닌 생성 단백질 염색을 통해 확인됩니다. 멜라닌모세포와 멜라닌 세포 모두의 마커 역할을 하는 TYRP2와, 여기서는 색소 형성 멜라닌 세포에서만 발현되는 후기 단계 멜라닌 세포 마커인 TYRP1이 사용됩니다. 이 프로토콜을 숙달하면 인간 다능성 줄기세포를 25일 만에 완전히 색소가 형성된 성숙한 멜라닌 세포로 분화시키는 데 활용할 수 있습니다.

본 프로토콜은 먼저 신경능(neuro crest) 상태와 멜라노블라스트(melanoblast) 단계를 거쳐 정상적인 멜라닌 세포 발달 과정으로 진행됩니다.