Name: 에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정 생체 세포 내 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 학습하세요 생체 세포 내 기록법을 활용한 나비 복안의 개별 광수용체 세포 스펙트럼 감도 측정 방법입니다. 이 기술은 곤충의 색상 시각 범위를 예측하고 시각 처리 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 격려를 우리에게 장비를 대출에 대한 카단 팔 둘레, 킴벌리 제이미 슨, 매튜 맥 헨리, 및 라주 Metherate의 제조 후반 루디 림 부르 흐, 감사 및 Almut Kelber와 켄타로 아리카. 이 작품은 ADB에 대한 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 KJM에 친목 및 NSF 부여 IOS-1257627에 의해 지원되었다

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

세포 내 기록 때문에 관련된 많은 기술적 인 단계를 마스터하기 어려운 기술이 될 수 있습니다. 성공적인 실험을 위해 몇 가지 중요한 점을 고려해야합니다. 우선, 실험을 수행하는 적절를 진동 절연 테이블을 갖는 것이 중요하다. 많은 연구자들은 완전히 우수한 제진주는베이스로부터 분리 탁상 공기 테이블을 사용한다. 우리의 설치는 미세 조작기 / 전극 홀더 / 표본 스테이지 장치를 배치되는 상단에 샌드 박스와 두꺼운 대리석 테이블을 포함한다. 이 사내 가스 또는 압축 공기에 대한 액세스가 제한 사항입니다 특히, 공기 테이블에 효과적이고 더 저렴한 대안입니다. 추가의 진동 흡수 수단이 수동 에어 서스펜션 또는 테이블 다리 완충 요소의 첨가 등 취할 수있다 (예를 들어, 테니스 공, 자전거 튜브 두꺼운 겔 패드를 열림). 또한, 실험 장치는 내부에 필수적이다모든과 패러데이 케이지가 제대로 접지. 패러데이 케이지는 녹음 할 때 쉽게 케이지 내부에서 작업 할 때 제거하고 교체 할 수있는 앞의 금속 메쉬 스크린을 가져야한다. ...

이러한 신경 세포 등의 전기적 특성은 전압 또는 전류의 변화로 세포막을 가로 지르는 이온의 흐름을 측정함으로써 관찰된다. 전기 생리 다양한 기술 세포 생체 이벤트를 측정하기 위해 개발되었다. 동물의 눈에있는 뉴런 액세스 할 수 있습니다 및 회로는 전기 생리 연구를 위해이 세포 좋은 후보를 만들고, 뇌보다 자주 덜 복잡하다. 눈에서 전기 생리학의 일반적인 응용 프로그램은 전위도 (ERG) 1, 2, 미세 세포 내 기록을 포함한다. ERG는 또는 동물의 눈에 전극을 배치하는 광 자극을인가하고, 모든 주변 셀 3-6의 응답의 합과 같은 전압에서의 변화를 측정하는 것을 포함한다. 하나의 개별 시각 세포의 분광 감도 특성에 특별히 관심이 있다면, 종종 여러 종류의 세포를 동시에 주어진 자극에 다른 힘에 반응; 따라서를눈의 스펙트럼과 유사한 시각 세포의 여러 가지 종류가 특히 ERG 데이터에서 특정 세포 유형의 감도를 결정하기 어려울 수있다. 하나의 잠재적 인 해결책은 눈 R1-6 대부분 세포에서 발현 관심 감광체 (옵신) 유전자로 형질 전환 된 초파리 만들고 ERG의 7 수행하는 것이다. 이러한 방법의 잠재적 인 단점은 감광체 단백질 (8)의 저 발현에는, 형질 전환 동물의 생성 및 스크리닝 긴 시간 프레임을 포함하지 않는다. 스펙트럼 별개의 광 수용체의 적은 종류의 눈에 들어, 컬러 필터와 눈의 적응함으로써, ERG 일부 세포 유형의 기여를 낮추는 분광 감도 최대 9의 추정을 허용 도움이 될 수 있습니다. 세포 내 기록 미세 전극 셀 impales 다른 기술되고 자극이인가된다. 전극 레코드는 해당 개인 노멀idual 세포의 반응은 기록 및 다수의 개별 셀을 분석하는 것은 생리 학적으로 서로 다른 세포 유형 10-14의 특정 감도를 얻을 수 있도록. 우리의 프로토콜은 분광 감도의 분석에 초점을 맞추고 있지만, 날카로운 전극 기록 세포의 기본 원칙은 다른 응용 프로그램에 대한 수정이다. 예를 들어, 시료의 다른 제제를 사용하여 날카로운 석영 전극을 이용하는 경우, 하나의 요구되는 문제에 따라서, 뇌 광섬유 로브 또는 다른 지역의 깊이에서 기록 할 수있다. 예를 들어, 각각의 감광 셀 (15)의 응답 시간은 광 세포 활성은 19과 같은 유사한 기술로 기록 될 수 있고, 또는 컬러 자극 편광 20로 대체 될 수있다 (16) (얇은, 골수 또는 lobula 17), 머리 (18) 또는 다른 신경 로브 -22 또는 운동은 23, 24을 자극. Phototransduction, 프로세스의 광에 의해에너지를 흡수하고 전기 신호로 변환, 거의 모든 오늘날 동물 문 (phyla) (25)에 공통 고대 특징이다. 광 수용체 세포에서 발견 비주얼 phototransduction을 시작 책임이 시각 색소는 로돕신입니다. 모든 동물 Rhodopsins 망막 또는 유사한 분자 (26, 27)에서 파생 옵신 단백질 7 트랜스 G 단백질 결합 수용체 부류의 구성원과 연관된 발색단으로 구성된다. 아미노산 서열 및 발색 구조 옵신 광의 상이한 파장에 로돕신의 흡수에 영향을 미친다. 광자 발색단에 의해 흡수되면 로돕신은 궁극적으로 막 결합 이온 채널 (28)의 개구부를 리드 셀 G 단백질 캐스케이드를 개시 활성화된다. 대부분의 신경 세포와는 달리, 감광 셀은 빛 자극 변화에 응답하여 진폭 상대적인 변화로 측정 할 수있다 그레이드 전위 변화를 겪는다. 일반적으로 주어진감광체 종류 하나만 옵신 유전자 발현 (예외 8,10,29-31 존재하지만). 정교한 색각는 다양한 척추 동물 및 절지 동물에서 발견되는 종류의 각각은 하나 이상의 때때로 로돕신 유형을 나타내는 시각 세포 수백 또는 수천의 복소 눈으로 달성된다. 시각 정보는 컬러 및 모션 완전한 화상의 인식 결과 눈과 뇌 신경 신호 전달 복합체 하류를 통해 감광 모자이크 통해 응답을 비교함으로써 캡처된다. 세포 내 기록 통한 광의 상이한 파장에 대한 시각 세포의 원료 응답을 측정 한 결과, 분광 감도를 계산할 수있다. 이 계산은 시각 세포의 반응이 아니라 그것이 흡수 된 광자 (32)의 특정 특성에,이 흡수 된 광자의 수에 의존한다고 Univariance의 원리에 기초한다. abso 어떤 광자응답의 동일한 종류를 유도 할 것이다 로돕신 의해 rbed. 실제로, 이것은 셀의 원료 응답 진폭 (로돕신 높은 확률 그 파장을 흡수) (흡수 이상의 광자)의 광 강도의 증가 중 인해 증가 또는 피크 감도 향해 파장 시프트에 것을 의미한다. 우리는 알려진 강도와 다른 파장에서 반응 동일한 파장과 같은 강도하지만 알 수없는 상대 감도 세포 반응을 관련이 원리를 사용합니다. 세포 유형은 종종 파장에서 자신의 감도 피크로 식별됩니다. 여기에서 우리는 넓은 연구 커뮤니티에이 방법이 더 접근하기를 중심으로, 세포 내 기록과 나비의 눈에서 광 수용체의 분광 감도의 분석을위한 하나의 방법을 보여줍니다. 세포 내 기록 특히 곤충 색맹에 대하여, 문헌에 공통 남아 있지만, 우리는 그쪽 발견대상 및 방법의 t 설명은 일반적으로 기술의 재생을 허용하기에 너무 짧은 있습니다. 우리는 쉽게 복제를 허용의 목적으로 비디오 형식에서이 방법을 제시한다. 우리는 또한 쉽게 얻을 수 저렴한 장비를 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 새롭고 복잡한 기술을 최적화 할 때 연구를 느리게 자주보고되지 않습니다 일반적인주의 사항을 해결합니다.

<table><tbody><tr><td>나비 번데기</td><td></td><td></td><td>여러 지역 종을 사용할 수 있으며 배송을 위해 USDA 허가가 필요합니다. Carolina Bio Supply는 추가 허가 없이 미국 내에서 주문할 수 있는 여러 곤충 종을 보유하고 있습니다.</td></tr><tr><td>대형 플라스틱 실린더</td><td></td><td></td><td>가습된 상태로 유지되는 모든 챔버가 작동합니다</td></tr><tr><td>. 곤충 핀, 크기 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite Honey</td><td>Trader Joe's</td><td></td><td>모든 꿀 또는 자당 용액이 작동합니다</td></tr>. <tr><td>Xenon Arc Lamp</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel은 현재 Newport Corporation의 일부입니다</td></tr>. <tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel은 현재 Newport Corporation의 일부입니다</td></tr>. <tr><td>광학 트랙</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel은 현재 Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td>의 <td>일부입니다. Oriel은 이제 Newport Corporation</td></tr><tr><td>의 일부입니다.레일 캐리어, 작은 (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel은 이제 Newport Corporation</td></tr><tr><td>Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, 10개 팩</td>의 <td>일부입니다. Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>광학 마운팅 포스트, 1.0 인치, 0.5 인치 Dia. 스테인리스, 8-32 & 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>미끄럼 방지 광학 포스트 홀더, 2 인치, 0.5 인치. 직경 포스트, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>고정 렌즈 마운트, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>고정 렌즈 마운트, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>집광 렌즈 어셈블리</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>볼록 실리카 렌즈, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>6 위치 필터 휠, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>필터 휠 마운트 허브</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>오목 실리카 렌즈, 25.4mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>콜리메이터 홀더</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>시준 빔 프로브</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>페룰 컨버터, SMA 종단 11mm 표준 페룰</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>이 어댑터는 광섬유를 콜리메이터 홀더에 맞을 수 있게 해줍니다&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &뮤; m 직경 UV-vis 섬유 obtic 케이블</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel은 이제</td></tr><tr><td>구동 장치</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV 용융 실리카 금속 ND 필터, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV 용융 실리카 금속 ND 필터, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV 용융 실리카 금속 ND 필터, 0.5 OD</td><td>가 있는 Newport Corporation Shutter의 일부입니다.Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV 용융 실리카 금속 ND 필터, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV 용융 실리카 금속 ND 필터, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV 용융 실리카 금속 ND 필터, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal 램프</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>분광계</td><td>Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite 소프트웨어</td><td>해양 광학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 300 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 310 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 320 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 330 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 340 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 350 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 360 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 370 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 380 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 390 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 400 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 410 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 420 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 430 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 440 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 450 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 460 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 470 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 480 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 492 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 500 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 510 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 520 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 532 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 540 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 550 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 560 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 570 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 580 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 589 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 600 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 610 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 620 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 632 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 640 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 650 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 660 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 671 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 680 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 690 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>간섭 대역통과 필터, 700 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td></td><td></td><td>접지가 가능하고 실험 설정에 맞는 모든 금속 구조가 작동합니다.</td></tr><tr><td>실체 현미경, 6X, 12X, 25X, 50X 배율</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>모든 실체 현미경은</td></tr><tr><td>스윙 암과 헤비 베이스가 있는 현미경 스탠드</td>를 수행합니다. <td>McBain Instruments</td><td></td><td>팔이 있는 모든 헤비 베이스는</td></tr><tr><td>Cardan 암</td><td></td><td></td><td>맞춤형 제작을 수행합니다. 그림 4</td></tr><tr><td>Fiber-lite 고강도 조명기</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td> <td>참조조명 표본</td></tr><tr><td>용 Fiber-lite goose-neck light guide</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>모든 거위목 라이트 가이드는</td></tr><tr><td>대리석 테이블을</td><td></td><td></td><td></td></tr> 수행합니다 <tr><td>제기 된 나무 테이블</td><td></td><td></td><td>샌드 박스가 아래의 대리석 테이블에 놓일 수 있도록이 테이블을 통해 구멍을 잘라야합니다</td></tr><tr><td>모래</td><td></td><td></td>로 채워진 나무 상자 <td>맞춤 제작, 모래</td></tr><tr><td>가있는 모든 상자매니퓰레이터</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시편 스테이지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>접지</td><td></td><td></td><td></td>용 앨리게이터 클립 와이어</tr><tr><td>절연 구리선</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>은선, 직경 0.125mm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>BNC 케이블</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>헤드스테이지가 있는 프리앰프</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug 노이즈 리듀</td>서 <td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프, 30MHz, 2채널, 듀얼 트레이스, Alt-트리거링, 프로브 없음</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab 하드웨어 2/20</td><td>ADI 기기</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Labchart 소프트웨어</td><td>ADI 기기</td><td>차트 5</td><td></td></tr><tr><td>10MHz 펄스 발생기</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 유리 모세관 Borosillicate</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨, 3M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬롯 형 플라스틱 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>낮은 용융 온도 왁스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>납땜 인두</td><td>웰러</td><td></td><td></td></tr><tr><td>볼 및 소켓 마그네틱베이스가있는 플랫폼</td><td>Hama 사진 및 비디오</td><td></td><td></td></tr><tr><td>양면 탄소강, 깨지기 쉬운 면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>바셀린</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로소프트 엑셀</td><td>마이크로소프트</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정<em&gt; 생체</em&gt; 세포 내 녹음

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

세포 내 기록 단일 셀은 주어진 자극에 응답 할 수 있는지 결정하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다. 비전 연구에서는 세포 내 기록은 역사적으로 오늘날 사용되는 다른 빛의 자극에 각각의 광 수용체 세포의 민감도를 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술하고있다. 그러나, 눈에 세포 내 기록 실험을 복제하고자하는 연구자의 문헌에서 상세한 방법론의 부족이 남아있다. 여기에 우리가 더 일반적으로 눈의 생리를 조사하기위한 모델로 곤충을 제시한다. 곤충 시각 세포는 눈의 표면 근처에 위치하기 때문에 달성하기 용이 한 시각에 관련기구의 대부분은 동물 phyla의 걸쳐 보존되어있다. 우리는 전자에 약간의 사전 경험이있는 연구자들에게이 기술을 더 접근 할 수 있도록 목표로, 나비의 눈에서 광 수용체 세포의 생체 내 세포 내 녹음을위한 기본 절차를 설명lectrophysiology. 우리는 단일 셀에 유리 미세하고, 마지막으로 기록 절차 자체를 삽입하는 방법, 녹화 라이브 나비을 제조하는 방법에 필요한 기본 장비를 소개한다. 또한 각각의 세포 종류의 분광 감도를 판정하기위한 원료 응답 데이터의 기본 분석을 설명한다. 우리 프로토콜 분광 감도를 결정하는 단계에 중점을두고 있지만, 다른 자극 (예를 들면, 편광) 및 상기 방법의 변형이 설정에 적용될 수있다.

녹화 설정의 많은 요소를 들어, 서면 설명은 충분한 정보를 제공하지 않는다.도 1은 완전한 녹화 설정에 관련된 구성 요소의 도면이다. 도 2에서, 스펙트럼 보정 팩터가 필요한 이유를 이해하고 이것이 정정을 계산하기 위해 필요하다 수득 백색광 각 간섭 필터 그려진다. 3 사진 및 이들에 사용되는 카아 아암의 다이어그램을 나타낸다 실험.도 4는 기록 ​​단계 및 미세 조작기를 나타내는 합성 화상이다.도 5는 실험 나비 제제의 여러 단계를 도시한다. 기록이 시작되면, 플래시 광에 응답하여 음의 전압 변화는 전극이도 6a에서와 같이 셀의 외부에 있다는 것을 의미한다. 반응의 강도가 전극 근방에 따​​라시각 세포 및 플래시 광의 ...

세포 내 기록의 전기 생리 기술 시연과 나비의 화합물 눈에 하나의 광 수용체 세포의 스펙트럼 감도를 결정하는 데 사용됩니다.

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

이 세포 내 기록법의 전반적인 목적은 생체 내(in vivo) 곤충 겹눈의 개별 광수용기 세포에 대한 분광 민감도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 세포가 민감하게 반응하는 빛의 파장이 여과 색소에 의해 영향을 받는지 여부를 알려줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 광수용기의 분광 민감도를 파악함으로써 동물이 볼 수 있는 색상 범위를 예측할 수 있다는 것입니다.기록 준비를 위해, 실험 시작 최소 45분 전에 제논 램프를 켜고, 유리 전극을 뽑기 최소 30분 전에 미세전극 풀러를 켜십시오. 그다음, 모든 기록 장비를 켭니다. 셔터가 기본적으로 닫혀 있어 광섬유 케이블을 통해 빛이 통과하지 않도록 확인하십시오.그 다음, 마이크로전극 풀러(microelectrode puller)를 사용하여 가느다란 붕규산 유리 마이크로전극을 제작합니다. 전극 내부를 3 M KCl로 채웁니다. 시료를 준비하기 위해, 현미경 하에서 개별 나비를 작은 플라스틱 튜브 안에 핫왁스로 고정하며, 이때 머리 부분이 튜브의 한쪽 끝으로 돌출되어 움직이지 않도록 합니다.그 다음, 왁스를 사용하여 주둥이, 더듬이, 날개를 고정합니다. 그 후, 마른 왁스 조각으로 복부를 눌러 고정합니다. 표본의 복부 뒤쪽으로 젖은 티슈를 넣어 튜브 내부의 습도를 유지합니다.시료가 완전히 움직이지 않는 상태인지 확인하십시오. 다음으로, 작은 왁스 조각을 사용하여 튜브를 자성 베이스에 연결된 볼-소켓 조인트 형태의 소형 플랫폼에 고정합니다. 해부 현미경 하에서, 기준 전극으로 사용할 은선을 입 부분을 통해 머리 속에 삽입하십시오.실험 전, 플랫폼에 와이어를 영구적으로 고정하십시오. 다음으로, 면도날을 사용하여 왼쪽 각막에 작은 구멍을 내고, 건조를 방지하기 위해 바세린으로 구멍을 메웁니다. 각막을 절개한 후에는 가능한 한 빨리 기록 전극을 눈에 삽입하십시오. 눈 속의 혈림프가 빠르게 굳어 전극 삽입이 불가능해질 수 있기 때문입니다.가능하다면 기록이 수행될 장치 내에서 해부를 진행하십시오. 그런 다음, 악어 클립을 사용하여 헤드 스테이지 접지선을 시료 플랫폼의 참조 전극에 연결하십시오. 전극 홀더에 전극을 장착하십시오.그 후, 은선을 마이크로전극 내의 염화칼륨 용액에 삽입합니다. 구스넥 부착물이 있는 광원을 사용하여 실체현미경 하에서 시료를 비추면서 전극을 안구 내부로 내립니다. 마이크로전극이 이전에 각막에 뚫어 놓은 구멍 바로 위에 오도록 전극 홀더를 조정합니다.그 다음, 회로가 형성될 때까지 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 마이크로전극을 눈 속으로 내립니다. 전극이 눈에 삽입되면 스테레오스코프를 패러데이 케이지 밖으로 이동시킵니다. 표본을 비추던 광원을 끄고, 암적응을 위해 곤충을 10분에서 20분 동안 어둠 속에 둡니다.1 nA 전류를 인가하여 전압 변화를 측정함으로써 전극의 저항을 확인합니다. 저항은 일반적으로 100에서 250 MΩ 범위 내에 있어야 합니다. 그다음, 펄스 발생기를 활성화하여 실험 기간 동안 빛을 조사하고, 광섬유 케이블을 눈 쪽으로 향하게 합니다.각 광섬유 플래시마다 오실로스코프에서 전압 변화를 확인하십시오. 전압이 음의 방향으로 변화하는 것은 전극이 아직 세포 내로 진입하지 않았음을 의미합니다. 최대 전압 응답이 관찰될 때까지 시료 주변으로 광섬유 케이블을 이동시키십시오.탈분극 광응답을 생성하려면, 전극 홀더의 바닥을 가볍게 두드리거나 프리앰플리파이어(preamplifier)의 버즈(buzz) 기능을 사용하는 동안 마이크로매니퓰레이터를 앞뒤로 회전시켜 전극이 수직으로 미세하게 움직이게 합니다. 오실로스코프에 탈분극 광응답이 나타날 때까지 미세 조정을 계속합니다. 그런 다음, 광섬유 케이블을 조절하여 가장 큰 탈분극 신호를 찾습니다.마이크로매니퓰레이터를 사용하여 미세하게 조정하고, 필요에 따라 앰플리파이어의 버즈(buzz) 기능을 사용하여 전극이 세포를 안정적으로 기록하고 있는지 확인하십시오. 안정적인 기록은 휴지 전위의 변화가 거의 없어야 하며, 배경 잡음이 낮고, 일관되게 큰 탈분극 반응이 나타나야 합니다. 휴지 막전위의 잡음이 없고 시간이 지나도 변하지 않는 안정적인 기록 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.응답은 과분극 없이 크고 양의 값으로 나타나야 합니다. 설정이 안정되면 소프트웨어를 실행하고 "Experiments Gallery"라는 대화 상자를 닫아 4개의 채널이 있는 팝업 창을 엽니다. 소프트웨어 창 우측 상단의 전압 스케일을 500 millivolts로 조정하십시오.그런 다음, 오른쪽 하단 모서리의 Start를 클릭하여 녹화를 시작합니다. 3번과 4번 채널을 최소화하고, X 및 Y축 스케일을 조정합니다. 그 후 실험이 끝날 때까지 소프트웨어를 실행합니다.백색광 자극의 경우, 반응을 유도할 수 있는 가장 높은 OD로 ND 필터 휠을 설정하여 최대 10개의 개별 반응을 기록하십시오. 여기서는 3.0 OD 및 2.0 OD에서의 반응 변화를 보여줍니다. 다음으로, 반응 로그 강도 곡선을 제공하기 위해 3.5에서 0.0 OD까지 모든 조합으로 동일한 횟수의 반응을 기록하십시오. 간섭 필터를 사용하여 모든 파장에 대한 세포의 반응을 기록하기 전에, 먼저 피크 파장을 빠르게 찾으십시오.광경로에 ND 필터가 없는 상태에서 UV 투과 필터를 배치하고 반응 진폭을 짧게 관찰합니다. 청색 투과 필터, 녹색 투과 필터, 적색 투과 필터를 사용하여 동일한 절차를 반복하면 최대 반응이 나타나는 지점을 어느 정도 파악할 수 있습니다. 다른 간섭 필터로 교체하기 전에 최대 반응을 나타내는 필터 파장 아래에 해당 값을 기록하십시오.후속 필터로 기록하기 전, 광경로에 필터를 제거한 상태에서 세포가 1~2회의 백색광 플래시에 반응하도록 하여 정점 반응이 시간이 지남에 따라 감소하는지 모니터링하십시오. 그 후, 다른 간섭 필터로 기록하며 필터당 최대 10회의 반응을 유도하십시오. 이는 세포 진입 직전에 관찰되는 큰 음전압 변화의 예시입니다.여기에 배경 소음이 거의 없고, 일반적으로 최소 40 millivolts 이상의 큰 탈분극 반응을 보이는 깨끗한 기록이 제시되어 있습니다. 그리고 여기에는 메인 피크 이후의 음전위 변화로 인해 품질이 낮은 기록의 예시가 있습니다. 이것은 또 다른 불량한 기록의 예시입니다.휴지 전위의 변동 폭이 매우 크며, 다량의 배경 소음으로 인해 반응의 진폭이 가려질 수 있습니다. 이는 단일 기록에서 도출된 분광 민감도의 대표적인 예시입니다. 세포 유형은 유사한 파장에서의 최대 민감도와 민감도 스펙트럼의 전체적인 형태에 따라 분류됩니다.그런 다음 동일한 세포 유형의 값들을 평균 내고, 각 파장에서의 평균 감도를 표준 오차 막대와 함께 그래프로 나타냅니다. 이 그래프는 곤충에서 발견되는 세 가지 전형적인 세포 유형의 분광 감도를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 약 2시간 만에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라, 모든 광수용기 세포 유형이 색 구별에 기여하는지 여부를 결정하기 위한 행동 실험을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 움직이지 못하는 초파리의 눈에서 광수용체 활동의 전기생리학적 기록을 위한 프로토콜을 간략하게 설명하여 광 자극에 대한 반응으로 전압 변화를 정밀하게 측정할 수 있도록 합니다.

빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

이 비디오는 전체 세포 구성을 설정하여 초파리의 옴마티듐(ommatidium)에 있는 광수용체 뉴런의 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이는 광 펄스에 의한 일시적인 수용체 전위 채널의 활성화를 강조하여 측정 가능한 양자 범프를 생성합니다.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptor(초파리 광수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록)

이 동영상은 나비의 눈에 있는 광수용체 세포의 생체 내 세포 내 기록과 개별 세포 유형의 스펙트럼 감도를 결정하는 절차를 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 다양한 광 자극에 대한 개별 광수용체 세포의 민감도를 연구할 수 있습니다.

나비의 광수용체 세포 스펙트럼 감도의 생체 내 세포 내 기록

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

circadian 시간의 함수로 가재 광수용체의 둔감 및 감도 회복에 대한 연구를 위한 프로토콜이 제시된다.

빛 자극전달 시 가재 광수용체 의 둔감화 및 회수

우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

이 동영상은 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 보여줍니다. Dissociated commissural 뉴런이 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

학습하세요 생체 세포 내 기록법을 활용한 나비 복안의 개별 광수용체 세포 스펙트럼 감도 측정 방법입니다. 이 기술은 곤충의 색상 시각 범위를 예측하고 시각 처리 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정

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