비디오 이미징 및 시공간지도는 마우스에서 위장관 운동성을 분석하는

이 기술의 전반적인 목표는 비디오 영상을 사용하여 마우스 결장 운동의 신경 조절 변화를 확인하는 것입니다. 이 기술은 신경 세포 유전자의 미세한 돌연변이가 결장 운동에 영향을 미치는지와 같이 장 신경과학 분야와 관련된 주요 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직이 중추 신경계의 입력이 없는 상태의 낭성 구조라는 것이며, 결과적으로 이 방법은 위장관 운동 조절에 있어 장 신경계의 관여 정도를 조사할 수 있게 해줍니다.

이 기술은 뇌의 시냅스 기능을 변화시키는 유전자 변이가 장 운동성 또한 변화시킬 수 있다는 점에서 자폐증과 같은 신경발달 질환의 치료로 확장될 수 있습니다. 먼저 해부용 핀셋과 가위를 사용하여 하복부 근육층을 덮고 있는 표피에 절개선을 만듭니다. 흉골까지 중앙선을 따라 복강을 엽니다.

생리식염수로 조직을 적신 후, 포셉을 사용하여 맹장을 복부 위로 4~5cm 정도 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음 미세 해부 가위를 사용하여 위장관 조직을 만지거나 늘리거나 절단하지 않도록 주의하며 장간막을 다듬습니다. 방광, 고환 및 기타 불필요한 조직을 제거합니다.

그 다음, 거친 해부 가위를 사용하여 결장 양측의 골반뼈로 정중선에서 약 0.5 centimeters 떨어진 지점에 두 개의 수직 절개창을 내고, 미세 가위를 사용하여 직장을 인접한 골반 조직으로부터 분리합니다. 결장에서 장간막을 제거하고 생리식염수가 담긴 비커에서 결장 전체 조직을 헹굽니다. 분변 펠릿과 기타 장 내용물을 제거하기 위해, 먼저 200 microliter 피펫의 끝부분을 약 1 centimeter 정도 잘라낸 후, 생리식염수가 채워진 5 milliliter 주사기에 피펫을 연결합니다.

그 후, 맹장과 직장을 제거하고, 조직의 방향을 잡기 위해 점막의 가로무늬가 보이는 결장의 가장 근위단에 곤충 핀을 꽂습니다. 이제 근위단에서 조직을 살짝 잡고, 피펫 팁을 내강에 삽입하여 식염수를 결장을 통해 폐기물 용기로 흘려보냅니다. 다음으로, 동일한 주사기와 피펫 팁을 사용하여 2구 오가니즘 배스(organ bath)에 연결된 튜빙 내의 모든 잔해물을 신선한 생리식염수로 세척합니다.

카보젠(carbogen)을 포화시킨 생리식염수가 지속적으로 관류되도록 장기 욕조(organ bath)를 설정하고, 온도계를 사용하여 식염수 온도가 33에서 37°C 사이로 유지되는지 정기적으로 확인하십시오. 유입 저장조의 압력을 유지하기 위해 중심에 내경 5mm 유리관이 삽입된 고무 마개를 사용하십시오. 그런 다음, 5~7cm 길이의 결장 조각을 장기 욕조 챔버에 완전히 잠기게 하고, 핀셋과 표준 면사(cotton sewing thread)를 사용하여 결장의 근위단을 유입관에, 원위단을 유출관에 삽입하여 연결하십시오.

결장의 근위 및 원위 캐뉼라 삽입 지점 사이의 기초 거리를 측정한 후, 생리식염수에서 30분 동안 조직을 평형화합니다. 장 운동을 기록하기 위해 결장이 적응하는 동안, 표준 실험실용 리토르트 스탠드를 이용하여 비디오 카메라를 장기 욕조(organ bath) 위 10에서 15cm 높이에 배치하고, 적절한 비디오 캡처 소프트웨어를 설정합니다. 카메라 준비가 완료되면, 대조군 조건에서 결장의 영상을 15분씩 4회 기록합니다.

그다음, 관심 약물을 장기조(organ bath)에 30분에서 60분 동안 과류(superfuse)하면서 15분 길이의 비디오 세그먼트 4개를 추가로 캡처합니다. 마지막으로, 처리 용액을 신선한 생리식염수로 교체하고 1시간의 세척(wash out) 기간 동안 15분 길이의 비디오 세그먼트 4개를 더 기록합니다. 이렇게 하면 서로 다른 처리 기간에 따른 결장의 시공간 지도(spatiotemporal maps)를 생성할 수 있습니다.

장 신경계가 약리학적으로 교란되었을 때 시냅스 돌연변이가 결장 이동성 운동 복합체(CMMC)를 변화시키는지 평가하기 위해, 본 실험에서는 5-HT3 및 4 수용체 길항제인 tropisetron을 결장 표본의 장조(organ bath) 챔버에 첨가하였습니다. tropisetron이 존재하는 환경에서 NL3R451C 마우스는 야생형 형제 마우스에 비해 CMMC 빈도가 감소하는 양상을 보였습니다. 대조 조건에서는 야생형과 NL3R451C의 수축력 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았으나, tropisetron은 야생형과 NL3R451C 마우스 모두에서 CMMC 빈도를 유의미하게 감소시켰습니다.

또한, tropisetron은 야생형 동물에 비해 NL3R451C 마우스의 CMMC 빈도에 더 큰 영향을 미쳤습니다. 이 기법을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기법을 시도할 때 장기욕(organ bath)이 일정한 온도로 유지되고, carbogen이 지속적으로 공급되며, 진공 장치를 통해 생리식염수의 넘침이 방지되는지 확인하십시오.

이 절차를 마친 후, 대장 운동성이 변화된 마우스에서 신경세포의 비율이나 세포 수에 변화가 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역세포화학법과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 이 방법의 개발 덕분에 기니피그, 토끼, 쥐 및 기타 종, 특히 이번 사례와 같은 마우스에서 장 운동에 관한 다양한 연구가 가능해졌습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 비디오 이미징을 통해 대장 운동의 신경 조절 변화를 확인하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.