Name: 어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 배우세요 어린이 비강 상피 세포 채취 및 배양 방법과 iPSC로의 재프로그래밍 기술을. 이 비침습적 기법은 천식 및 호흡기 질환 연구를 위한 균일한 세포 집단을 제공합니다.

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저자는 다 능성 줄기 세포 시설 신시내티 아동 병원에서 공 촛점 이미징 코어를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) 및 2U19AI70235 (GKKH)에 의해 지원되었다.

다음 프로토콜은 기관 인간의 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 1. 코 점막을 샘플링 참고 : 호흡기 바이러스 감염의 흔적이없는 피사체에서 샘플을 얻습니다. <ol><li> 참가자 방문하기 전에 15 ML 원뿔 신선한를 준비하고 2 ml의 BEGM (기관지 상피 세포 성장 배지) 플러스 20 ㎕를 멸균 펜 / 패 혈성 / Fungizone (P / S / F) (0.01 %)를 추가합니다. </li><li> 열기 세포학 단지 샘플을 복용하기 전에 브러시 및 살균 브러시를 유지해야하고, 코 표면 이외의 모든 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 가만히 앉아 천장을 향해 머리를 기울 참가자를 요청합니다. 작은이 이상 불안 아이들은 그들의 손에 앉아 및 / 또는 멀리 브러시를 때리는 등 모욕적 피하기 위해 누워. </li><li> 통로가 좁아 (작은 블랙홀처럼 보이는) 코의 뒤쪽에 브러시를 목표로하고 있습니다. 아래로 브러시를 밀어 브러시가 nostri에서 제거 될 때 손목을 비틀엘. </li><li> 원뿔에서 브러시를 놓고 BEGM에 잠수함. 여분의 브러쉬를 잘라 튜브에 뚜껑을 교체합니다. VORTEX하지 않습니다. 주 : 참가자 용의 경우와 동일한 방식으로했지만 제 콧 구멍에 제 브러쉬 얻었다. 양쪽 콧 구멍의 칫솔질을 얻는 것은 샘플링이 성공하는 높은 가능성이 발생합니다. 같은 콧 구멍을 샘플링 출혈이 발생할 수 가능성 샘플을 향상되지 않습니다. </li><li> 따뜻한 물로 비이커를 사용하여 운송 중 가능한 37 ° C에 가까운 샘플을 보관하십시오. </li></ol> 2. 세포 수와 Cytospin <ol><li> 부드럽게 BEGM에 브러시를 교반하고 hemacytometer를 사용하여 세포 수의 샘플 10 μL를 취할. 라이브 / 죽은 얼룩의 10 μl를 추가 만 현미경으로 세포를 살고 계산합니다. </li><li> 샘플의 50 μl를 타고 1X PBS 200 μL에 희석. 2 분 동안 300 rpm에서 유리 슬라이드와 스핀에 부착 cytospin 깔때기에 추가합니다. 따라와 건조 O / N 및 얼룩 슬라이드를 밀어 보자g 제조업체의 지침. 바람직하게는 어둠 속에서, O / N을 건조하도록 허용합니다. </li><li> 헤마 3 얼룩 얼룩 슬라이드 <ol><li> 각 솔루션 (; 헤마 3 솔루션 I, 핑크, 헤마 정착액, 밝은 파란색과 헤마 3 솔루션 II, 푸른 깊이)로 이동시켜 염색 접시에; 사용하지 않을 때는 커버하십시오. 슬라이드 염색 보트에 슬라이드를 삽입 </li><li> 딥 슬라이드는 지속적으로 30 초 동안 정착에 다음 과잉 배출 할 수 있습니다. 딥 내가 30 초 동안, 다음 과잉 배출 할 수 있도록 솔루션에 지속적으로 슬라이드. 딥은 과잉 배출 할 수 있도록 30 초 동안 지속적으로 솔루션 II에 슬라이드 </li><li> 물이 맑은 실행까지 탈 이온수로 씻어. 어둠 속에서 바람직하게는, O / N을 건조하도록 허용 </li></ol></li><li> 상피 세포의 비율을 결정, 현미경 카운트 세포에서 슬라이드 봐. 샘플링이 좋은 경우 90 % 이상이어야합니다. </li></ol> 3. 시드 셀 주 : 적절한 인증 조직 문화의 모든 세포 배양 과정을 수행후드 무균 기술을 사용. <ol><li> 소 피부 콜라겐 (BDC)와 코트 판, 유형 1. 49.5 ㎖의 1X PBS에 희석 3 ㎎ / ㎖ BDC의 0.5 ML을 추가합니다. 몇 판을 사용할 경우 더 적은을 준비합니다. 코트 2 시간 동안 37 ° C에서 T25의 2 ml의 BDC와 플라스크 및 멸균 후드 O에 품어 / N 또는 필요한 경우. </li><li> 배양 후, 남아있는 액체를 대기음. 멸균 후드에서 30 분 동안 자외선에 플라스크를 노출. 하지만 1 개월까지 4 °에서 C에 대한 저장소 플라스크, 세포를 파종하기 전에 C를 RT로 가져 또는 37 °. </li><li> 시드 할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 BEGM에 브러시와 세포를 유지합니다. 조심스럽게 휙 원뿔 내부 브러시,하지만 소용돌이하지 않습니다. <ol><li> 플레이트 T25 플라스크에 7 × 10 5 세포. 이하이 있으면 작은 컨테이너 6 웰 플레이트 중 하나와 같은 잘 사용한다. 이 크기의 플레이트는 약 3 × 10 5 세포를 필요로한다. 참고 :이 많은 세포가없는 경우, 계속하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 멸균 후드 아래, 튜브 및 GE에서 브러시을ntly 코팅이 긁히지 않도록주의하면서, 코팅 된 플라스크의 표면에 브러시를 회전 할 수 있습니다. 적절한 생물 학적 용기에 브러시를 폐기하십시오. </li><li> 천천히 원뿔에서 그리고 T25 플라스크에 BEGM에 남아있는 세포를 피펫. 현미경으로 세포를 관찰한다. 부유 세포의 숫자가 관찰되며이 단계 (도 3a)에서 허용되는 코 일부 파편이있을 수있다. </li></ol> 4. 세포 배양 <ol><li> 세포를 파종 한 후,이를 중단없이 48 시간 (그림 3)에 안주 할 수 있습니다. 48 시간 후, 천천히 그리고 부드럽게 2 ml의 따뜻한 BEGM 및 무균 페니실린 / 스트렙토 마이신 / Fungizone (P / S / F) 20 μl를 추가합니다. 참고 : 미디어의 원래 2 ml에 대기음하지 마십시오. </li><li> 파종 후 4 번째 날, 신중하게 모든 액체를 대기음, 신선한 4 ㎖로 교체 BEGM 플러스 1X 펜 / 연쇄상 구균이 (fungizone가 더 이상 필요하지 않습니다) 가온. 이틀 미디어를 변경하고 연결에 대한 세포를 평가, 표준, 성장과 합류. 세포에 도달하면 ~ 80 %의 합류, 일반적으로 2-3 주 내에, 그들은 계대 할 준비가 된 것입니다. </li><li> 하나 T25 플라스크 (약 2.5 × 10 6 세포 때 합류) 세 T25 플라스크 또는 1 T75 플라스크에 계대 수 있습니다. 제 1 통로 후, 세포는 약 3 일 합류에게 도달 튼튼하고 건강해야한다. </li></ol> 5.과 Passaging 세포 <ol><li> 부드럽게 접시에서 미디어를 대기음. 약 4 분 동안 인큐베이터에있는 접시와 장소 T25 플라스크 당 1 ml의 0.05 % 트립신 솔루션을 추가하거나 세포를 플레이트에서 분리 될 때까지. 세포마다 2 분의 분리의 수준을 확인하고 이상 10 분에 트립신을 두지 마십시오. </li><li> 효소를 중화 5 ㎖의 트립신 중화 솔루션 (TNS), 또는 혈청 함유 미디어를 추가합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 플라스크 장소에서 모든 액체 및 세포를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 200 XG (감속 가속도 0 0)에서 원심 분리 세포 펠렛을 얻었다. 기음 superna새로운 플라스크에 필요한 볼륨 S BEGM에서 + P / 중대장과에 resuspend 세포 (T75 플라스크에 대한 T25 플라스크 4 ml의 10 ㎖) </li><li> (2.1) 전술 한 바와 같이 라이브 / 죽은 얼룩 세포 수를 수행합니다. 코팅 된 플라스크에 BEGM 세포의 적절한 금액을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 상기 상세한 유지 또는 용액 당 0.5 × 106 세포의 농도로 배지 (70 % BEGM, 20 % FBS와 10 % DMSO)를 동결 cryopreserve. </li></ol> iPSCs 6. 재 프로그래밍 참고 : iPSCs를 생성하기 전에 생성과 인간 iPSCs의 사용을 규제하는 모든 기관 규정 준수를 보장합니다. 배양 배지는 통상적으로 항생제를 함유하지 않는 멸균 기술은 IPSC 배양에 특히 중요하다. NECs 건강 표시하고 견고 성공적인 프로그래밍에 대한 증식있는 것이 중요합니다. <ol><li> 판 6 잘 조직 배양 플레이트의 웰 당 5 × 10 5 NECs. 24 시간 후, 폴리 브렌 추가BEGM에 매체 인 Oct4, Sox2이, Klf4, C-Myc와 발현 렌티 바이러스 입자를 첨가하여 8 μg의 / ㎖ 및 형질 도입 NECs 최종 농도. 5 ~ 27의 감염 (MOI)의 다양성을 달성하는 것을 목표로하고 있습니다. <ol><li> MOI를 결정하는 것과, 농축 - 렌티 바이러스 스톡의 희석액을 제조하고 이들로 희석 HT1080 세포를 형질 도입. HT1080 세포에서 발현 dTomato 제 명백하게 검출 후 dTomato 양성 세포 / 희석 각 셀의 작은 덩어​​리의 수를 기록하여 &quot;형질 도입 단위 용액 /&quot;의 수를 계산한다. 참고 : 일반적으로 너무 높은 희석 (모든 dTomato 긍정적이다) 너무 낮은 (없음 또는 양성 세포의 커플)이있을 것이다. </li><li> 세포의 분리 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 확인되는 희석에서 득점을 수행합니다. 적절한 희석 인자 단위 / ㎖ 열 변환 수를 보정함으로써 역가를 결정한다. MOI는 수의 비율의 바이러스 입자 (27)의 수를 셀 형질. 참고 : 각 dTomato 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 하나의 바이러스 입자에서 발생하는 가정한다. </li></ol></li><li> 약 3 시간 후 전달 매체를 제거하고 신선한 BEGM로 교체합니다. 제도적 승인 절차를 사용하여 렌티 바이러스 함유 미디어를 폐기하십시오. 3 일간 인큐베이터에 형질 NECs를 돌려줍니다. </li><li> 3 일에, 신선한 BEGM와 미디어를 교체 한 다음 다른 3 일간 배양한다. 기음 미디어는 1X PBS로 세포를 씻어 잘 1 ml를 0.05 % 트립신 솔루션을 추가 보냈다. 트립신과 통로 세포 (섹션 5) 위의 기록으로. 조심스럽게 4 ml의 BEGM + P / S에 뜨는 및에 resuspend 세포를 대기음. 세포를 준비하는 경우 (다음 단계 참조) BDC 코팅 6 웰 플레이트의 웰에 새로운 계대 또는 MEF 배양에 첨가 될 수있다. </li><li> MEF 코팅 된 플레이트를 준비합니다. 4 일에 () +/- Thiazovivin (SPT를 수행 단계 6.6를 참조)도 6의 2 웰 (1 ㎖ / 잘) 0.1 % 젤라틴 용액을 추가합니다. 다음에하루는 불 활성화 MEFs에 28 병을 해동. </li><li> MEF 미디어 (DMEM + 1 배 NEAA + 10 % DFCS) 10 ㎖로 MEFs에 배치합니다. 5 분 200 XG에 스핀 펠렛합니다. MEF 미디어를 Resuspend. 대기음 6 웰 플레이트에서 젤라틴과 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트의 웰 당 1.87 × 10 5 MEFs에 추가합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어, 또는 24 시간의 최소. </li><li> BEGM의 양도 2 ㎖를 이전에 코팅 된 6 웰 플레이트의 두 우물에 잘 당 세포를 형질 도입 및 / N을 O를 품어 함유. 다음날 4 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자를 함유하는 표준 hESC의 미디어 웰 당 2.5 ㎖로 교체 BEGM. 신선한 hESC의 매체와 세포를 공급 +/- SPT를 매일 10 일 동안 참고 : NECs (23)에 대한 효율성과 프로그래밍의 반응 속도를 향상시키기 위해 작은 분자 (SB431542, PD0325901 및 Thiazovivin (SPT) 칵테일)의 칵테일을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 십일 후, SPT없이 hESC의 미디어를 사용하여 매일 먹이를 계속합니다. hESC의 같은 식민지 때까지 매일 문화를 피드(그림 5A, P0 식민지)를 나타납니다. 세포질 비와 눈에 띄는 핵소체 : 높은 핵으로 추정 iPSCs을 품고 식민지를 확인합니다. </li><li> hESC의 같은 형태를 가진 수동 소비세 및 전송 식민지 공급 장치가없는 시스템에서 별도의 선으로 문화와 확​​장을 위해 우물을 분리합니다. 절제 식민지는 이러한 조건에 빠르게 적응해야한다. <ol><li> 도금 절제 식민지 후이 이산 추정 IPSC 라인은 지금 통로 1 (P1)으로 간주됩니다. 매일 mTeSR1와 피드 문화. 통로 및 표준 절차를 사용하여 IPSC 라인을 확장합니다. P1의 식민지들은 계대되어야하는 크기에 도달하는 것은 일주일에 며칠이 걸릴 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 7. 문화 iPSCs 유지 <ol><li> 피드 및 일일 문화를 평가합니다. 수동 소비세 지역은 멸균 유리 피펫 또는 마이크로 피펫 팁으로 긁어에 의해 명백한 차별화를 전시. 매일 수확 후 미디어를 변경합니다. </li><li> 통로 세포 approxima 후tely 4 일마다 : 부드럽게 흡인 미디어, 6 웰 플레이트 (하프 공급 볼륨)의 웰 당 1 ml의 따뜻한 스파 아제 (Dispase) (1 ㎎ / ㎖)을 추가 한 후 약 4 분 동안 37 ° C에서 품어. 식민지의 가장자리는 식민지 주위에 흰색 테두리처럼 보이는, 리프트 시작합니다. 조심스럽게 스파 아제 (Dispase)를 대기음 및 예열 DMEM / F12와 함께 배를 씻는다. </li><li> 2 ml의 mTeSR1를 추가하고 판에서 식민지를 들어 올릴 셀 리프터를 사용합니다. 식민지가 작은 클러스터로 분할 될 때까지 부드럽게 세포를 씹다에 5 ㎖의 혈청 학적 피펫 또는 P1000의 마이크로 피펫을 사용합니다. <ol><li> 생존 후속 증식 차선 바와 같이, 매우 작은 클러스터 또는 단일 셀의 제조 피. 콜로니를 다시 도금하면, 1 : 4 내지 1 : 6 분할 최적 콜로니 밀도를 유지한다. 부드럽게 판에서 식민지와 미디어를 제거하고 새로운, 마트 리겔 코팅 된 웰에 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

코 점막 상피 세포 (NECs)는기도 질환 연구를위한 액세스 플랫폼, 그리고 NEC-iPSCs 질병 개발, 치료 및 치료 1,31,32을 탐구하는 흥미로운 수단을 제공합니다. NECs 쉽게 스트레스 또는 잠재적으로 유해한 절차 6,23없이 얻을 수있다. 우리의 경험에 의하면,이 프로토콜에 설명 된대로 코 점막의 샘플링은 스트레스를 덜하고 더 나은 어린이를위한 채혈보다 인식이 나타납니다. 따라서,이 방법은기도 질환 연구에 특히 소아 환자 집단에서 유용하고 관련이있을 수 있습니다. NECs의 또 다른 장점은 문화에 한 번, 상피 세포는 미디어와 문화 조건으로 선택하고 균일하게된다는 것이다. 이는 혈액 세포로 복합 조직을 사용하는 것보다 유리하고 쉽게 transcriptomic 및 후생 유전 학적 방법을 사용하여 IPSC 라인 얻어진 세포 기원의 영향을 평가한다. 언제비점막 샘플링, 대부분의 상피 세포가 검색되도록 현미경 (도 ...

인간의 샘플 (hiPSCs)에서 유도 만능 줄기 세포는 줄기 세포 연구의 빠른 개발 기술입니다. 그들은 훨씬 적은 윤리적, 도덕적 결점의 1, 2와 배아 줄기 세포 (hESC의) 연구에 대한 대안을 제공합니다. 그들은 hESCs는 3-5 성적으로 동일하지 않지만, hiPSCs 개발 및 질환 표현형을 모델링하는 독특한 방법을 제공하고이 질환 상태와 관련 5-8 조직 유래 될 수있다. 생성 hiPSCs 새로운 방법을 끊임없이 이식에 적합한 GMP 품질 iPSCs을 제조하고, 또한 리 프로그래밍 프로세스 6,9-11의 적시성 및 효율성을 증가시키는 방법으로, 시작하는 최적의 세포 유형을 식별하기 위해 탐색되고있다. 기도 상피 세포 알레르기 성 염증 (12)의 개발에 중요하며, 상피 immun와 상호 작용을 통해 알레르기 반응과기도 개형의 중요한 드라이버 인전자와 기질 세포. 기도 상피 기원과 천식과 같은 폐 질환의 지속성에 필수적인 역할을한다. 그러나, 낮은기도 상피 세포, 특히 건강 관리 환자와 어린이, 임상에서 얻을하기가 어렵습니다. 대기 오염 물질과 알레르기 항원에 대한 반응을 연구, 특히 여러 연구의 데이터는, 코 점막의 상피 세포가 낮은기도 상피 세포 13-20에 대한 유효하고 실질적인 프록시 있다는 전제를 지원합니다. 코 점막은 90 % 이상 섬모기도 상피 세포로 구성하고 다른 세포 / 조직 샘플링 기술보다 덜 침습적이고 같이이 코 점막 상피 세포 (NECs)를 샘플링하는 것은 쉽게, 연령 네다섯 한 어린 아이에서 수행 될 수있다 감염 20-23과 같은 부작용의 위험을 최소화과 관련. 그것은 긴 불필요한, ​​종종 고통스러운 기관지의 procedu없이 건강하고 병에 걸린 어린이 모두를 샘플링 할 수있는 신속하고 간단한 방법을 제공합니다진정 작용을 필요로 입술. 이전의 연구는 천식 심각도 습관병 아형 비점막뿐만 아니라 천식 어린이로부터 취한 기관지 세포 샘플 모두에서 구별 될 수 있음을 발견하고, 두 조직 유형 간의 유전자 발현은 비 편재 유전자 (22)의 약 90 %에서 유사 24. iPSCs의 소스로, NECs 다른 자주 사용되는 세포 유형을 통해 이점을 제공합니다. 섬유 아세포는 종종 IPSC 생성을 위해 사용되지만, 이들 세포를 쉽게 피부 생검에서 배양 될 수 있지만,이 프로세스는 일반적으로 국소 마취, 절개 봉합을 필요로하고, 감염 될 위험과 관련된다. 따라서, 생검이 유형의 환자의 동의를 얻는 것은 25 어려울 수 있습니다. 섬유 아세포에 대한 한 대안은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)이다. 그러나, 소아에서 IPSC 생성을위한 충분한 혈액을 얻는 것이 어려울 수있다. 또한, 다운 스트림 액세스 포인트의 제한이있다섬유 아세포 및 혈액 세포 유래 iPSCs, 특정 세포 유형 5,26 특히 분화 능력에 대한 plications. 따라서, 상대의 접근성 및 컬렉션 다음 부작용의 낮은 위험을 주어 NECs 소아 인구에서 IPSC 생성을위한 이상적인 셀 소스를 나타낸다. iPSCs 소설 질병 모델을 인간 개발 연구 생성 플랫폼으로 최근에 많은 주목을 받아 맞춤 치료를위한 세포의 잠재적 인 소스로했다. 이 기술의 잠재력이 실현 될 수 있기 전에, 프로그래밍 과정의 분자 토대가 설명 될 필요가 있지만, 지금이 프로토콜 내에서 설명 된 절차를기도 노출에 집중 조사 연구 해명 것임은 물론위한 플랫폼을 제공하는 iPSCs 관련된 개인화 된 의약품의 효과를 연구. 여러 연구소의 공동 작업은 generatio하게되었다코 점막을 샘플링뿐만 아니라, NECs를 배양하고, iPSCs (23)이 세포를 재 프로그램뿐만 아니라에 대한 성공적인 기술의 N. 이 문서에서는 최적의 샘플링, 배양 및 프로그래밍 환경을위한 프로토콜의 개요를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>15ml 원뿔</td>형 <td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>프로토콜 단계 1.1.</td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>프로토콜 1.1단계.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>프로토콜 단계 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>프로토콜 단계 4.a.</td></tr><tr><td>cytosoft cytology brush</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>프로토콜 단계 1.2.</td></tr><tr><td>trypan 블루</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>MT-25-900-CI</td><td>프로토콜 단계 2.1.</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>프로토콜 단계 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>프로토콜 2.2단계.</td></tr><tr><td>세포학 깔때기 클립</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>프로토콜 단계 2.2.</td></tr><tr><td>사이토스핀 깔때기</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>프로토콜 단계 2.2.</td></tr><tr><td>사이토스핀 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>프로토콜 2.2단계.</td></tr><tr><td>블랭크 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>프로토콜 단계 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 stain kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>프로토콜 단계 2.2.</td></tr><tr><td>소 진피 콜라겐, 유형 1</td><td>생명 기술</td><td>A1064401</td><td>프로토콜 단계 3.2.</td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>프로토콜 단계 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>프로토콜 5.2 단계.</td></tr><tr><td>트립신 중화 용액</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>프로토콜 5.2단계.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS), 65 &deg에서 열 살균; C 30분 동안</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>프로토콜 5.5단계.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 Hybri-Max&trade;, 멸균 여과, BioReagent, 하이브리도마에 적합, &ge; 99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>프로토콜 5.5단계.</td></tr><tr><td>폴리시스톤 렌티바이러스*</td><td>예: Millipore</td><td>SCR511</td><td>프로토콜 단계 6.4.&nbsp; reprogramming vector의 상업적 소스가 나열되어 있습니다. 당사는 Voelkel 등(PMID: 20385817)이 보고한 4-in-1 플라스미드를 일상적으로 사용하여 사내에서 VSV-G pseudotyped polycistronic 재프로그래밍 렌티바이러스를 생성합니다. 이 플라스미드는 &nbsp;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>프로토콜 단계 6.4.</td></tr><tr><td>방사선 조사된 CF1 MEFs</td><td>GlobalStem&nbsp;</td><td>GSC-6301G</td><td>프로토콜 6.4단계.</td></tr><tr><td>hESC media</td> 프로토콜 <td></td><td>프로토콜 단계 6.11</td><td>에 포함된 레시피를 참조하십시오</td>.</tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>프로토콜 단계 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>프로토콜 단계 6.11.</td></tr><tr><td>티아조비빈&nbsp;</td><td>형태소</td><td>04-0017</td><td>프로토콜 6.11단계.</td></tr><tr><td>hESC 인증 Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>프로토콜 Step 6.13.</td></tr><tr><td>코닝 플레이트, 6웰</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>08-772-1B</td><td>프로토콜 단계 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>프로토콜 6.13단계.</td></tr><tr><td>250ml 일회용 필터 플라스크(0.22 &마이크로; m)</td><td>피셔</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>프로토콜 배포 7.3단계.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>프로토콜 7.3단계.</td></tr><tr><td>세포 리프터</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>프로토콜 7.4단계.</td></tr><tr><td>hESC Media**</td><td></td><td></td><td>프로토콜 Step 6.11. 성분을 혼합한 후 필터 멸균해야 합니다. 미디어는 4 &deg로 유지할 수 있습니다. C를 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. 매체를 데울 때 37°C로 두지 마십시오. C 15분 이상</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 미디어</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>최종 농축</td></tr><tr><td>KO 교체 혈청 (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0.2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig;-mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>100x 비필수 아미노산</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &micro; g/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자 (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

비강 상피 세포(NEC)는 공기 오염 물질에 반응하는 기도의 일부이며 호흡기 바이러스에 감염된 첫 번째 세포입니다. 또한 선천성 면역 반응과 면역 및 기도 기질 세포와의 상호 작용을 통해 많은 기도 질환에 관여합니다. NEC는 임상 방문 중 접근성이 높기 때문에 소아 연구에서 특히 관심이 많습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 여러 세포 유형에서 생성되었으며 인간 발달 및 질병을 모델링하고 재생 의학에서 잠재적인 응용 프로그램을 위한 강력한 도구입니다. 이것은 연구 목적으로 소아 참가자로부터 파생된 NEC에서 iPSC를 성공적으로 생성하기 위한 방법을 제시하는 최초의 프로토콜입니다. 어린이로부터 비강 상피 세포를 얻는 방법, 이러한 샘플에서 1차 NEC 배양을 생성하는 방법, 1차 NEC를 잘 특성화된 iPSC로 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 코 점막 샘플은 어린이의 대기 오염의 영향과 관련된 역학 연구에 유용하며 기도 질환을 연구하는 데 중요한 도구를 제공합니다. 1차 비강 세포와 이로부터 유래한 iPSC는 천식 및 COPD 연구를 포함한 다양한 기도 상피 생물학 분야에서 환자별 연구를 위한 무제한의 자료를 제공하는 도구가 될 수 있습니다.

코 전정 불리는 코 초기 부분, 연골 조직 (29)으로 둘러싸인 영역이다. 브러쉬 코 밸브 (소공의 internum 또는 비공 뒷면에서 본 &quot;블랙홀&quot;) 이상, 코이 영역을지나 원활하게 진행해야하고, 시료 비갑개 (도 1)로부터 얻어진다. 비강 비갑개은 코 (29)의 표면적을 증가 샘플링 그들에게 최적 위치를 결정 뼈 구조이다. 이 지역은 또한 밀접하게 하부기도의 라이닝과 유사한 환경 노출에 대한 면역 반응 또한 활성화되어 혈관 점막 조직에 의해 줄 지어있다. 올바른 조직을 샘플링 재 프로그램 된 세포가 상피 세포임을 보장합니다. 이것은, 또한 배양 세포를 관찰하여 초기 셀 카운트 및 cytospin 의해 평가 될 수있다. 그만큼cytospin가 한 번, 스핀 다운 건조하고,...

이 간행물은 어린이의 코 상피 점막을 성공적으로 샘플링 및 배양하고 이러한 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다.

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 어린이로부터 채취한 비강 상피 세포를 배양하고, 이를 유도만능줄기세포로 리프로그래밍하는 것입니다. 이 방법은 천식의 발생 기전과 같이 호흡기 질환 분야의 핵심적인 의문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 스트레스를 유발하는 시술 없이 어린이로부터 기도 상피 세포를 수집할 수 있다는 점입니다.배양 시 이들은 균질한 집단을 이루며, 유도만능줄기세포(iPSCs)를 생성하기 위한 훌륭한 기질이 됩니다. 우리는 천식과 대기 오염에 따른 후성유전학적 변이를 조사하기 위해 아동으로부터 중피세포를 수집하는 연구에 대해 Ji 박사 및 Hershey 박사와 논의했을 때 이 연구에 대한 처음 아이디어를 얻었습니다.비강 샘플링과 비강 상피 세포의 iPSC 리프로그래밍은 확립된 프로토콜보다는 개인의 경험에 기반하는 까다로운 기술이므로, 이러한 기법들을 시각적으로 시연하는 것이 매우 중요합니다. 대상자가 방문하기 전, 2 mL의 신선한 기관지 상피 성장 배지(BEGM)를 15 mL 원추형 튜브에 옮겨 담습니다. 그런 다음, 이 배지에 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B 혼합물을 최종 농도가 0.01%가 되도록 20 µL 첨가합니다. 대상자가 도착하면 의자에 앉도록 안내합니다.그 다음, 검체를 채취하기 직전에 세포학 브러시(cytology brush)를 개봉하며, 멸균 상태를 유지하기 위해 브러시가 어떤 표면에도 닿지 않도록 주의하십시오. 참여자에게 가만히 앉아 고개를 천장 쪽으로 위로 기울이도록 안내하십시오. 만약 참여자가 안절부절못한다면, 브러시를 쳐내려 하지 않도록 손 위에 앉아 있게 하십시오.다음으로, 비강 통로가 좁아지는 코 뒷부분을 겨냥하여 브러시를 삽입합니다. 그 후, 손목을 비트는 동작으로 브러시를 아래로 미끄러뜨리며 콧구멍에서 제거합니다. 이어서 브러시를 미리 준비한 원추형 튜브에 넣고, BEGM에 완전히 잠기도록 합니다.그런 다음 브러시의 남은 부분을 잘라내고 튜브의 캡을 닫습니다. 검체를 채취한 후에는 가능한 한 37°C에 가깝게 유지될 수 있도록 즉시 따뜻한 물이 담긴 비커에 넣으십시오. 그 후 실험실로 운반합니다.실험실에 도착하면 BEGM 내에서 브러시를 부드럽게 흔들어 줍니다. 그다음, 샘플 10 µL를 취해 여기에 live/dead 세포 염색 시약 10 µL를 첨가합니다. 이 혼합물을 혈구계수기에 점적합니다.현미경으로 살아있는 세포만 계수합니다. 세포 계수 후, 샘플 50 µL를 취해 1X PBS로 200 µL가 되도록 희석합니다. 희석하지 않은 나머지 세포 혼합물은 브러시와 함께 세포 파종 전까지 37 °C로 조절된 항온수조에 보관합니다.PBS로 희석한 시료를 슬라이드 글라스에 부착된 사이토스핀 깔때기에 넣습니다. 그런 다음 전체 장치를 400 rpm으로 2분 동안 원심분리합니다. 이후 깔때기를 제거하고 슬라이드를 암소에서 하룻밤 동안 건조시킵니다.본문 프로토콜에서 설명한 대로 Hema 3로 슬라이드를 염색한 후, 현미경으로 관찰하여 세포 수를 측정합니다. 상피세포 특유의 특징인 원주형 모양, 섬모, 그리고 하나의 둥근 핵을 통해 상피세포를 식별하고, 준비물 내 이 세포들의 백분율을 결정합니다.파종을 시작하려면, 인증된 조직 배양 후드 내에서 원추형 튜브 안의 브러시를 부드럽게 흔든 다음 튜브에서 꺼냅니다. 그 후, 이전에 소 dermal collagen으로 코팅된 T25 플라스크의 내면에서 브러시를 조심스럽게 회전시키되, 코팅이 긁히지 않도록 주의합니다. 그런 다음 브러시를 적절한 생물학적 위험물 폐기 용기에 버립니다.원뿔형 튜브에 남아 있는 BEGM 내의 세포를 T25 플라스크로 천천히 피펫팅하여 옮기며, 최소 5 × 10⁵ cells가 되도록 합니다. 도립 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 본문에 설명된 대로 세포를 배양하고 계대 배양한 후, 6-well 조직 배양 플레이트의 웰당 2 mL의 BEGM에 5 × 10⁵개의 비강 상피 세포를 분주하십시오.그 후 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 세포가 활발하게 증식하고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 흄 후드 내에서 BEGM이 포함된 각 웰에 Polybrene을 최종 농도 8 µg/mL가 되도록 첨가합니다.텍스트 프로토콜에서 설명한 대로, 각 웰의 배지에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 발현하는 렌티바이러스 입자를 첨가하여 비상피세포를 형질도입합니다. 형질도입된 세포를 약 3시간 동안 배양한 후, 기관에서 승인된 절차에 따라 바이러스가 포함된 배지를 제거하여 폐기합니다. 그 다음, 이 배지를 BEGM으로 교체하고 형질도입된 비상피세포를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.3일 후, 배지를 신선한 BEGM으로 교체합니다. 그런 다음 형질전환된 세포를 동일한 조건에서 배양합니다. 다음 날, 마우스 배아 섬유아세포 코팅 플레이트 준비를 시작하기 위해 6-웰 플레이트의 웰 2개에 0.1% gelatin 용액을 첨가합니다.그 다음 플레이트를 해당 덮개로 덮고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 5일 차에는 약 5 × 10⁵개의 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs로 약칭)가 들어 있는 바이알을 해동합니다. 그런 다음 이 세포들을 10 mL의 MEF 배지에 넣습니다.이어서 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후 상층액을 흡입하여 제거하고 MEF를 동일한 배지로 재현탁합니다. 세포 수를 측정하고 나면, 이전에 준비한 6-웰 플레이트에서 젤라틴 용액을 흡입하여 제거합니다.다음으로, 젤라틴이 코팅된 플레이트의 각 웰에 1.87 × 10⁵ 개의 MEF를 넣고 37 °C에서 최소 24시간 동안 배양합니다. 이후 배양 6일 차에 형질전환된 세포에서 배양액을 흡입하여 제거하고 1X PBS로 세척합니다. 다음으로, 플레이트의 각 웰에 0.05% trypsin 용액 1 mL를 첨가합니다.세포가 탈착되면 trypsin 중화 용액(TNS)으로 중화한 후, 앞서 설명한 대로 세포를 수집하여 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거하고, penicillin과 streptomycin이 첨가된 BEGM 4 mL에 세포를 재현탁합니다. 이렇게 준비된 세포 현탁액 2 mL를 이전에 준비한 플레이트의 gelatin 및 MEF 코팅 웰에 각각 분주합니다.세포를 하룻밤 동안 배양한 후, BEGM을 ng/mL당 4 ng의 기본 섬유아세포 성장 인자가 포함된 2.5 mL의 표준 인간 배아 줄기세포(hESC) 배지로 교체합니다. 배양을 계속하며 hESC 유사 콜로니(추정 유도만능줄기세포, iPSC 포함)가 관찰될 때까지 매일 신선한 hESC 배지를 공급합니다. 이 콜로니들을 수동으로 절제하여 24-웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨, 피더 프리(feeder-free) 시스템에서 별개의 라인으로 배양 및 증식시킵니다.초기 비강 샘플은 다양한 세포 유형과 잔해물이 섞여 있습니다. 하지만 배양 및 배지 교체 후에는 세포 계대 배양 하루 뒤에 촬영된 이 사진에서 보는 바와 같이, 이러한 조제물에서 상피세포가 우세해집니다. 여기서 합류 상태(confluence)로 성장하는 상피세포는 커다란 핵과 신장된 세포질을 나타냅니다.본 연구에 사용된 렌티바이러스 입자의 특성으로 인해, 이러한 비강 상피 세포를 형질전환시키면 tdTomato 형광 마커가 발현되며, 이는 형질전환 4일 후의 세포 우측 상단 이미지에서 확인할 수 있습니다. 이에 해당하는 명시야 이미지와 비교해 보면, 하단의 병합 이미지에서 알 수 있듯이 모든 세포가 tdTomato 신호를 나타내는 것은 아닙니다. 따라서 모든 세포가 형질전환되는 것은 아닙니다.하지만, 형질전환 효율은 약 90%입니다. 프로토콜에 설명된 대로 형질전환된 비상피세포를 배양하면 iPSC 콜로니가 형성됩니다. iPSC 콜로니를 수확하여 표준 무피더(feeder-free) 조건에서 배양한 후, 이러한 콜로니 내의 개별 세포들은 이 확대 이미지에서 보여지는 바와 같이 둥근 모양, 큰 핵, 그리고 높은 핵-세포질 비율과 같은 전형적인 hESC 유사 형태를 나타냈습니다. 숙련되면, 적절히 수행했을 때 이 기술은 1시간 30분 내에 완료할 수 있습니다.본 절차를 수행할 때, 샘플을 정확하게 채취하고 세포를 37°C로 유지하며, 적절한 밀도로 가능한 한 빠르게 플레이팅하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 일차 비강 상피세포를 이용한 공기-액체 계면(air-liquid interface) 구축과 같은 다른 방법을 수행하여, 우리가 알레르겐 및 병원균에 어떻게 반응하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 연구자들은 천식, COPD 및 낭성 섬유증과 같은 질환을 모델링할 수 있는 길을 열게 되었습니다.이 기술은 또한 인비트로(in vitro) 인간 시스템에서 폐 발달에 미치는 환경적 영향을 연구하는 데 도움이 됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 어린이로부터 비강 상피 세포를 배양하고 이 세포군으로부터 iPSC를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포를 다루므로, 항상 기관 및 국가 지침을 준수해야 함을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 여기서 쥐, 인간의 비강 충치의 후각 점막 조직 검사로 연구를 해왔하는 방법을 설명합니다. 이러한 biopsies은 뇌 질환의 분자 변이를 식별하거나 뇌 손상 / 질병의 동물 모델에 세포 이식을 위해 활용할 수 multipotent 성인의 줄기 세포를 분리하거나 사용할 수 있습니다.

설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

조건부 재 프로그래밍을 이용하여 인간의 소아 식도 상피 세포의 확장 결함이나 부상을 치료 및 치료 심사 분석을위한 저수지 역할을하는자가 이식을 위해 식도 구조 엔지니어링에 이용 될 수있는 셀의 환자 별 인구와 수사관을 제공합니다.

조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

직접 신경 프로그래밍 시작 체세포의 나이 유지 하는 신경 세포 생성 합니다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자 로부터 얻은 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경 세포를 생성 하는 단일 벡터 기반 방법을 설명 합니다.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

배우세요 어린이 비강 상피 세포 채취 및 배양 방법과 iPSC로의 재프로그래밍 기술을. 이 비침습적 기법은 천식 및 호흡기 질환 연구를 위한 균일한 세포 집단을 제공합니다.

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

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