분화 및 세포 사멸 항상성을 통해 성인 유기체에있는 지방 세포의 숫자의 규제의 메커니즘

이 실험의 전반적인 목표는 지방 세포 항상성 및 분화를 분석하고 저산소증 및 지방 세포 자멸사의 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이 방법은 비만 및 제2형 당뇨병과 같은 대사 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기본적이고 저렴한 절차라는 것입니다.

제 연구실의 박사 과정 학생인 Nicole Hannemann이 절차를 시연할 것입니다. in vivo에서 저산소증을 정량화하려면 먼저 마우스의 체중을 측정하십시오. 그런 다음 체중 kg당 60mg의 고체 피모니다졸 하이로클로라이드를 복강내로 주사합니다.

45분 후 동물의 팔다리를 고정하고 복막강을 엽니다. 구멍에서 왼쪽과 오른쪽 perigonadal 지방 패드를 수확하고 패드에서 생식선 조직을 제거합니다. 그런 다음 조직의 무게를 측정하여 체중당 지방 패드 비율을 그램 단위로 결정합니다.

지방 세포 항상성의 조직학적 분석을 수행하려면 먼저 자일렌으로 5분 세척 3회, 100% 에탄올로 2회 2분 재수화, 96% 에탄올로 2회 2분 재수화로 지방 조직 절편을 파라핀화합니다. 그런 다음 증류수로 섹션을 5분 동안 세척하고 실온에서 10분 동안 헤마톡실린으로 염색합니다. 배양이 끝나면 섹션을 물로 5분 더 씻은 다음 에오신 용액으로 30초 동안 염색합니다.

방금 시연한 대로 섹션을 씻으십시오. 그런 다음 96% 에탄올과 100% 에탄올이 함유된 부분을 각각 2분 동안 두 번씩 탈수합니다. 그 후 5분 동안 자일렌을 3번 배양합니다.

그런 다음 무수 장착제로 섹션을 장착합니다. 조직의 면역조직화학적 분석을 위해 방금 설명한 대로 절편을 탈파라핀화한 다음 섭씨 37도에서 proteinase K 작용 용액으로 30분 동안 분해합니다. 소화가 끝나면 PBS의 조직을 헹구고 PBS의 3% 과산화수소로 내인성 과산화효소를 10분 동안 차단합니다.

PBS에서 5분 동안 두 번 세척한 후 PBS에서 10%혈청으로 결합된 비특이적 항체를 차단합니다. 그런 다음 관심 조직과 항체를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 아침, PBS에서 5분 동안 세 번 세척하여 섹션을 헹굽니다.

그런 다음 실온에서 1시간 동안 적절한 비오틴화된 2차 항체로 조직을 배양합니다. 2차 항체 라벨링 기간의 마지막 30분 동안 실온에서 30분 동안 섹션당 50마이크로리터의 아비딘 용액을 50마이크로리터의 비오틴화 과산화효소 H와 평형화합니다. 그런 다음 PBS에서 각각 5분씩 절편을 두 번씩 세척하고 실온에서 100마이크로리터의 아비딘 비오틴 ABC 복합체로 조직을 처리합니다.

45분 후 PBS에서 절편을 두 번 세척하고 염색이 적절한 강도 수준에 도달할 때까지 과산화효소 기질 용액에서 조직을 배양합니다. 이제 증류수로 5분 동안 섹션을 세척하고 실온에서 10분 동안 헤마톡실린으로 세포를 카운터 염색합니다. 카운터 염색 후 티슈를 다시 물로 씻으십시오.

그런 다음 섹션을 탈수하고 무수 장착제를 사용하여 커버 슬립으로 샘플을 장착합니다. 그런 다음 명시야 현미경으로 섹션을 평가할 수 있습니다. 성인 수컷 마우스의 피부를 다리 위쪽, 허리 및 옆구리에서 분리하여 피부를 제거할 때 고정하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 지방 세포의 배양을 위해 뒷다리 기저부에 위치한 서혜부 림프절을 둘러싼 후방 피하 지방 조직을 채취합니다. 지방생성 분화를 분석하려면 분화된 지방 세포 배양액을 흄 후드 아래에 놓고 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. 다음으로 10%포르말린 2mL에 60분 동안 세포를 고정합니다.

고정이 끝나면 세포를 물로 씻고 2 밀리리터의 60 % 이소프로판올로 5 분 동안 배양물을 처리 한 다음 2 밀리리터의 오일 레드 O 작업 용액을 투여합니다. 5분 후 물이 맑아질 때까지 수돗물로 세포를 헹굽니다. 그리고 방금 설명한 것처럼 헤마톡실린으로 세포를 대조염색합니다.

그런 다음 위상차 현미경에서 100배 배율로 세포를 평가할 수 있습니다. 지방세포의 지질은 빨간색으로 나타나고 핵은 파란색으로 나타납니다. 다음은 정상 및 고지방 다이어트 마우스의 지방 패드 섹션입니다.

지방세포의 크기와 면적을 정량화하면 고지방 다이어트를 치료한 동물에서 지방세포 크기가 증가한 것으로 입증된 바와 같이 고지방 다이어트 6주 후 지방세포 비대가 명확하게 입증됩니다. 저산소 마커 pimonidazole로 처리된 마우스에서 지방 조직의 저산소 상태 증가는 HIF1 알파 양성 지방 세포의 증가를 동반합니다. 또한, 녹아웃(knock-out) 및 대조군 깔짚 짝(control litter mates)에서 지방 단면의 터널 염색은 지방 세포 사멸(adipocyte apoptosis)의 증가가 저산소증 및 저산소성 유도 인자 1 알파 발현의 존재와 상관관계가 있음을 보여줍니다.

예상대로, 지방세포에서 Hif1a 발현은 저산소증 24시간 후에 증가합니다. 또한, QPCR에 의한 Hif 표적 유전자의 정량화는 저산소 조건에서 Hif1a의 발현 증가가 Inos mRNA 발현의 증가로 이어진다는 것을 나타냅니다. 그러나 RNA 간섭에 의한 Hif1 또는 2 알파의 침묵은 저산소 조건에서 adipocyte를 apoptosis로부터 구출하여 adipocyte apoptosis에서 Hif alpha의 저산소증 감각 조절 역할을 확인합니다.

이러한 절차에 따라 포도당 및 인슐린 저항성 측정과 같은 모든 분석을 수행하여 대사 변화 및 지방 세포 기능 장애에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 지방 세포 사멸 및 저산소증 연구의 조직학적 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.