Name: 분화 및 세포 사멸 항상성을 통해 성인 유기체에있는 지방 세포의 숫자의 규제의 메커니즘 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 학습하세요 지방세포 항상성과 분화 메커니즘을 분석하고 저산소증이 세포 사멸에 미치는 영향을 조사하는 방법을. 이 기술은 비만과 제2형 당뇨병 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자는 친절에 좋아하는 원고를 교정에 대한 데이터 및 박사 B. Grötsch 제조 박사 J. 루터와 K. Ubieta 감사합니다. 이 작품은 독일 연구 협회 (BO3811 / 1-1 - 에​​미 뇌터)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Obesity and Overweight. Fact Sheet °113. WHO. , (Jan 2014) (2014).</li>
<li>Gong, Z., Muzumdar, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+function%2C+type+2+diabetes%2C+and+metabolism+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging.</a> Int J Endocrinol. , 320482(2012).</li>
<li>Deng, Y., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+as+novel+biomarkers+and+regulators+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome.</a> Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).</li>
<li>Rezaee, F., Dashty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adipose+Tissue+in+Metabolic+System+Disorders+Adipose+Tissue+is+the+Initiator+of+Metabolic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases.</a> J Diabetes Metab. , 008(2013).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+fat+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of fat expansion.</a> J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).</li>
<li>Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+adipocyte+differentiation+in+different+fat+depots%3B+implications+for+pathophysiology+or+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1(2015).</li>
<li>Farmer, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+adipocyte+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of adipocyte formation.</a> Cell Metab. 4, 263-273 (2006).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Fra-1+expression+causes+severe+lipodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy.</a> J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).</li>
<li>Luther, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fra-2%2FAP-1+controls+adipocyte+differentiation+and+survival+by+regulating+PPARgamma+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia.</a> Cell Death Differ. , (2014).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+O2+homeostasis+by+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).</li>
<li>Kim, W., Kaelin, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+protein%3A+new+insights+into+oxygen+sensing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).</li>
<li>Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensors+at+the+crossroad+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensors at the crossroad of metabolism.</a> Cell Metab. 9, 11-22 (2009).</li>
<li>Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+ameliorates+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction.</a> Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).</li>
<li>Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipogenesis+and+lipolysis+in+the+mouse+upon+selective+ablation+of+the+retinoid+X+receptor+alpha+mediated+by+a+tamoxifen-inducible+chimeric+Cre+recombinase+%28Cre-ERT2%29+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).</li>
<li>Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+hormones+determine+sensitivity+to+central+leptin+and+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin.</a> Diabetes. 55, 978-987 (2006).</li>
<li>Haluzik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+%28C57BL%2F6J+versus+FVB%2FN%29+strongly+influences+the+severity+of+diabetes+and+insulin+resistance+in+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Paraffin Processing of Tissue. Protocolsonline. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Planat-Benard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+human+adipose+lineage+cells+toward+endothelial+cells%3A+physiological+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives.</a> Circulation. 109, 656-663 (2004).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).</li>
<li>Trajcevski, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+lipid+oxidation+and+maintenance+of+muscle+insulin+sensitivity+despite+glucose+intolerance+in+a+diet-induced+obesity+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model.</a> PLoS One. 8, 71747(2013).</li>
<li>Montgomery, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain-dependent+variation+in+obesity+and+glucose+homeostasis+in+response+to+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding.</a> Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).</li>
<li>de Queiroz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+driving+retroperitoneal+adipocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+response+to+a+high-sugar+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet.</a> Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+adipose+tissue+hypoxia+in+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance.</a> Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+corticotropin-releasing+hormone+receptor+2+signalling+pathway+partly+mediates+hypoxia-induced+increases+in+lipolysis+via+the+cAMP-protein+kinase+A+signalling+pathway+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue.</a> Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).</li>
<li>Bozec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+size+is+controlled+by+Fra-2+through+LIF%2FLIF-receptor+signalling+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia.</a> Nature. 454, 221-225 (2008).</li>
<li>Varia, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimonidazole%3A+a+novel+hypoxia+marker+for+complementary+study+of+tumor+hypoxia+and+cell+proliferation+in+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma.</a> Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).</li>
<li>Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+protein+coordinates+dynamic+assembly+of+HIF-1alpha-PHD-VHL+to+regulate+HIF-1alpha+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability.</a> Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).</li>
<li>Tennant, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivating+HIF+prolyl+hydroxylases+under+hypoxia+results+in+metabolic+catastrophe+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death.</a> Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).</li>
<li>Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1alpha+Upregulation+due+to+Depletion+of+the+Free+Ubiquitin+Pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+medical+science%22%5BJournal%5D)">HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool.</a> Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).</li>
<li>Amelio, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+opposes+tumor+angiogenesis+by+promoting+hypoxia-inducible+factor+1alpha+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).</li>
<li>Suga, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+remodeling+under+ischemia%3A+death+of+adipocytes+and+activation+of+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells.</a> Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> J Diabetes Res. 2015, 970375(2015).</li>
<li>Keuper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inflammatory+micro-environment+promotes+human+adipocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis.</a> Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).</li>
<li>Sera, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+origin+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+hematology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell origin of adipocytes.</a> Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+from+lipid+storage+compartment+to+endocrine+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.</a> Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

지방 세포 인해 과도한 에너지 저장에 의한 지방 세포 증식 및 비대를 공개, 크기, 숫자 및 지역에 따라 표현형 특징을 통해 영양 (5). 지방산 조절 곤란 및 후속 대사 증후군 선도 이러한 이벤트는 또한, &quot;정상&quot;지방 확장이라 보존 대사, 증가 체지방량의 상태이다. 예를 들어, Kusminski 등. (21)는 대규모 지방 확대와 마우스는 그 지방의 확장이 필요 대사 증후군에 연결하고 지방 세포의 특성을 평가하기 위해 신중하게 판단 할 필요가되지 제안, 대사 건강을 유지 것으로 나타났다. 지방 조직 (AT)는 신체 대사 조절에 중추적 인 역할을한다. AT는 이상 지질 혈증, 동맥 경화증, 고 인슐린 혈증과 고혈당 3에 영향을 미칠 수있는 가장 큰 내분비 기관이다. 항상성 및 분자 m AT 평가를 조절 echanisms 대사 시스템 장애에 대한 이해를 허용 할 수 있습니다. 그러므로, 지방 세포 분화 조절 기전을 해명, 지방 세포의 크기와 지방 패드 질량은 비만 질환의 새로운 치료를 개발하는 데 도움이된다. 생체 내 및 시험 관내 방법에 사용하면, 지방 세포의 분화와 활성에 식품 및 유전자 발현에 미치는 영향의 역할을 결정할 수있다. 우리 프로토콜은 포도당 및 인슐린 대사 반응 22-24을 분석만큼 중요 의해 제안 지방 세포 분화, 증식 및 세포 자멸사의 밸런스를 결정하고, 상기 항상성을 결정한다. 발현 프로파일 차 지방 세포의 지방 생성, 지방 생성, 지방 분해, 지방산 흡수, 저산소증, 사멸 및 증식에 관여하는 유전자 분석 및 내장 AT는 지방 세포의 항상성과 가능한 장애에 대한 개관을 획득하기위한 높은 처리 방법이다.흥미 후보는 또한 웨스턴 블롯 또는 면역 조직 염색에 의한 단백질 수준에서 분석해야한다. 비대칭 시아닌 계 색소를 사용하여 실시간 PCR 시스템으로 최적의 결과를 얻기 위해 1 내지 10 ng의 범위의 cDNA의 농도는 50 내지 900 nm의 범위의 최적 프라이머 농도 비특이적 증폭을 최소화하기 위해 테스트되어야한다. 중요한 성분은 프라이머이다; 각 실행에 대해, 용융 곡선은 엄격 특이성을 확인하기 위해 프라이머 이량 체의 형성을 배제하도록 제어 될 필요가있다. 따라서, 대신의 cDNA의 H 2 O와 부정적인 컨트롤을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 상용 가능한 비대칭 시아닌 염료 (예 ROX 같이) 수동적 기준 염료를 함유하는 내부 기준 신호를 제공하도록 마스터 믹스로 제공된다. cDNA를 신호는 잘 - 투 - 잘 신호 변동을 해결하기 위해 ROX 신호를 데이터 분석 중에 정규화. 다른 점은 끈적 거리는을 설정하기 위해 고려되어야D qPCR의 시스템은 하우스 키핑 유전자의 선택입니다. 각 조건의 경우, 여러 하우스 키핑 유전자는, 사용 예를 들어, HPRT, β - 굴지, GAPDH, β-2-MG 또는 HSP90. 저산소 조건에 의해 안정화 HIF 단백질 마스터뿐만 아니라 지방 세포 생존을 결정 레귤레이터뿐만 아니라, 글루코스, 인슐린 내성 및 지질 대사 11,25,26 같은 대사 변화이다. 지방 패드에서 저산소 영역을 확인하기 위해, HIF-1α는 면역 조직 화학 염색에 의한 부분 AT에서 결정된다. HIF 단백질을 빠르게 정상 산소의 조건 하에서 5 내지 10 분 이내에 분해되기 때문에, 절차 및 조직 학적 분석을 위해 지방 패드의 단단히 고정 대기 시간을 방지하기 위해 제어되어야한다. 따라서,뿐만 아니라 HIF 염색 통해 저산소증을 보장하기 pimonidazole AT는 저산소 영역을 결정하는데 사용된다. 이미 뼈 (27)에 도시 된 바와 같이 Pimonidazole는 조직에 배포 할 수 있습니다효과적으로 더 특이 항체 (28)를 결합하여 조직 학적 섹션에서 검출 특히 저산소 세포 티올 - 함유 단백질에 결합함으로써 저산소 영역을 표시한다. 그러나, 다른 마커 및 방법은 저산소증 경로를 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 수산화 프롤린을 인식 프로 테아 HIF을 중재 폴리 - 유비퀴틴 유도 normoxia 아래 프롤린 잔기의 히드 록 실화를 유도 프 롤릴 수산화 효소 (PHD) 효소뿐만 아니라 폰 Hippel-Lindau의 (VHL) 단백질의 참여 저하는 통로 29, 30의 전체 개요를 분석 할 필요가있다. 또한, 유비쿼터스 HIFs의 검출은도 31, 32을 변경할 수있는 단백질 분해 안정성을 결정한다. 또한, TUNEL 염색에 의한 사료된다하여 증식과 세포 자멸사는 AT 조직 학적 섹션의 염색을 통해 생체 내에서 결정된다. 사료된다 및에 의해 확산의 정량화유동 세포 계측법 분석을 통해 TUNEL 또는 아 넥신 V 염색에 의해 poptosis도 33을 수행한다. 증식 물론 이러한 사료된다 양성 세포 측정에 의해 해결되지 않는 지방 세포의 세포주기의 분석과 같은 다른 기법에 의해 측정 될 수있다. FACS는 아폽토시스 세포 사멸 과정 대 괴사의 수준을 결정 넥신 V 및 TOP-PR-3 분석하여 또한 TUNEL 의한 세포 사멸 연구는 완성 될 수있다. 아폽토시스 AT 항상성에 중요한 세포 사멸의 과정을위한 기본적인 과정이다. 사실, 지방 세포의 세포 사멸의 조절 곤란 비만에 기여하는 과정에서 이전에 연루 및 34 지방 이상증되었습니다. 또한, 2011 년, Keuper 등의 알. 지방 세포의 세포 사멸에 지방 조직의 염증을 연결. 그들은 식세포 차례로 식세포를 유치 전구 지방 세포와 지방 세포에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 대 식세포의 모집은 염증, 어느 제어 방식을 가속포도당과 인슐린 내성 35 대사 증후군에 ibutes. 그러나, 지방 세포 사멸이 제대로 공부 현상에 의한 지방 세포의 세포 사멸 체중 감소로 이어질 수 있다는 가설에도 불구하고, 아직도있다. 본 프로토콜은 생체 내에서 증식, 세포 사멸 및 저산소증으로 다른 현상을 연구하기 위해 면역 조직 화학적 방법을 사용합니다. 따라서, 조직은 중요한 단계 4 % 포름 알데히드로 고정 하였다. 확장 된 조직 정착 시간은 상기 항체에 대한 비 액세스 될 에피토프, 변화하도록 이끈다. 반대로, 짧은 정착 시간은 시약 에피토프의 감도를 증가시킨다. 고정의 권장 최적의 시간은 24 시간입니다. 또한, 상기 부분의 두께는 그 에피토프에 결합하는 항체에 영향을 미친다; 최적의 두께는 μm의 2 내지 5이다. 5 μm의보다 두꺼운 부분은 증가 된 결합 부위에 거짓 긍정적 인 결과를 줄 것이다. 대조적으로, s의ections보다 얇은 2 μm의 적은 결합 부위를 포함하고 긍정적 인 부분은 잘 정의되지 않습니다. 또한, 중요한 요소는 에피토프에 결합하는 특정의 품질에 영향을주는 항체 자체, 배양 시간, 농도, 심지어 온도이다. 따라서, 항체 농도와 배양 시간을 확인하는 각 조건에 대한 필요가있다. 연구를 완료하려면, 우리는 다른 치료, 자극 또는 공동 문화에 의해 확장 될 수있는 시험 관내 지방 세포 분화 프로토콜을 제공합니다. 시험 관내 지방 세포 배양에 사용함으로써, 지방 세포 분화 및 기능에 결함을 판별 가능하다. 모든 기본 세포와 같이 ADSCs 및 지방 세포의 건강 행동과 외관이 매우 중요하다, 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수있다. 입도, 세포질 vacuolations 및 / 또는 박리 차의 부적절한 매체, 미생물 오염이나 노화를 나타내는 악화의 징후이다세포. 다른 프로토콜 (36)에 의해 기술 된 바와 같이, 골수로부터 단리 된 중간 엽 줄기 세포를 사용하는 것도 가능하다 반면,이 프로토콜은 지방 패드 조직으로부터 격리 된 지방 세포를 사용한다. 최근이 지방 세포 분화의 초기 단계에서 발생하는 추가 차별 문제를 반영 할 수있는 기질 전구 세포를 포함, 이것은 현재의 프로토콜에서 누락 될 수 있습니다. 또한 ADSCs 빠르게 (일주일 이내에 10 배 이상) 확장 될 수 있으며, 일부 유로 후의 장기 배양 ADSCs은 여전히 중간 엽 37,38 능성을 유지한다. ADSCs을 사용하는 다른 이점은 ADSCs 간단하고 최소 침습 방법으로 지방 흡입에 의해 환자로부터 채취 할 수 있기 때문에 용이 한 인간으로 전환 할 수 있다는 것이다. AT는 내분비 방식으로 여러 다른 장기에 영향을 미친다 같이, 프로토콜 adipokines로 확장되어야한다. 이러한 렙틴, 아디포넥틴, 종양 괴사 인자 α (TNF)를 같은 Adipokines,지방 세포에 의해 분비 된 인슐린 저항성 ND는 지방 대사, 에너지 항상성 및 인슐린 감수성 (39)를 제어함으로써 대사성 질환에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 따라서, 혈청 및 지방 세포의 secretome 분석이 수행되어야한다. 이러한 IL-6와 같은 AT 장애, adipokines 및 염증성 사이토 카인의 경우에, 예컨대 췌장, 간, 근육 기능 4로 장기의 조절 이상을 초래할 수있다. 전신 장기 부전을 배제하기 위하여, 동물 모델 또는 세포 배양 물은 자극 포도당 흡수를 그들의 응답을 테스트 할 수있다. 여기에서 우리는 AT 및 생체 내에서 지방 세포의 기본 상태를 분석하기위한 프로토콜을 제공하고 체외에서 지방 세포의 항상성 및 기능의 분자 메커니즘을 공개.

세계 보건기구 (WHO)에서 2014 보고서에 따르면 세계 성인 인구의 39 %가 과체중이며, 13 %가 비만 한 것이다. 가까운 미래에, 사람들이 과체중 노인 인구의 상당 부분을 포함 할 것이다. 비만과 노화의 중요한 특징은 이환율과 사망률이 관련 지방의 조절 곤란하다. Adipokines는 지방 조직 (AT)에 의해 분비되는 단백질, 비만 등 대사 증후군을 유발하고 당뇨병 (3)를 입력 할 수 있습니다. 대사 질환은 대부분 확장 4 AT의 결과 지방 세포의 지질 방울에 과도한 에너지 저장에 의해 발생합니다. 따라서,를 제어 할 기회를 찾기 위해 AT 원인과 확장의 분자 메커니즘을 결정 관심사이다. 위에 영양 두 가지 이벤트에 의해 조절된다 AT 확대로 이어진다 과도한 에너지 저장 지방 세포의 지질 소적으로, 공정또한 지방 세포 증식 5로 알려진 (지방 세포 크기 증가), 증가 된 지방 조직은 비대로 이어지는. 지방 조직은 지방 세포로 다 능성 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 분화 과정이다. 첫째, 중간 엽 줄기 세포는 확약 단계에서 전구 지방 세포로 발전. 둘째, 전구 지방 세포는 또한 성숙한 지방 세포 (6)의 기능적 특징을 취득 구별. 여러 전사 인자는 징크 핑거 단백질 423 (Zfp423) 초기 B 세포 인자 1 (Ebf1) 등의 지방 전구 세포 검지 마스터 레귤레이터로 확인되었다. Zfp423 초기 노력을 유도하는 반면, Ebf1은 지방 세포의 전구 세포 (6)의 생성이 필요합니다. 말단 분화 단단히 페 록시 좀 증식 제 - 활성화 수용체 γ (PPARγ)의 필수 전사 인자 칠해진다 전사 캐스케이드에 의해 제어된다. 또한 키 전사 요소 (C CCAAT / 증강 인자 결합 단백질이다/ EBP) 가족 (즉, C / EBPα, C / EBPβ 및 C / EBPδ), 크 룹펠 같은 요인 (KLFs), 캠프 응답 요소 바인딩 단백질 (CREB) 및 초기 성장 응답 20 (Krox20) 6. 최근에는 활성제 단백질 1 (AP-1) 패밀리는 지방 세포 분화 과정에 관여 8,9 것이 밝혀졌다. 는 AP-1 패밀리는에 Fos 이세 및 / 또는 활성화하는 전사 인자 (ATF) 부재로 이루어진 이량 체 단백질 복합체에 의해 형성된다. FOS 관련 항원 1 및 2 (FRA-1 및 프라-2) 지방 세포의 분화를 조절할 수있다. 훌라-1 훌라-2 제어 지방 세포 회전율 9 반면, / EBPα 8 C를 억제함으로써 지방 세포 분화를 저해. 훌라-2는 이에뿐만 아니라 지방 세포 분화시 PPARγ2 식을 억압하여 지방 세포의 수를 감소뿐만 아니라, 저산소증 유도 인자 (HIFs) 식의 직접적인 억제를 통해 지방 세포의 세포 사멸을 감소시킨다. HIF 제품군은 HETE입니다HIF-1α, HIF-2α와 HIF-1β로 구성 rodimeric 전사 인자 복합체. 이종는 산소에 민감한 HIF-α 단백질 (HIF-1α 또는 HIF-2α)와 산소를 구분하지 HIF-1β 서브 유닛 (10)으로 구성되어 있습니다. normoxia 동안, HIF-α 단백질은 폴리 ubiquitinylated하고 마지막으로 프로 테아 좀 (11)에 의해 분해된다. 확장시 AT에서 발생하는 저산소 조건에서 HIF-α 단백질은 더 이상 수산화 없습니다. 그들은 따라서 구조적으로 표현 HIF-1β와 안정 및 양식 이합체된다. HIF 응답 소자를 제어하는 유전자의 전사 활성은 혈관 형성, 대사 및 염증 (12)의 조절에 관여한다. 실제로, HIF-1α는 글루코스 내성을 유도하는 에너지 비용 및 지질의 사용 억제 주변뿐만 아니라, 렙틴에 의해 레벨과 HFD 유도 간 지방증 (13)을 증가시킴으로써 부전 AT 촉진한다. 또한, HIF-1α는 adipocy을 조절테 세포 사멸의 생체 내 및 생체 외 9인치 본 프로토콜은 성인 쥐의 지방 세포 항상성의 분자 특성을 해명하는 상태에서 공부에 대한 방법을 설명합니다. 그것은 세포 사멸, 증식 및 생체 내 및 생체 외 지방 세포의 분화가 저산소증에 의해 조절 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이를 위해, 우리는 Fabp4-CreERT 마우스 (9)와 훌라-2 floxed 대립 유전자를 운반하는 쥐를 교차에 의해 생성 된 훌라-2의 지방 세포 특정 삭제와 마우스를 사용합니다. Fabp4-Cre 호텔 ERT 마우스를 사용하여 결실은 지방 세포 타목시펜 주입 (14)에 의한 비와 유도된다. 성인 모델의 경우 타목시펜의 내부 복강 주사 6 주 세의 나이에 시작하는 연속 5 일 동안 수행된다. 분석이 완료되기 전에 따라서, 마우스 6 주 동안 정상식이 또는 고지방식이 요법을 실시한다. 본 연구에 사용 된 마우스는 남성 같은 에스트로겐과 같은 여성 호르몬을 피하기 위해 C57BL6 배경 근거한신체 지방 분포 (15)를 규제하는 도시. 다른 유전 적 배경을 사용하여 인해 지질 관리 (16)의 변형과 관련된 차이로 대사 표현형을 변경할 수 있습니다. 이 프로토콜은 조직학을 사용하여 저산소증에서 AT를 분석하는 방법과 면역 조직 화학 및 프로파일 링 분석 유전자를 사용하여 생체 내에서 지방 세포의 세포 사멸, 증식 및 분화를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저산소증에 노출에 의해 변경 주 지방 세포 분화 및 세포 사멸을 분석하는 방법을 보여주는 시험 관내 실험에 의해 완성된다.

<table><tbody><tr><td>RNAlater 용액</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>RNA 안정화 용액</td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>4472908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정제 마우스 Anti-Human Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>Clone B56 (RUO</td></tr><tr><td>)정제 마우스 Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO)</td><td>550609</td><td>증식 마커</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>BioLegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb</td><td>세포 신호</td><td>9664S</td><td>클론 5A1E</td></tr><tr><td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td><td>9664</td><td>Apoptosis marker</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000 시약&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 요오드</td><td>T3605</td><td>핵 카운터스테인, 단량체 시아닌 핵산 염색, 여기&프라슬; 방출 : 642 &frasl; 661 nm</td><td></td></tr><tr><td>메이어' s hemalum</td><td>Merck</td><td>109249</td><td>hematoxylin</td></tr><tr><td>pegGOLD TriFast</td><td>Peqlab</td><td>30-2030</td><td>TRIzol, guanidine isothiocyanate 및 phenol Percellys의 단상 솔루션</td></tr><tr><td>세라믹 키트 1.4&nbsp; mm</td><td>91-PCS-CK14</td><td>튜브 함유 세라믹 비드 (1.4 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>91-PCS24</td><td>homogenizer</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alpha 항체</td><td>Pierce</td><td>PA1-16601</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alpha 항체, 16H4L13</td><td>700505</td><td>저산소증 마커</td><td></td></tr><tr><td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein</td><td>Roche</td><td>11 684 795 001</td><td>TdT 매개 dUTP-비오틴 닉 말단 라벨링(TUNEL)&nbsp;</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>318906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 용액 (1&nbsp; 단위/&마이크로; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 안티 마우스 IgG(H+L)</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 안티 마우스 IgG(H+L)</td><td>BA-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC 키트</td><td>PK-4000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD DAPI</td><td>H-1200</td><td></td><td></td> 장착 매체</tr></tbody></table>

분화 및 세포 사멸 항상성을 통해 성인 유기체에있는 지방 세포의 숫자의 규제의 메커니즘

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

지방 조직(AT)이 내분비 기관이라는 점을 고려하면 전신 대사에 영향을 줄 수 있습니다. 과도한 에너지 저장은 지방 세포의 조절 장애를 유발하여 아디포카인의 비정상적인 분비를 유도하여 비만, 이상지질혈증, 고혈당증, 고인슐린혈증, 인슐린 저항성 및 제2형 당뇨병과 같은 대사 증후군을 유발합니다. 따라서 지방 세포 조절 장애의 이면에 있는 분자 메커니즘을 조사하는 것은 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 성체 마우스의 지방 세포 사멸과 상관관계가 있는 AT의 저산소 상태에 의해 영향을 받는 분자 메커니즘을 평가하는 방법을 설명합니다. 본 프로토콜은 유전자 발현 프로파일링을 통해 in vivo에서 AT를 분석하는 방법과 저산소증 노출 시 지방세포 분화, 증식 및 세포사멸에 대한 조직학적 분석을 통해 저산소성 세포 또는 HIF-1α 단백질의 염색을 통해 확인하는 방법을 설명합니다. 또한, 지방 세포 분화와 다양한 자극에 대한 반응에 대한 체외 분석은 대사 증후군을 유발할 수 있는 지방 세포 기능 장애의 배후에 있는 분자 경로의 특성화를 완료합니다.

우리의 예를 사용하여 생체 내 및 생체 외 지방 세포의 항상성을 결정하는 방법을 보여 훌라을-2 FL / FL 야생형 한배 새끼에 비해 Fabp4-CreERT 마우스. 우리의 프로토콜은 증가 된 지방 세포의 세포 사멸에 의해 지시 된 바와 같이 저산소증에 의해 증가 HIF의 발현이 지방 세포의 기능 장애와 관련되는 방법을 정의합니다. 고지방 다이어트에 증가 된 지방 세포의 크기와 영역 (HFD) 처리 된 마우스 과잉 영양, 다른 요인들, 지질 방울에 과도한 에너지 저장에 의한 지방 세포의 비대, 발생합니다. 지방 세포의 크기와 영역은 비대의 지표이다. 정상에서 지방 패드의 섹션 (ND;도 6a)와 높은 지방 다이어트 (HFD도 6B) 육주 후 지방 세포의 크기와 지역의 마우스뿐만 아니라 정량화 명확하게 표시 지방 세포의 비대HFD 처리 된 마우스 (도 6c 및 d) 증가 지방 세포의 크기에 의해 표시된다 HFD의 S. 성인의 지방 조직 (AT)에서 증가 저산소증 프라 -2- FL / FL-Fabp4 CreERT 마우스 증가 HIF-1α의 레벨 및 지방 세포 자멸사에 이르게 AT에서 저산소증의 생체 상태를 확인하려면 훌라-2 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 12 주 세의 나이에 훌라-2 삭제 후 육주 분석 야생형 한배 새끼와 비교된다. Pimonidazole 복강 효과적인 저산소증 마커와 마우스에 투여; 그 독성 및 AT에 분배 할 수있다. 생체 내에서 AT에서 저산소 지방 세포는 면역 항체 염색 (도 7a)에 의해 정의된다. 또한, 쥐에서의 증가 된 AT 저산소 상태가 증가 HIF-1α 긍정적 ADIP 수반HIF-1α 발현 및 대상 유전자 (9)의 정량화에 의해 확인 된 면역 염색도 7b)로 나타낸 바와 같이 ocytes. 또한, 훌라-2에서 AT 섹션의 TUNEL 염색 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 및 제어 한배 새끼 (그림 7C) 지방 세포의 세포 사멸이 저산소증과 HIF-1α 식의 존재와 상관 관계가 증가 보여줍니다. 저산소증에 의한 지방 세포의 세포 사멸을 통해 차 지방 세포에서 HIF-1α 발현을 증가 다른 20 바와 같이 시험 관내 지방 세포 사멸을 분석하기 위해 피하 지방 패드에서 생성 된 지방 세포를 사용한다. 예상대로, 지방 세포에서 HIF-1α 발현은 저산소증 (그림 8a)의 24 시간 후에 증가한다. 상기 HIF-1α 활동 HIF 표적 RNA의 수준을 분석이러한 iNOS의 (유도 성 산화 질소 합성 효소)와 같은 유전자 qPCR에 의해 정량화된다.도 8b는 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현 증가는 iNOS의 mRNA 발현 증가에 이르게 것을 보여줍니다. 우리가 이미 지방 세포에서 HIF-1α 발현을 증가 지방 세포의 세포 사멸과 관련이 증가 생체 내 (그림 8)에 도시 한 이후, 세포 사멸은 저산소 조건에서 넥신 V 염색으로 체외 문화에서 계량입니다. 생체 데이터 (도 7)과 일치하는, 증가 된 HIF-1α의 레벨은 저산소 조건에 의해 유도되는 증가 된 지방 세포가 아폽토시스 (도 8b)를 수반한다. 또한, 그 저산소에 의한 세포 사멸을 증명하는 HIF-의존; HIF-1α 또는 HIF-2α는 야생형 또는 훌라-2 결핍 생쥐에서 파생 된 지방 세포에 RNA 간섭에 의해 침묵된다. 넥신 같이 증가 된 지방 세포 사멸은 HIF-1α 또는 HIF-2α 입을 의해 복원<html> 저산소증 센서 HIF-α는 지방 세포 사멸을 조절하는 것을 증명도 8b에 V 염색. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> 그림 6 : 높은 지방 다이어트 (HFD) 쥐의 지방 세포의 크기와 면적 증가 정상적인 다이어트 (ND)가 공급 남성 야생형 마우스의 perigonadal 지방 패드에서 섹션 (A, B) H &amp; E 염색 (a) 또는 높은. 지방질 다이어트 (HFD) (b)에 육주합니다. 바는 500 μm의를 나타냅니다. (c, d) (b) 6- 주 ND (a) 또는 HFD가 공급 야생형 마우스의 perigonadal 지방 패드에서 지방 세포의 크기 (C) 및 영역 (D)의 정량화. N = 10 데이터는 SEM ±로 평균 값을 나타낸다. 통계 분석은 Student&#39;s의 t -test를 사용하여 수행 하였다. *** p &lt;0.0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> 훌라-2 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 성인의 지방 세포에서 증가 HIF-1α 수준 및 세포 사멸 그림 7. 저산소증 (a)와 HIF-1α 남성 훌라-2 FL / FL Fabp4-creERT 마우스 남성 제어 한배 새끼 육주 후 타목시펜 주입의 AT (b)에서 염색. 배율 20 배는 40X를 삽입합니다. 검은 색 화살표는 저산소 영역과 HIF-1α 양성 세포를 나타냅니다. (c)에서 TUNEL 염색 훌라-2 FL / FL 타목시펜 주입 후 6 주에 Fabp4-CreERT 마우스 및 제어 한배 새끼. 배율 20 배는 40X를 삽입합니다. 검은 색 화살표는 TUNEL 양성 세포를 나타냅니다. 이 수치는 루터 등에서 수정되었습니다알. 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> 도 8. 저산소증에 의한 차 지방 세포에서 증가 HIF-1α 발현 및 지방 세포 자멸사 저산소 챔버에 넣고 차 지방 세포에서 HIF-1α와 HIFs 대상 iNOS의 mRNA 수준의 (a) 실시간 PCR 분석은 지정된 시점에서 분석 하였다. 분리 주 지방 세포에서 넥신 V FACS 염색에 의한 세포 사멸의 (b)에 정량 훌라-2 FL / 플라이 쉬 제어 또는 HIF-1α 또는 HIF-2α에 대한 쉬 플라스미드로 형질과 저산소증 아래에 배치 Fabp4-CreERT 마우스 또는 야생 형 제어 24 시간 동안 (1 % O 2). 이 수치는 루터 등의 알에서 수정되었습니다. <sup&gt; 9. 데이터는 SD 통계 분석은 학생의 T- 테스트를 사용하여 수행 하였다 ±로 평균 값을 나타낸다. * P &lt;0.05 ** P &lt;0.01 상당한으로 인정 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

지방 조직(AT)은 전신 항상성에 영향을 미칠 수 있으므로 지방 세포 분화 및 기능의 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 우리는 유도 지방 세포 자멸사에 대한 모델로서 지방 세포 항상성, 분화 및 저산소증 노출을 분석하여 이러한 과정에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위한 프로토콜을 제공합니다.

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

이 실험들의 전반적인 목표는 지방세포의 항상성과 분화를 분석하고, 저산소증 및 지방세포 사멸의 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이 방법은 비만 및 제2형 당뇨병과 같은 대사 분야의 주요 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기초적이고 저렴한 절차라는 것이며, 이를 통해 귀하의 특정 연구 모델에서 지방세포 생물학 분석이 가능하다는 점입니다.제 실험실의 박사 과정 학생인 Nicole Hannemann이 절차를 시연하겠습니다. 생체 내 저산소증을 정량화하려면 먼저 마우스의 체중을 측정하십시오. 그런 다음 pimonidazole hydrochloride 고형물을 체중 kg당 60 mg의 양으로 복강 내 주입합니다.45분 후 동물의 사지를 고정하고 복강을 절개합니다. 복강 내에서 좌우 성선 주변 지방 패드를 수확하고 패드에서 성선 조직을 제거합니다. 그 후 조직의 무게를 측정하여 체중 대비 지방 패드 비율(g)을 결정합니다.지방세포 항상성의 조직학적 분석을 수행하려면, 먼저 지방 조직 절편을 자일렌으로 5분씩 3회 세척하여 탈파라핀화하고, 이어서 100% ethanol로 2분씩 2회, 96% ethanol로 2분씩 2회 재수화합니다. 그런 다음 절편을 증류수로 5분 동안 세척하고 실온에서 hematoxylin으로 10분 동안 염색합니다. 배양이 끝나면 절편을 물로 5분 더 세척한 후, eosin 용액으로 30초 동안 염색합니다.방금 시연한 것과 같이 절편을 세척하십시오. 그런 다음 96% ethanol과 100% ethanol에서 각각 2분씩 두 번씩 절편을 탈수시킵니다. 이어서 xylene에서 5분씩 세 번 배양하십시오.그 다음, 무수 봉입제로 절편을 봉입합니다. 조직의 면역조직화학 분석을 위해 앞서 시연한 대로 절편의 파라핀을 제거한 후, 37 °C에서 proteinase K 작업 용액으로 30분간 소화시킵니다. 소화 과정이 끝나면 조직을 PBS로 세척하고, PBS에 희석한 3% hydrogen peroxide로 10분 동안 내인성 peroxidase를 차단합니다.PBS로 5분간 두 번 세척한 후, PBS에 10% serum을 희석하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다. 그 다음, 조직과 표적 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. 다음 날 아침, PBS로 5분간 세 차례 세척하여 절편을 헹굽니다.그런 다음 조직을 적절한 비오틴화 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 라벨링 기간의 마지막 30분 동안, 절편당 50 µL의 아비딘 용액과 50 µL의 비오틴화 peroxidase H를 실온에서 30분 동안 평형화합니다. 이후 절편을 PBS로 5분씩 2회 세척하고, 조직을 100 µL의 아비딘 비오틴 ABC complex로 실온에서 처리합니다.45분 후 섹션을 PBS로 2회 세척하고, 염색 강도가 적절한 수준에 도달할 때까지 조직을 peroxidase 기질 용액에서 반응시킵니다. 이제 섹션을 증류수로 5분 동안 세척하고, 실온에서 10분 동안 hematoxylin으로 세포를 대조 염색합니다. 대조 염색 후 조직을 다시 물로 세척합니다.그 다음 절편을 탈수시키고 무수 봉입제를 사용하여 커버글라스로 샘플을 봉입합니다. 이후 명시야 현미경으로 절편을 평가할 수 있습니다. 성체 수컷 마우스의 뒷다리 상단, 허리 및 옆구리 부분에서 피부를 분리하기 시작하며, 피부를 제거하면서 핀으로 고정합니다.그 다음, 지방세포 배양을 위해 뒷다리 기부에 위치한 서혜 림프절 주변의 후방 피하 지방 조직을 채취합니다. 지방 분화 분석을 위해, 분화된 지방 세포 배양물을 흄 후드 아래에 두고 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. 이어서 10% formalyn 2 mL로 세포를 60분 동안 고정합니다.고정이 끝나면 세포를 물로 세척하고, 60% isopropanol 2 mL를 배양물에 처리하여 5분 동안 둡니다. 이어서 oil red O 작업 용액 2 mL를 처리합니다. 5분 후, 물이 맑아질 때까지 세포를 수돗물로 헹굽니다. 그리고 앞서 시연한 것과 같이 hematoxylin으로 세포를 대조 염색합니다.그 다음 위상차 현미경의 100배 배율에서 세포를 평가할 수 있습니다. 지방세포의 지질은 빨간색으로 나타나고 핵은 파란색으로 나타납니다. 여기 일반 식이 및 고지방 식이 쥐의 지방 패드 단면이 제시되어 있습니다.지방세포의 크기와 면적을 정량화한 결과, 고지방 식이 처리 동물의 지방세포 크기가 증가한 것으로 보아 6주간의 고지방 식이 후 지방세포 비대증이 나타났음을 명확히 확인할 수 있습니다. 저산소성 마커인 pimonidazole로 처리한 생쥐의 경우, 지방 조직의 저산소 상태가 증가함에 따라 HIF1 alpha 양성 지방세포 또한 증가하였습니다. 또한, 녹아웃 및 대조군 litter mate의 지방 조직 절편을 TUNEL 염색한 결과, 지방세포의 세포사멸 증가는 저산소 상태 및 저산소 유도 인자 1 alpha(hypoxic inducible factor 1 alpha) 발현과 상관관계가 있음이 입증되었습니다.예상대로 지방세포 내 Hif1a 발현은 24시간의 저산소 상태 이후 증가합니다. 또한, QPCR을 통한 Hif 표적 유전자의 정량 분석 결과, 저산소 조건에서의 Hif1a 발현 증가가 Inos mRNA 발현의 증가로 이어진다는 것을 보여줍니다. 그러나 RNA 간섭을 통해 Hif1 또는 2 alpha를 억제하면 저산소 조건에서 지방세포의 세포사멸이 방지되며, 이는 지방세포 세포사멸에서 Hif alpha의 저산소 감지 조절 역할을 확인시켜 줍니다.이러한 절차를 거친 후, 포도당 및 인슐린 저항성 결정과 같은 모든 분석을 수행하여 대사 변화 및 지방세포 기능 장애에 관한 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 지방세포 세포사멸 및 저산소증 연구의 조직학적 분석 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

mechanism-regulation-adipocyte-numbers-adult-organisms-through

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마우스의 흰색 지방 조직으로부터 격리 기본 흰색 preadipocytes는 베이지 색 / brite 세포로 구분 할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 백색 지방의 "브라우닝"의 분자 규정을 연구 할 수있는 신뢰할 수있는 셀룰러 모델 시스템입니다.

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

막 성숙한 지방세포 골재 배양(MAAC)은 성숙한 인간 지방세포배양하는 새로운 방법이다. 여기서 우리는 인간의 지방에서 지방세포를 분리하는 방법과 MAAC를 설정하는 방법을 자세히 설명합니다.

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 순수한 지방세포 집단의 생성을 허용합니다. 레티노산은 iPSC를 지방세포 생성에 사용되는 중간엽 줄기세포(MSC)로 분화시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 나일 레드 염색을 기반으로 한 분류 접근법을 사용하여 순수한 지방 세포를 얻습니다.

지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.

1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다.  이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

학습하세요 지방세포 항상성과 분화 메커니즘을 분석하고 저산소증이 세포 사멸에 미치는 영향을 조사하는 방법을. 이 기술은 비만과 제2형 당뇨병 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

분화 및 세포 사멸 항상성을 통해 성인 유기체에있는 지방 세포의 숫자의 규제의 메커니즘

더 많은 동영상 탐색