뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

이 절차의 전반적인 목표는 뉴런에서 유전적으로 암호화된 비천연 아미노산을 사용하여 뉴런 단백질의 기능을 광학적으로 제어하는 것입니다. 이 방법은 공간적 시간 해상도를 가진 뇌 기능의 신경 신호 전달에 대한 특정 신경 단백질의 기여에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 신경 단백질에 적용하여 다양한 신경 과정의 광학 조절을 달성할 수 있는 잠재력이 있다는 것입니다.

40마이크로미터 나일론 메쉬를 통해 여과한 후 500마이크로리터의 성장 배지가 있는 24웰 플레이트의 커버 슬립에 해마 뉴런을 도금하여 이 절차를 시작합니다. 그 후, 섭씨 35도의 이산화탄소 5%, 공기 가습 95%의 인큐베이터에서 2-3주 동안 뉴런 배양을 배양합니다. transfection 당일, 이중 증류수에 신선한 2.5몰 염화칼슘 용액을 만들고 0.22마이크로미터 필터로 멸균 여과합니다.

다음으로, pH 7에서 새로운 2X BBS를 만들고 0.22마이크로미터 필터로 멸균 여과합니다. 그 후, 배양 배지를 500마이크로리터의 신선하고 예열된 트랜스펙션 배지로 교체하고 오래된 성장 배지를 버리지 마십시오. 배양액에 첨가하기 직전에 염화칼슘과 이중 증류수를 결합하여 튜브를 천천히 교반하여 transfection 용액을 준비합니다.

튜브를 계속 교반하고 용액에 DNA를 천천히 첨가합니다. 다음으로 2X BBS 버퍼를 드롭으로 추가합니다. 2X BBS 완충액의 준비는 인산칼슘 형질주입에서 중요한 단계이며, 새로운 DNA 구성 또는 분취를 위해 6.90에서 7.15 사이에서 2X BBS 완충액에 대한 최적의 pH를 보정하는 것이 좋습니다.

그런 다음, 즉시 30마이크로리터의 형질주입 용액을 신경세포 배양의 각 커버 슬립에 첨가합니다. 배양 접시를 몇 번 흔들어 용액을 섞고 섭씨 35도에서 45분에서 1시간 동안 배양합니다. 약 한 시간 후, 미세한 인산칼슘 침전물 층이 뉴런을 덮고 있는 것이 관찰되어야 합니다.

다음으로, transfecting media를 500마이크로리터의 예열 세척 버퍼로 교체하고 섭씨 35도에서 15-20분 동안 배양합니다. 인산 칼슘 침전물은 세척 후에 사라져야합니다. 이제 세척 버퍼를 500마이크로리터의 신선한 성장 매체로 교체하십시오.

그런 다음 성장 배지를 저장된 원본 미디어로 교체하십시오. 그런 다음 50마이크로리터의 따뜻한 성장 배지에 미리 혼합된 비천연 아미노산 Cmn을 배양액에 첨가하여 1밀리몰의 최종 농도를 얻습니다. 형질주입된 배양물을 섭씨 35도에서 12-48시간 동안 배양한 후 기록합니다.

이 절차에서는 세포 외 및 세포 내 용액을 준비합니다. 이 설정에서는 385나노미터를 방출하는 LED를 현미경 옆에 설치하여 45도 각도로 초점에서 1cm 떨어진 곳까지 빛을 전달합니다. 그런 다음 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 전극으로 패치 피펫을 당깁니다.

그 후, 인큐베이터에서 뉴런 배양 커버슬립을 꺼내 세포 외 용액에서 한 번 헹굽니다. 세포외 솔루션으로 장비를 풍부하게 사용하십시오. 그런 다음 표준 패치 클램핑 기술을 사용하여 전기생리학 현미경 플랫폼에 커버슬립을 놓습니다.

M-시트린 형광등으로 transfection된 뉴런을 패치합니다. 다음으로, 전류 클램프 방법을 사용하여 신경 세포 활동을 기록합니다. 먼저 휴지 전위를 약 음의 72밀리볼트로 조정합니다.

그런 다음 스텝 전류를 주입하여 5-15 헤르츠에서 활동 전위의 연속 발화를 유도합니다. 기록하는 동안 단일 LED 펄스를 뉴런에 전달하고 활동 전위의 변화를 모니터링합니다. 그런 다음 0.5 밀리몰 염화바륨을 수조에 첨가하여 활동 전위를 회복합니다.

급성 뇌 절편 설정에서, 신피질 영역의 M-cherry GFP 형광등으로 뉴런을 패치합니다. 그런 다음 전압 램프 방법을 사용하여 PIRK 활동을 기록합니다. 특히 음의 2.100m볼트에서 Kir2.1 특정 내부 전류를 모니터링합니다.

그런 다음 기록하는 동안 단일 LED 펄스를 뉴런에 전달하고 PIRK 단백질이 활성화되었는지 모니터링합니다. PIRK가 활성화되면 마이너스 100밀리볼트에서 내부 전류가 크게 증가합니다. 마지막에 0.5 밀리몰 염화바륨을 수조에 추가하고 PIRK가 비활성화되어 있는지 확인합니다.

여기에 표시된 것은 건강한 쥐 해마 신경 배양의 예시적인 사진입니다. 그리고 통통한 세포체와 뚜렷한 수상돌기와 축삭돌기를 나타내는 두 개의 건강한 뉴런. 이는 in vitro에서 배양된 쥐 해마 뉴런의 DIC 및 형광 이미지이며, CMN 없이 PIRK 발현을 위해 transfection되었습니다.

1밀리몰 CMN이 존재할 경우, 형질주입된 뉴런은 전장 PIRK M-시트린 단백질을 발현할 수 있어 녹색 형광을 나타낼 수 있습니다. 그리고 다음은 PIRK로 발현된 해마 뉴런의 활동을 억제하는 단일 광 펄스의 예입니다. 마우스 배아 피질 뉴런의 이러한 형광 이미지는 생체 내에서 CMN이 GFP 및 Kir2.1 단백질에 성공적으로 통합되었음을 보여줍니다.

이 그래프에서 PIRK의 광 의존적 활성화는 마우스 신피질 뉴런에서 기록된 전류에 표시됩니다. 이 기술의 의미는 특정 신경 단백질의 오작동으로 인한 뇌 질환 치료로 확장됩니다(예: 안데르센스 증후군에서 Kir2.1 돌연변이). 일단 숙달되면, 이 기술은 살아있는 뉴런에서 높은 특이성의 빛으로 신경 단백질 기능을 제어하는 데 사용할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 뉴런 단백질에 대한 사진 제어를 달성하기 위해 뉴런의 단백질에 비천연 아미노산을 통합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.