Name: 미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여 체외 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 학습하세요 미세 유체 흐름 챔버를 이용한 재구성 혈액 기반 혈소판 수혈 및 지혈 모델링 방법을. 콜라겐 표면에서의 혈소판 기능과 저장 손상 효과를 평가하여 혈전증 및 지혈 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 인간의 샘플에 대한 연구에 대한 기관 윤리 지침을 다음과 동의서가 포함 된 모든 기증자로부터 얻은 것입니다. 여기에 설명 된 실험에 대한 승인은 앤트워프 대학 병원의 임상 시험 심사 보드에서 얻었다. 주 : 지정하지 않는 온도 표시는 항상 실온이다. 1. 준비 유량 용기 설치 <ol><li> 준비 레인, 튜브와 핀 <ol><li> 격렬하게 소용돌이 콜라겐 현탁액를 50㎍ / ㎖의 최종 농도 제공자에 의해 공급되는 등장 글루코스 용액 1/20 희석. 참고 : 우리는 주로 유형 I 피 브릴의 구성, 말 건 콜라겐을 사용합니다. 말의 콜라겐 타입 I은 종종 &quot;HORM&quot;콜라겐로하고, 과거뿐만 아니라 생물학적 분석 이유 모두 9 이러한 유형의 황금 표준이다. 인간 타입 III 콜라겐도 사용되지만, 일 수있다E는 덜 코트 브릴 및 혈소판 반응은 강하지 않다. 기타 코팅 표면은 예 폰 빌레 브란트 인자 (VWF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로 넥틴, 트롬 보스 폰딘 -1 (16) 또는 이들의 조합을 위해 사용될 수있다. </li><li> 공급자의 컨테이너에서 새로운 일회용 바이오칩을 가져 가라. 여기에 사용되는 바이오칩의 크기는 mm 3 0.4W X 0.1H의 X 20L입니다. </li><li> 피펫 출구로 칩과 마크의 한쪽 끝에서 미세 유체 바이오 칩의 레인 (들)에 0.8 μL. 차선은 1.1.1에서 제조 된 코팅 용액을 포함하는 콜라겐과 5 / 6를 충전되어 있는지 확인합니다. 기포가 없는지 확인합니다. 주 : 채널은 부분적으로 (논의를 참조)의 채널의 입구에서 콜라겐 섬유의 축적을 방지하기 위해 도포된다. </li><li> 가습 및 밀폐 용기에 4 시간 또는 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> / v)의 소 혈청은 알부민 승 (버퍼를 차단 (1.0 % 피펫 팅으로 코팅 된 채널을 차단타단 마크에서, D는 0.1 % (w / v) 글루코오스 된 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충 된 염수 (/ v)의 염화나트륨, pH 7.4의 0.9 % w (HBS)에서 입구로. 차선이 완전히 공기 방울을 방지 차단 버퍼 충전되어 있는지 확인합니다. </li><li> 동일한 길이 (12cm)에서 튜브를 잘라. 레인 당 하나를 사용하여 핀 각 튜브를 연결합니다. 예를 들어, 중복에서 실행되는 두 가지 조건을 비교 실험는 4 개의 튜브 뻗어과 4 개의 핀을 준비 할 필요합니다. </li><li> 주사기 및 26 G 바늘 또는 첨부 커넥터를 사용하여 증류수로 튜브를 씻어. </li><li> 버퍼를 차단와 튜브를 포화. 1 시간의 최소 폐쇄 및 가습 용기에 보관할 것. </li></ol></li><li> 펌프 및 매니 폴드 준비 <ol><li> 기포를 제거 펌프 린스 증류수 매니 폴드. </li><li> 출구에서의 고정 된 10 ㎕의 팁을 사용하여 바이오칩 레인 (들)에서 차단 완충액 대기음. 의 표면을 청소정밀 무료로 닦아 먼지와 변성 알코올로 바이오 칩은 지문과 먼지를 제거합니다. </li><li> 자동화 된 현미경 무대에 바이오칩을 수정합니다. 하나 이상의 레인 하나의 실행에서 동시에 사용되는 경우, 바이오칩 콘센트 8 레인 매니 스플리터를 연결한다. 참고 : 8 레인 매니 폴드 스플리터는 하드웨어의 조각 (그림 S1)는 펌프와 바이오칩에 연결. 그것은 바이오칩 또는 운영자 정의 첨부 된 소프트웨어에있을 수 레인의 조합에 사용 가능한 모든 (팔) 레인의 작업을 할 수 있습니다. </li><li> 바이오칩 입구에서 그들을 해결하기 위해 튜브에 핀을 사용합니다. HBS 가득 1.5 ML 원뿔 테스트 튜브 (핀없이) 튜브의 다른 쪽 끝을 놓습니다. 나머지는 버퍼를 차단하고 제대로 콜라겐을 준수 제거하기 위해, 모든 튜브 1 ML의 HBS는 펌프를 사용하여와의 연결 차선을 씻어. </li></ol></li></ol> 혈액 샘플 2. 준비 <ol><li> 수집 및 분리건강한 지원자에서 신선한 전혈. (17) <ol><li> 항응고제로 에틸렌 디아민 산 (EDTA)를 포함하는 진공 튜브에 혈액의 첫 번째 밀리리터를 수집하고 독점적으로 자동 혈액 분석기 전체 혈액 카운트 (CBC)이 샘플을 사용합니다. </li><li> 대피 튜브를 사용하여 적절한 항 응고 혈액의 부피를 수집합니다. 피브린을 형성하는 연구 프로토콜과는 구연산 나트륨의 일부가 아닌 경우 유동 챔버 실험 표준 항응고제 헤파린 또는 히 루딘이다. 주 : 헤파린 결과에 기재된 모든 실험에서 항응고제로 사용되었다. 주 : 혈액의 양이 수행되는 실험의 수에 의존한다. 약 3 차선 1 튜브 (7 ㎖). </li><li> 회 전자 출원중인 혈액 재구성에 튜브를 놓습니다. 참고 : 분석은 정맥 절개의 3 시간 이내에 완료해야합니다. </li><li> 혈소판 풍부 혈장을 제조 250 g에서 15 분 동안 원심 분리기 (PR피). 느슨하게 포장 된 펠릿의 교란을 방지하기 위해 원심 브레이크를 사용하지 마십시오. <ol><li> 하나 이상의 튜브가 수집 될 때, 하나의 원추형 원심 분리 튜브 내의 혈액 풀링. 참고 : 원심 분리가 PRP 수율 및 차등 셀 &quot;오염&quot;에 따라, 더 느리게 이하 긴 수행 할 수 있습니다 바람직하다. </li></ol></li><li> 제거하고 몇 혈소판 가득 적혈구를 맺는 PRP과 버피 코트를 폐기합니다. 우리의 손에 평균 μL 당 13 ± 5 × 10 (3) 포장 붉은 세포 분획의 혈소판이 (SD ± 의미, N = 12) : 참고. </li></ol></li><li> 혈액에서 재구성 <ol><li> 5 분 4 ml의 당 20 초 동안 37 ° C에서 해동 혈액형 AB (히말라야 D 음) 플라즈마. </li><li> 자동 혈액 분석기를 사용 2.1.5에서 제조 한 포장 적혈구 용적률을 결정한다. </li><li> 혈액 은행에서 혈소판 농도를 결정 혈소판 농축 그쪽 제조t 위 적혈구 분획을 재구성하는데 사용된다. </li><li> 1 mL의 샘플을 40 %의 적혈구 용적 및 250 × 10³ 혈소판 / μl를 산출 할 것이다 충전 적혈구 및 혈소판 농축 물의 양을 계산한다. 주의 : 다른 타겟 셀의 역가가 연구 프로토콜에 따라 임의로 설정할 수있다. </li><li> 전송은 클리핑 된 피펫 팁을 사용하고, 1 mL의 샘플 볼륨에 도달 할 때까지 혈소판 농축 물을 추가 새로운 튜브로 적혈구와 혈장을 포장. 주 : 플라즈마 혈전 형성 비율에 큰 영향이 있기 때문에 변수 연구에 따라, 혈장 분획 모든 재구성 된 샘플에서 동일해야한다. 예를 들어, 결과에 영향을 미칠 수있는 다른 도너 또는 다른 항응고제 촬영 동결 해동 또는 플라즈마를 반복했다. </li><li> 부드럽게 반전에 의해 재구성 된 혈액을 혼합하고 CBC를 수행합니다. </li><li> 혈소판 부분의 볼륨이 교체되는 &quot;빈&quot;제어 샘플을 준비0.9 % 물 (m / v)의 염화나트륨 같은 볼륨하여 CBC를 사용하여 재구성 된 혈액 내인성 혈소판의 농도 (즉, 비 - 혈액 은행 혈소판)을 결정한다. </li></ol></li><li> 라벨링 <ol><li> 1 mL를 정확하게 취하여 1 ㎕의 5 mM의 칼 세인 AM (5 μM 최종 농도)를 함유하는 시험관에 혈액을 재구성. 주의 : 다른 세포 염료 (14)를 사용할 수있다. </li><li> 반전에 의해 부드럽게 섞는다. </li><li> 사용하기 전에 37 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션. </li></ol></li></ol> 3. 관류 분석 <ol><li> 차선의 하단에 부착 된 콜라겐 섬유에 대물 초점. 이상적으로,이 집중 전략 위상차 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 설정을 사용합니다. 디지털 선택된 Z-위치를 해결하기 위해 실험 소프트웨어 &#39;를 선택 타일 영역에 대한 설정 현재 Z&#39;를 선택합니다. </li><li> 제 m의 실험 소프트웨어 차선 (XY)에서의 ROI를 선택실험 기간 동안 기록됩니다 icroscope. 참고 : ROI가 임의로 관류 차선 내에서 선택하는 표면적이 될 수 있습니다. 너무이 비교적 작은 경우에도, 그 영역에서 가변 유동 프로파일의 부작용을 방지하기 위해 근접 차선의 유입구들 및 배출구 혈전 형성을 분석 할 수없는 것이 바람직하다. 관심 영역의 표면적은 혈소판의 상당수를 포함하거나, 신호의 수평 있도록 혈전한다. 이 프로토콜에서, ROI는 2 ㎝ 길이 차선의 중앙에 0.62 mm 2의 결과로 동일한 크기의 세 개의 나란히 이미지의 디지털 스티치 집합체이다. </li><li> 부드럽게 반전 샘플을 혼합하고 자동화 된 단계에있는 바이오 칩에이 옆에 위치. </li><li> 재구성 된 혈액 샘플을 함유하는 시험관에 바이오칩의 입구와 연결되어 튜브를 놓는다. </li><li> 튜브를 테스트하기 위해 연결하는 채널 (필요에 따라 또는 다른 전단 응력) 50 다인 / ㎝ 2에서 펌프를 실행펌프의 소프트웨어를 사용하여 재구성 된 혈액 시료를 포함. 참고 : 다른 전단 응력 사용할 수 있습니다. </li><li> 이미지를 기록 현미경의 수집 및 실험 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 5 분 동안 매 15 초. 주의 : 다른 시계열 실험적 셋업에 따라 사용될 수있다. 참고 : 우리는 일반적으로 100 배의 배율 (10 배 대물 렌즈 10 배)를 사용하지만, 더 높은 (또는 낮은) 배율 쉽게 대체 할 수있다. </li></ol> 4. 워시 아웃 <ol><li> 차아 염소산 나트륨 (표백제) 0.5 %이어서 모든 튜브 출구에 부착 된 증류수를 사용하여 멀티 매니 폴드 또는 펌프에 연결을 세척 (v / v)의 물에 마지막으로 0.1 M의 NaOH. 유해 폐기물로 바이오 칩 입구에 고정 튜브를 폐기하십시오. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어 혈전 성장 반응 속도를 결정한다. 다음 명령은 ZEN2012에 대한 구체적인이다. <ol&gt; <li> 혈소판의 표면 적용 범위를 결정하기 위해 플러그인 이미지 분석을 엽니 다. </li><li> ㄱ 긍정적 인 신호와 상관 픽셀 강도를 정의하는 대화 형 분석 탭, 즉 부착 식 혈소판 또는 부착 혈소판의 형광 임계 값을 설정합니다. </li><li> 자동으로 선택한 임계 값 사이의 신호로 픽셀을 포함하는 &quot;객체&quot;의 (μm의 2) 별도의 표면 영역을 포함하는 스프레드 시트를 생성 할 테이블을 작성합니다. 이는 각각의 시점에 대해 수행된다. 참고 : 형광 임계 값이 선택되고 나면, 분석 소프트웨어가 자동으로 기준을 충족보기 필드에서 &#39;개체&#39;를 검색합니다. 이러한 개체는 혈전 작은 혈소판 응집 또는 단일 혈소판되며 다수의 픽셀을 커버한다. 모든 개체는 별도 스프레드 시트에 나열됩니다. </li><li> XML 형식으로 이러한 스프레드 시트를 저장하고 스프레드 시트 프로그램에서 열더 계산. </li><li> 합산하여 선택된 객체의 전체 표면적과 측정 영역 (μm의 2)의 합계 면적 결과를 나눈다. 이것은 상대적 흡착율 (%)을 수득한다. 각 시점에 대해 그렇게. </li><li> 재관류 시간 함수 이러한 표면 커버리지를 플롯 및 특정 조건의 혈전 성장 동역학을 수득 선형 회귀에 의해 기울기를 계산한다. </li></ol></li></ol>

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미세 유체 흐름 챔버 실험은 혈액을 흐르는 혈소판 기능을 조사하는 훌륭한 도구입니다 실험 상황 변화에 체외에서 지혈을 평가하는 데 사용됩니다. 가난한 실험실 간 표준화 (9)에도 불구하고, 우리는 우리의 실험실에서 실험 변동이 허용되는 것을 보여줍니다. 이것은 확실하게 주어진 연구에서 (쌍) 샘플을 비교할 수 있습니다. 이것은 혈액 은행 조건 11 혈소판 저장 해로운 결과이다 혈소판 저장 병변의 문서화 현상을 이용하여 검증 하였다. 또한, 최근의 혈액 14,15 재구성 다음 미세 유동 챔버의 PC 혈소판 기능에 대한 세 가지 가능한 병원체 불활 화 기술의 영향을 출판. 생물 물리학 및 - 화학 매개 변수를 20 다양 때 혈소판은 다르게 반응한다. 따라서, 전단 응력, 세포 수 및 세포 성분 조성기, 온도, 코팅, 항응고제 등 많은 요인은 연구 문제에 따라이 프로토콜 내에서 변형 될 ...

지혈은 제한된 시공간 상황 (1) 세포, 단백질, 이온 및 조직의 결합과 규제 활동을 필요로한다. 제어되지 않은 활동은 혈액 응고 관련 질환의 스펙트럼에 출혈이나 혈전증 및 이환율이나 사망률의 원인이됩니다. 미세 유체 흐름 챔버 실험은 시험관 내에서 지혈을 모방 도전적인 기술이다. 이 방법은 혈소판에 대한 선도적 인 역할과 지혈에 참여 프로세스의 복잡한 상호 작용의 조사를 할 수 있습니다. 혈관 손상에 따라, 혈소판은 혈액 손실을 방지하기 위해 피하 노출 매트릭스 (글리코) 단백질에 부착. 접착 후, 혈소판 활성화 및 답변 집합체 자동 - 최종적 혈소판 네트워크의 형성에 의해 안정화 피브린 및 회사의 결과에 이르게 분비 시그널링 혈전이 밀봉 권취. 대부분 혈소판 기능 검사, 체험관 달리흐름 챔버와 사항이 고려 혈류의 물리적 파라미터 따라서 멀티플 세포 및 생체에 3,4- 레올의 영향을. 흐름 챔버 실험은 접착제 매트릭스, 유동성 및 흐름 프로필, 세포 성분, 독성 물질이나 약물, 이온 강도 및 더 많은 존재 포함되는 프로세스 지혈 (하위)에 영향을 미치는 주요 매개 변수를 변화시켜 지혈과 혈전의 랜드 마크 통찰력을 생성했다. 지난 20 년에 큰 샘플 볼륨 (10 ~ 100 ml)에 요구되는 낮은 처리량 흐름 챔버 실험은 미세 유체 챔버 종종 작은 평행 판 챔버로 구성된 제어 벽 전단 조건 5에서 전체 혈액 관류를 위해 현대 기술을 포함하여 진화했다. 하드웨어 설치가 간단하고 이하 (혈액) 볼륨이 필요한 대부분 때문에 Microscaling 크게 실험이 더 접근하고 versati 렌더링, 분석 처리량을 증가르. 예를 들어, 작은 실험실 동물에서 혈액 해주기 동물을 희생하지 않고도 사용될 수있다. 유전자 변형 생쥐의 혈액 샘플 따라서 지혈을 촉진 또는 억제 키 분자의 식별과 새로운 기본적인 통찰력 6 도움을했습니다. 전문 연구소들은 여전히 소프트웨어에 의해 청사진을 할 수 석판 금형에 중합 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 7에서 예를 들어 사용자 정의 만든 흐름 챔버를 사용합니다. 그 결과 챔버는 저렴한 일회용하고 쉽게 사후 분석을 위해 분해 할 수 있습니다. 또한, 기본적으로 선박을 포함 분기점 또는 날카로운 회전의 디자인은 명령에 구축 할 수 있습니다. 이러한 장점은 표준화가 이미 흐름 챔버 실험과 기본 문제 이후의 단점이며, PDMS 사용자 정의 챔버이 도움하지 않은했다. 이 특정 문제의 위에, 코팅 (조건), 형광 프로브, 항응고제, 온도에샘플링과 분석 사이 erature와 시간이 모두 제대로 팔을 표준화하고 있습니다. 이러한 변수의 표준화에 도전하지만, 그럼에도 불구하고 실험실 간 결과의 비교를 가능하게 할 필요가 있습니다. 이 항목에서는 Biorheology 9,10에 과학 및 표준화 소위원회에서 혈전증 및 지혈에 관한 국제 사회의 주요 주제이다. 혈소판 농축액 (PC)는 혈소판 감소증 및 / 또는 출혈의 원인이 다양한 질병을 앓고있는 환자에 수혈된다. 그러나 PC 혈소판 특히 저장 시간 (11)의 기능에 둔감하도록 공지되어 열화 과정 노화 일반적 혈소판 기억 장애라고 링크. 때때로 혈소판 번 (12) 수혈 혈액 순환에 복원 주장하지만, 이것에 대한 증거는 부족하다. 또한, PC를 구성하는 혈소판의 기능은 통상적으로 시험되지 않기 때문에 이러한 분석법과의 관계치료 또는 예방 효과는 불분명 (13)이다. 미세 유동 챔버 수집 및 발의 조작 사이의 사슬을 최적화하는 PC에서 혈소판 기능을 조사하기위한 수단을 제공한다. 우리가 이전에 14,15을 발표하고 여기에 설명 된 바와 같이 PC의 직접 (쌍) 비교를위한 강력한 연구 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>EDTA가 있는 BD 진공 튜브&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>Heparin이 있는 BD 진공 튜브</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨이 있는 BD 진공 튜브</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin 혈액</td>관 <td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>BD 진공 청소기 Eclipse</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>홀더가 사전 부착된 채혈 바늘</td></tr><tr><td>피펫 팁 100-1,000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>튜브 5 ml</td><td>Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 50ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10ml 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>정밀 와이프</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro + Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Figure S1 A에 명명 된 'Biochip'Vena8</td></tr> <tr><td>튜빙</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Figure S1 B에서 '일회용 튜브'로 명명</td></tr><tr><td>Vena8 Needles</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Figure S1 B에서 'Pin'으로 명명</td></tr> <tr><td>Biochips의 단일 입구 케이블용 커넥터</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>Figure S1 B에서 'Reusable tubing' 및 'Splitter'로 명명</td></tr> <tr><td></td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 미세유체 펌프</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm Collagen</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Native equine tendon collagen (type I) 콜라겐을 묽게 하기 위한 등장성 포도당 용액이 보충</td></tr><tr><td>됩니다.HEPES 완충 식염수(HBS)</td><td></td> <td>가정 준비</td><td>중 준비 10 mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충 식염수(0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)</td></tr><tr><td>집 준비 준비 내</td> <td>차단 버퍼</td><td></td><td>HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>분자 프로브</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>표백제 10%</td><td> </td><td>가정 준비</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td></td><td>가정 준비</td><td></td></tr><tr><td>준비 변성 알코올</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>with Multiflow8. Figure S1 A에서 'Pump' 및 'Manifold' 현미경으로 명명됨</td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td>은 <td>colibri-LED와 고해상도 CCD 카메라</td></tr><tr><td>소프트웨어 현미경을</td> 갖추고 있습니다.<td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>혈액학 분석기</td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 인큐베이터</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>배양 수조</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>브랜드</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>튜브 롤러</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>멸균 도킹 장치</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>튜빙 실러</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

수혈을 위해 준비된 혈소판은 보관 중에 점차 지혈 기능을 잃습니다. 혈소판 기능은 다양한(간접) 체외 실험을 사용하여 조사할 수 있지만, 이들 중 어느 것도 미세유체 유동 챔버만큼 포괄적이지 않습니다. 이 프로토콜에서는 저장된 혈액 은행 혈소판으로 혈소판 감소성 신선한 혈액을 재구성하는 데 사용되어 혈소판 수혈을 시뮬레이션합니다. 다음으로, 재구성된 샘플은 노출된 내피하 기질 단백질의 지혈을 모방하는 미세유체 흐름 챔버에서 관류됩니다. 헌혈, 수송, 성분 분리, 저장 및 병원체 불활성화의 효과는 쌍체 실험 설계에서 측정할 수 있습니다. 이를 통해 혈액 성분 제제의 모든 조작이 지혈에 미치는 영향을 신뢰할 수 있게 비교할 수 있습니다. 본 연구의 결과는 온도 순환, 전단 속도, 혈소판 농도 및 저장 기간이 혈소판 기능에 미치는 영향을 보여줍니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 혈액 은행 혈소판의 기능을 분석하고 궁극적으로 정맥 절개술, 수송, 성분 준비, 보관 및 수혈을 포함한 처리 사슬의 최적화를 지원합니다.

내부 분석 변화를 설명하기 위해, 3 개의 동일한 복원 된 전혈 시료를 콜라겐 코팅 된 표면 (도 1)를 통해 동시에 관류 하였다. 이는 8.7 %의 변동 계수가 발생했습니다. 이 통계는 관련 샘플 간의 신뢰성있는 비교를 허용 허용 내 분석 및 intralaboratory 변화를 의미한다. 우리는 여기 설명 상업적 유동 챔버의 입구는 상기 측정 챔버에 수직이며,이 대신에 그 시점에서 층류 약간 난류가 발생할 수있다. 특히 항응고제가없는 실험에서 이는 혈액과 고정화 효능의 증가 된 접촉 시간에 막힘이 발생할 수있다. 막힌 유입 챔버의 하류 판독​​을 혼동 할 수있다. 따라서, 설치가 부분적으로 유량 용기 (그림 2) 떠나 코팅하여 최적화 된혈소판 효능없는 입구는하여 기본 및 보조 지혈의 불의의 활성화를...

혈소판 수혈 및 지혈은 혈액 은행 혈소판의 기능을 조사하기 위해 혈액 재구성 및 미세유체 유동 챔버를 사용하여 모델링되었습니다. 이 데이터는 혈소판 저장 병변이 지혈에 미치는 영향을 in vitro에서 보여줍니다.

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

본 실험의 전반적인 목표는 체외에서 혈소판 수혈을 모사하고, 유체 역학적 흐름과 실시간 현미경 관찰을 통해 콜라겐 상의 지혈 작용을 사용하여 이를 테스트하는 것입니다. 혈소판 감소증 환자는 보관된 혈소판 농축액으로 치료를 받습니다. 본 방법은 특히 이러한 보관된 혈소판 농축액의 품질과 기능에 중점을 두어, 혈전증 및 지혈 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움을 주기 위해 고안되었습니다.이 기술의 부가적인 가치는 혈류를 모방함으로써 참여 세포 및 생체 분자에 미치는 레올로지(rheology)의 영향을 고려한다는 점입니다. 현재의 방법은 콜라겐에 대한 혈소판 결합을 평가합니다. 하지만 이는 죽상경화성 플라그, 혈관 내피 세포 또는 Von Willebrand factor 및 fibrinogen과 같은 특정 기질 단백질을 포함한 다른 부착 조직에도 적용될 수 있습니다.바이오칩 준비부터 시작합니다. 콜라겐 스톡을 제조사에서 제공하는 등장성 포도당 용액으로 1:20 비율로 희석하고 볼텍싱하여 최종 농도를 50 µg/mL로 맞춥니다. 그다음, 새 일회용 바이오칩의 레인에 0.8 µL씩 피펫팅합니다.칩의 한쪽 끝에 있는 모든 레인을 채우고, 이곳을 배출구 쪽으로 표시합니다. 그다음 칩을 검사하여 각 레인의 5/6가 용액으로 채워져 있는지, 그리고 기포가 없는지 확인합니다. 그런 다음, 칩을 가습된 밀폐 용기에 넣어 4 °C에서 4시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.이후, 레인의 다른 쪽 끝에 블로킹 버퍼를 피펫팅하여 코딩된 채널을 블로킹합니다. 그다음 각 레인에 대해 12cm 길이의 튜브를 자르고, 각 튜브 길이에 핀을 부착하여 바이오칩에 연결할 수 있도록 합니다. 시린지와 커넥터를 사용하여 튜브 길이를 증류수로 헹굽니다.그런 다음, 블로킹 버퍼로 이를 포화시키고 습윤 용기에 넣어 최소 1시간 동안 밀봉합니다. 다음으로, 펌프와 매니폴드를 준비합니다. 먼저, 펌프와 매니폴드를 증류수로 헹궈 기포를 모두 제거합니다.다음으로, 바이오칩을 자동 현미경 스테이지에 부착합니다. 튜브의 한쪽 끝을 HBS가 채워진 1.5 milliliter 튜브에 넣은 다음, 반대쪽 끝을 바이오칩 입구에 연결합니다. 매니폴드 핀을 바이오칩의 출구에 삽입합니다.그다음, 펌프를 사용하여 HBS로 시스템을 헹굽니다. 이렇게 하면 남아 있는 블로킹 버퍼나 제대로 부착되지 않은 콜라겐이 제거됩니다. 이로써 유체 챔버 준비가 완료됩니다.건강한 자원봉사자로부터 최근에 채취한 혈액 샘플들을 원심분리용 코니컬 튜브에 모으는 것으로 시작합니다. 샘플을 250 Gs에서 약 15분 동안 원심분리합니다. 느슨하게 층을 이룬 하층이 흐트러질 수 있으므로 브레이크를 사용하지 마십시오. 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma)과 버피 코트(buffy coat)를 제거하여 버립니다.재구성 혈액을 만들기 위해 혈소판이 최대한 적게 포함된 농축 적혈구를 보관하십시오. 이제 4 mL의 AB형 혈장을 37 °C에서 5분 20초 동안 해동하기 시작하십시오. 그동안 자동 혈액 분석기를 사용하여 준비된 농축 적혈구의 헤마토크릿을 측정하십시오.그런 다음, 전혈 재구성용으로 사용할 혈액 은행 준비 혈소판 농축액의 혈소판 농도를 측정합니다. 헤마토크릿 40%, µL당 혈소판 수 250,000개인 재구성 혈액 1mL를 만드는 데 필요한 부피를 계산합니다. 이제 끝을 자른 피펫 팁을 사용하여, 적혈구, 혈장, 그리고 원하는 농도의 혈소판 농축액을 최종 부피 1mL가 되도록 필요한 양만큼 옮깁니다.재구성된 혈액을 부드럽게 전도 혼합한 후, 전혈 구성을 측정합니다. 그 다음, Calcein AM이 포함된 준비된 마이크로원심분리 튜브를 가져와 재구성된 혈액 1 mL를 첨가합니다. 부드럽게 전도 혼합하여 혈액과 염료를 섞습니다.그 후, 재구성된 혈액을 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 소프트웨어에서 관류 레인의 관심 영역을 선택합니다. 100배 배율로 레인 바닥에 부착된 콜라겐 섬유에 초점을 맞춥니다.가급적 위상차 현미경이나 미분 간섭 대비 현미경을 사용하십시오. 선택한 타일 영역에 대해 현재 Z값을 설정하는 옵션을 선택하여 선택된 Z 위치를 디지털 방식으로 고정하십시오. 관류 전의 광학적 초점은 법랑아세포 콜라겐에 맞추어야 하지만, 이는 까다로울 수 있습니다.다른 방법은 현미경 초점을 초기에 부착된 혈소판에 맞추는 것입니다. 이제 샘플을 부드럽게 섞어 바이오칩 옆에 배치하십시오. 그런 다음, 관찰 대상 레인에 연결된 튜빙을 재구성된 혈액에 넣으십시오.다음으로, 펌프 제어 소프트웨어를 사용하여 50 dyne/cm²의 압력을 가해 혈액 샘플을 레인으로 이동시키고 실험을 시작합니다. 실험 동안 5분 동안 15초마다 이미지를 기록합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 혈전 성장 역학을 결정합니다.본 사례에서는 Zen 2012를 사용합니다. 먼저 플러그인 이미지 분석(plugin image analysis)을 열어 혈소판의 표면 피복도를 결정합니다. 분석 대화형(analyze interactive) 탭에서 형광 임계값을 설정하여 부착된 혈소판에서 기인하는 양성 신호와 상관관계가 있는 픽셀 강도를 정의합니다.그 다음, 표 생성(create tables) 기능을 사용하여 각 시점별 양성 신호의 표면적 목록이 포함된 스프레드시트를 자동으로 생성하십시오. 이 스프레드시트를 XML 형식으로 저장하고, 추가 계산을 위해 스프레드시트 프로그램에서 엽니다. 모든 시점에서 선택된 객체들의 총 표면적을 계산하고, 이 값을 덮인 표면의 백분율(%)로 표시하십시오.그런 다음, 데이터를 관류 시간의 함수로 플롯하고 선형 회귀를 통해 기울기를 계산합니다. 이는 해당 특정 실험 조건의 혈전 성장 역학을 모델링한 것입니다. 세 개의 동일한 재구성 전혈 샘플을 콜라겐 코팅된 표면에 동시에 관류하였습니다.그 결과 변동 계수는 8.7%였으며, 이는 검사 비교를 위한 허용 가능한 분석 내 및 실험실 내 변동성을 시사합니다. 부족한 성분을 혈액에 재구성하여 수혈을 시뮬레이션하였습니다. 혈소판 농도를 점차 낮추어 여러 차례 재구성을 수행하였습니다.예상대로, 혈소판 수치가 낮을수록 관류 시간에 따른 부착 정도가 감소하는 결과가 나타났습니다. 다음으로, 채혈 후 및 관류 중 온도 저하의 영향을 조사하였습니다. 혈액을 상온으로 냉각했을 때 혈전 형성 속도가 더 느려지는 것으로 확인되었습니다.연구 전반에 걸쳐 37 °C로 유지된 샘플과 비교하였습니다. 혈액 순환 중, 혈소판은 벽 전단 응력이 높은 조건의 혈관 손상 부위에 결합합니다. 예상대로, 미세유체 흐름 챔버 내의 전단율을 변화시키자 전체 혈소판 부착량이 변하였습니다.이러한 조건들은 혈전 성장 역학 또한 변화시킵니다. 이 영상을 시청한 후에는 저장된 혈소판 농축액의 품질과 기능을 테스트하기 위해 재구성된 혈액을 사용하여 미세유체 흐름 챔버 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 약 7시간 정도면 완료할 수 있습니다.미세유체 흐름 챔버 실험을 통해 혈소판 수혈 분야의 연구자들이 헌혈, 조제 및 보관 변수의 영향을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다. 이에 해당하는 관련 사례로 병원체 불활성화가 있습니다. 여기서는 단 하나의 실험 대상에 대한 예시를 제시하였습니다.하지만 칼슘 농도, 전단 응력 및 표면 코팅의 변화를 통해 서로 다른 연구 질문을 다룰 수 있습니다. 이 절차와 유사하게, 마이크로 유체 흐름 챔버에서의 다른 측정들을 수행하여 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 흐름 상에서 보관된 혈소판의 응고 성능 등을 측정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.

혈관 세포 리모델링의 조사에 생리의 체외 모델 및 응용 프로그램과 함께 병리학 혈액 흐름

이 논문은 동시에 혈소판 기능과 응고를 측정 지혈의 실험 모델을 설명합니다. 혈소판 및 피브린 형광을 실시간으로 측정하고, 혈소판의 부착 율, 응고 속도 및 응고의 개시가 결정된다. 모델은 수혈 농축 플로우하에 혈소판 응고 특성을 결정하는데 사용된다.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

여기에 제시된 시험관 내 혈역학 루프 모델에 대한 표준화된 프로토콜이 있습니다. 이 모델은 ISO(국제표준화기구) 표준 10993-4에 따라 관류 관 또는 혈관 스텐트의 혈중 호환성을 테스트할 수 있습니다.

혈관 의료 기기의 혈혈성 호환성 및 호스트 세포 활성화를 조사하는 시험관 헤모역학 루프 모델

혈류 하의 혈소판 기능을 평가하고 시뮬레이션된 지혈 소생술을 외상 및 수혈 의학에 응용하는 미세유체 장치를 사용하여 모델링할 수 있습니다.

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

우리는 이기종 종양 microenvironments를 재현 마이크로 유체 장치의 제조 및 운영을위한 절차를...

종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치<em&gt; 체외에서</em

Dielectrophoresis (DEP)는 세포를 조작하는 효과적인 방법입니다. 인쇄 회로 기판 (PCB)은 microfluidic 장치 이내에 연락이없는 세포 조작을위한, 재사용 가능한 저렴하고 효과적인 전극을 제공할 수 있습니다. PCBs에 coverslips와 PDMS 기반 microfluidic 채널을 결합하여, 우리는 다채널 microfluidic 장치 내에서 구슬과 세포 조작과 분리를 보여줍니다.

멀티 채널 Microfluidic 장치에서 분리 비즈와 세포 Dielectrophoresis와 층류를 사용하여

이 연구는 크게 생리학 관련 전단 흐름에 따라 세포 롤링 연구의 처리량을 증가, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 캐스케이드 및 환자 세포의 외인성 개체군의 전신 전달 다음 세포 호밍의 중요성을 원점 다단계 셀에서 셀 압연의 중요성을 감안할 때,이 시스템은 세포 기반 치료를 개선하기위한 스크리닝 플랫폼으로 잠재력을 제공한다.

의 체계적인 분석 체외 셀 롤링

학습하세요 미세 유체 흐름 챔버를 이용한 재구성 혈액 기반 혈소판 수혈 및 지혈 모델링 방법을. 콜라겐 표면에서의 혈소판 기능과 저장 손상 효과를 평가하여 혈전증 및 지혈 연구에 활용할 수 있습니다.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여

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