에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정 생체 세포 내 녹음

이 세포 내 기록 방법의 전반적인 목표는 in vivo에서 곤충 겹눈에서 개별 광수용체 세포의 스펙트럼 감도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 세포가 민감하게 반응하는 빛의 파장이 여과 색소의 영향을 받는지 여부를 알려줄 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 개별 광수용체의 스펙트럼 민감도를 알면 동물이 볼 수 있는 색상 범위를 예측할 수 있다는 것입니다.

녹음을 준비하려면 크세논 램프를 켜십시오.amp 실험 최소 45분 전에 유리 전극을 당기기 최소 30분 전에 미세 전극 풀러를 켜십시오. 그런 다음 모든 녹음 장비를 켭니다. 광섬유 케이블을 통해 빛이 통과하지 않도록 셔터가 기본적으로 닫혀 있는지 확인하십시오.

그런 다음 미세 전극 풀러를 사용하여 미세한 붕규산 유리 미세 전극을 당깁니다. 전극을 3 몰 염화 칼륨으로 다시 채웁니다. 표본을 준비하려면 현미경으로 뜨거운 왁스가 든 작은 플라스틱 튜브 안에 개별 나비를 부착하여 머리가 움직이지 않고 튜브의 한쪽 끝에서 돌출되도록 합니다.

그런 다음, 더듬이, 날개에 왁스를 부착합니다. 그런 다음 마른 왁스 조각으로 복부를 누릅니다. 표본의 복부 뒤에 젖은 티슈를 튜브 내부에 놓아 튜브를 가습 상태로 유지하십시오.

표본이 완전히 움직이지 않는지 확인하십시오. 다음으로, 작은 왁스 조각을 사용하여 마그네틱베이스에 부착 된 볼-소켓 조인트가있는 작은 플랫폼에 튜브를 장착합니다. 해부 현미경으로 입 부분을 통해 머리에 은선을 기준 전극으로 삽입합니다.

실험하기 전에 와이어를 플랫폼에 영구적으로 고정하십시오. 그런 다음 면도날을 사용하여 왼쪽 각막에 작은 구멍을 뚫고 바셀린으로 구멍을 막아 건조를 방지합니다. 각막이 절단되면 눈의 혈림프가 빨리 굳어져서 전극을 삽입할 수 없게 되므로 가능한 한 빨리 기록 전극을 눈에 삽입하십시오.

가능하면 녹음이 수행될 리그에서 해부를 수행합니다. 그런 다음 앨리게이터 클립을 사용하여 헤드 스테이지 접지선을 시편 플랫폼의 기준 전극에 연결합니다. 전극 홀더에 전극을 장착합니다.

그런 다음 은선을 미세 전극의 염화칼륨 용액에 삽입합니다. 거위목 부착물이 있는 광원을 사용하여 입체경 아래에서 표본을 비추고 전극을 눈 쪽으로 내립니다. 전극 홀더를 조정하여 미세 전극이 이전에 각막에서 절단된 구멍 바로 위에 오도록 합니다.

그런 다음 회로가 완성될 때까지 미세 조작기를 사용하여 미세 전극을 눈 속으로 내립니다. 눈에 들어가면 패러데이 케이지 밖으로 스테레오스코프를 휘두릅니다. 표본을 비추는 광원을 끄고 곤충이 어두운 적응을 위해 10-20분 동안 어둠 속에 두십시오.

1나노암페어 전류를 인가하고 전압 변화를 확인하여 전극의 저항을 확인합니다. 저항은 일반적으로 100에서 250메가옴 사이여야 합니다. 다음으로, 펄스 발생기를 활성화하여 실험이 진행되는 동안 섬광을 전달하고 광섬유 케이블을 눈 쪽으로 향하게 합니다.

오실로스코프에서 전압 변경 각 표시등이 깜박이는지 확인하십시오. 전압의 음의 변화는 전극이 아직 셀에 들어가지 않았음을 의미합니다. 최대 전압 응답이 관찰될 때까지 시편 주위로 광섬유 케이블을 이동합니다.

탈분극광 응답을 생성하려면 마이크로 매니퓰레이터를 앞뒤로 회전하여 전극의 수직 움직임을 작게 만드는 동시에 전극 홀더 바닥을 가볍게 두드리거나 프리앰프의 버즈 기능을 사용합니다. 오실로스코프에 탈분극광 응답이 나타날 때까지 계속해서 조금씩 조정합니다. 그런 다음 광섬유 케이블을 조정하여 가장 큰 탈분극 신호를 찾습니다.

마이크로 매니퓰레이터로 약간 조정하고 필요에 따라 증폭기의 버즈 기능을 사용하여 전극이 셀을 안정적으로 기록하고 있는지 확인하십시오. 안정적인 녹음은 휴지 전위, 낮은 배경 소음, 일관되게 큰 탈분극 응답의 변화가 거의 또는 전혀 없어야 합니다. 휴지막 전위가 잡음이 없고 시간이 지남에 따라 변하지 않는 안정적인 기록이 필수적입니다.

반응은 과분극 없이 크고 긍정적이어야 합니다. 설정이 안정되면 소프트웨어를 열고 "실험 갤러리"라는 대화 상자를 닫아 4개의 채널이 있는 팝업 창을 엽니다. 소프트웨어 창의 오른쪽 상단 모서리에 있는 전압 스케일을 500밀리볼트로 조정합니다.

그런 다음 오른쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 채널 3과 4를 최소화하고 X 및 Y 스케일을 조정합니다. 그런 다음 실험 기간 동안 소프트웨어를 실행하도록 허용합니다.

백색광 자극의 경우 최대 10개의 개별 반응을 기록하고 ND 필터 휠을 여전히 반응을 이끌어내는 가장 높은 OD로 설정합니다. 여기서 응답의 변화는 3.0 OD 및 2.0 OD로 표시됩니다. 다음으로, 응답 로그 강도 곡선을 제공하기 위해 모든 조합에서 3.5에서 0.0 OD까지 동일한 수의 응답을 기록합니다. 간섭 필터를 사용하여 모든 파장에 대한 셀의 응답을 기록하기 전에 먼저 피크 파장을 빠르게 찾으십시오.

광 경로에 ND 필터가 없으면 UV 투과 필터를 배치하고 응답 진폭을 간략하게 관찰합니다. 파란색 송신 필터, 녹색 송신 필터 및 빨간색 송신 필터를 사용하여 절차를 반복하면 피크 응답이 어디에 있는지 알 수 있습니다. 다른 간섭 필터로 변경하기 전에 최대 응답을 제공하는 필터 파장 아래에 기록합니다.

후속 필터로 기록하는 사이에 세포가 광 경로에서 필터 없이 한 번 또는 두 번의 백색광 섬광에 반응하도록 하여 시간이 지남에 따라 피크 응답이 저하되는지 여부를 모니터링할 수 있습니다. 그런 다음 다른 간섭 필터로 기록하고 필터당 최대 10개의 응답을 허용합니다. 이것은 셀에 들어가기 직전에 볼 수 있는 큰 음의 전압 변화의 예입니다.

여기에 표시된 것은 배경 소음이 거의 없고 일반적으로 최소 40밀리볼트의 큰 탈분극 응답이 있는 깨끗한 녹음입니다. 그리고 다음은 메인 피크 이후의 음의 전위 변화로 인한 불량한 기록의 예입니다. 이것은 잘못된 녹음의 또 다른 예입니다.

휴지 전위는 큰 변동을 겪고 있으며 많은 양의 배경 소음은 응답의 진폭을 가릴 수 있습니다. 이는 단일 기록에서 파생된 스펙트럼 감도의 대표적인 예입니다. 세포 유형은 유사한 파장에서 피크 감도와 감도 스펙트럼의 전체 모양에 따라 분류됩니다.

그런 다음 동일한 세포 유형을 평균화하고 평균 감도는 각 파장에서 표준 오차 막대로 표시합니다. 이 그래프는 곤충에서 발견되는 세 가지 일반적인 세포 유형의 스펙트럼 민감도를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 모든 광수용체 세포 유형이 색 구별에 기여하는지 여부를 결정하기 위해 행동 실험을 수행할 수 있습니다.