Name: 녹내장 유도 절차 생체 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 학습하세요 쥐 망막 신경절세포 손실을 유도하는 녹내장 동물 모델 수술법을. 외막정맥 고삼염수 주사로 RGC 손실을 일으키고 전체 마운트 망막 준비를 통해 신경 보호 전략 연구에 활용할 수 있습니다.

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동물의 주제를 사용하는 모든 절차는 웨스턴 미시간 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 학회의 기준에 따라왔다. 1. 동물 <ol><li> 이 연구에서 남성과 여성의 쥐에게 세 3 개월을 사용합니다. </li><li> 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 어둠주기에서 동물을 유지합니다. </li></ol> 동물 마취에 대한 KAX 칵테일 2. 준비 <ol><li> 1 ml의 아세 프로 마진 (10 ㎎ / ㎖) 및 증류수 3 ㎖에 5 mL의 케타민 (100 ㎎ / ㎖)의 자일 라진 (20 ㎎ / ㎖) 50 mg을 녹인다. 철저하게 섞는다. </li><li> 주사기 필터 소독 및 10 ml의 혈청 병에이 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 3. KAX 주입 <ol><li> 동물 (g)을 달아 주입을위한 준비가 될 때까지 케이지로 돌아갑니다. </li><li> 28 G 바늘을 1 ml의 인슐린 주사기를 사용하여 0.1ml를 복강 KAX / 100g 동물 체중을 주입. </li><li> 허용하다동물에 대한 의식이 될 수 있습니다. 발과 꼬리를 곤란하여 반사를 확인합니다. </li><li> 수술 기간 동안 안전하게 실험실에서 모든 동물을 유지합니다. </li><li> 포스트 수술은 자신의 새장에 동물을 교체하고 의식이 회복 될 때까지 RT 편안한 유지합니다. 만 동물이 각성 할 때 동물 시설에 동물을 반환하고 정상적인 동작을 다시 시작합니다. </li></ol> 외과 및 미세 조립 4. 준비 <ol><li> 멸균 2 M NaCl 용액을 확인합니다. </li><li> 이 미세하게 테이퍼 유리 미세 바늘 (그림 1D, 그림 1E)로 한 0.86 mm 내경에게 무거운 연마 표준 및 얇은 벽으로 둘러싸인 붕 규산염 관을 끌어 미세 전극 풀러 (그림 1C)를 사용합니다. </li><li> 2 M 식염수 메우기 주사기 바늘과 1 ML의 주사기 (그림 1B)를 사용하여 이전 단계에서 하나의 미세 백필. 전극의 선단으로부터 기포를 탭. </li><li> 2 M과 제 1 ML의 주사기를 채우염화나트륨. 18 G 바늘을 연결 한 다음 폴리에틸렌 튜브 (그림 1A)의 길이 (약 10 인치)에 연결합니다. 바늘을 통하여 식염수 폴리에틸렌 튜브를 채우기 위해 주사기 플런저를 사용한다. </li><li> 미세 바늘과 튜브 모두 식염수로 가득 할 때, 조심스럽게 두 가지를 연결합니다. 그들 사이의 접속 (도 2)에 공기를 제거한다. </li><li> 미세 물론 종이 타월의 입자에 대해 매우 가볍게 긁어하여 미세 바늘의 끝을 베벨. </li><li> 부드럽게 액체 미세 스트림 종이 타월에 보일 때까지 주사기 플런저를 밀어 미세 바늘의 저항을 확인한다. 액체의 흐름은 0.5 mm보다 넓은 없어야합니다. </li></ol> 동물의 5. 준비 <ol><li> 2 방울 각막에 국소 마취제 (Proparacaine 염산염 안과 솔루션, USP, 0.5 %) - 1을 적용합니다. 더 안구 반사가 발생하지 않을 때까지 기다립니다. </li><li> 가위로 수염을 손질. </li><li> 에스실험 눈 주위 betadine 용액과 면봉 공간이있는 코튼 팁 어플리케이터를 aturate. </li><li> 현미경을 사용하여, 눈을​​ 팽창 상공 막 정맥을 노출하고 눈의 움직임을 제한하기 위해 아래 눈꺼풀을 고정하기 위해 지혈을 연결합니다. (그림 3, 화살표) </li></ol> 6. 녹내장 유발 식염수 주입 <ol><li> 미세 바늘 조립체 및 동물이 제조 될 때, 주사를 시작한다. </li><li> 동물 피트 / 꼬리 핀치에 응답하지 않는 것으로 확인되면, 조심스럽게 정맥 (그림 3, 흰색 화살표) 10과 20도 사이의 낮은 각도로 오는에 의해 미세과 상공 막 정맥을 관통. 혈액이 미세 바늘 (도 3, 검은 화살표)의 선단에 들어가면 정맥 천자 성공적인 명백하다. </li><li> 천천히 수동 ​​정맥 약 50 μL의 생리 식염수를 주입. 이 약 10 초 정도 소요됩니다. 정맥 것이다 소금이 죽 순환으로 희게 흰색우 혈관 (그림 4, 화살촉). 일부 지역은 피가 붉은 모양 (그림 4, 화살표)를 유지할 수있다. <ol><li> 전체 망막 신경절 세포 층 철저한 망막 손상을 확인하기 위해, 대향하는 제 사이트로, 정맥 내로 주입 제를 수행한다. 참고 : 소금은 혈관 시스템을 통해 순환으로 분 이내에, 하나는 눈의 홍채를 통해 구별 흐린 모습을 볼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 내부 통제로 사용하기 위해 치료 반대 눈을 둡니다. </li></ol> 7. 동물 복구 <ol><li> 지혈을 제거합니다. </li><li> 지혈에 의해 주사 부위에 고정 사이트에 트리플 항생제 연고 (바시 트라 신 아연, 네오 마이신 황산염, polymysin의 B 황산)을 적용 할면 주걱을 사용합니다. 눈 주위 조직의 손상은 지혈을 사용하여 발생하지 않습니다. </li><li> &gt; 순환 온수 담요에 자신의 새장에 넣어 마취 동물은 이전합니다천만에 저체온증. 의식과 정상적인 동작이 회복 될 때까지 관찰에서 동물을 유지합니다. 다시 동물의 식민지에 깨어있는 동물을 운반 할 것. 동물 희생의 시간이 될 때까지 식민지에 남아 있습니다. </li></ol> 8. 동물의 희생과 망막 제거 <ol><li> 녹내장을 유도하는 절차를 수행 한 달, 동물 CO 2 질식 및 보조 흉부 천자에 의해 안락사시켰다. <ol><li> 챔버에서 동물을 놓고 단단히에 뚜껑을 넣어. </li><li> 20 부피 % / 분 CO 2 변위를 허용하는 CO 2 가스 조절 밸브를 열고 챔버 내의 산소. </li><li> 동물이 만료하기위한 사에 5 분을 허용합니다. </li><li> 두 밸브의 전원을 끄십시오. </li><li> 챔버에서 동물을 제거하고 멸균 메스와 보조 흉부 천자를 수행합니다. </li></ol></li><li> 안락사 후 눈 BEI 주변 궤도 공동 내의 결합 조직을 잘라 메스를 사용NG주의 안구 자체로 절단하지. </li><li> 조심스럽게 그대로 안구를 추출하는 시​​신경과 남아있는 조직을 잘라 곡선 가장자리에 가위를 사용합니다. 신선한 PBS를 포함하는 무균 60mm X 15mm 일회용 페트리 접시에서 추출 된 안구를 놓습니다. </li><li> 안구에서 아이 컵을합니다. 이렇게하려면 메스와 작은 절개 단지 홍채와 공막 사이의 경계에 후부합니다. 안구에서 각막 반구를 제거하는 작은 봄 가위로 눈의 둘레 주변이 절개를 수행합니다. 시신경 접속 반구 남아있다. </li><li> 안락사 동물에서 아이 컵 내부의 매우 얇은 핑크 / 베이지 망막을 찾을 수 있습니다. 아이 컵을 안정화 무딘 집게와 망막의 색소 층을 잡으십시오. 아주 부드럽게 눈 뒤쪽 떨어져 전체 그대로 망막을 애타게 폐쇄 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. , 곤란 당겨, 또는 직접 망막을 잡아 당 겼하지 마십시오. </li><li> 를 잘라 작은 봄 가위를 사용하여시신경 여전히 망막에 부착되는 영역. </li><li> 망막에서 남아있는 색소 상피 또는 공막 조직을 절단해야합니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 매우 부드럽게 신선한 PBS를 포함 35mm X 10mm 페트리 접시 코팅 깨끗한 실 가드에 고립 된 망막을 전송합니다. </li></ol> 9. 전체 마운트 망막 준비 <ol><li> 일단 실 가드 접시, 장소에 망막 핀 집게 하나의 선인장 바늘을 사용합니다. 이 위를 향하도록 망막 신경절 세포 층을 유지하고 아래로 시신경. 망막의 반구 모양도 고정 후 주목할 만하다. 망막 신경절 세포 층이 원하는 방향에있는 경우 망막의 곡률 천정을 향해 구부러 것이다. </li><li> 시신경 유두에서 발산하는 네 잎 클로버의 모양을 만들고, 네 개의 사분면으로 망막을 잘라 작은 가위를 사용합니다. </li><li> 가능한 witho으로 망막이 플랫하게 추가 선인장 바늘과 망막의 사분면 핀스트레칭 유타 (그림 5). </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드의 O / RT에서 N의 3 ml의 실 가드 접시에 고정 된 망막을 수정합니다. </li></ol> 망막의 10 항체 염색 참고 : 기본 및 보조 항체와 얼룩 고정 망막을 망막에 (그림 6) 뉴런을 볼. <ol><li> PBS에서 고정 평면 탑재 망막 2 분 동안 3 회를 씻어. </li><li> 60 분 동안 PBS에서 1 % 소 태아 혈청과 1 % 트리톤 X-100으로 망막 Permeabilize 하시려면. </li><li> 린스 PBS로 세 번, 2 분, 각각, 망막. </li><li> PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> 45 분 동안 실온에서 PBS 중 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소 태아 혈청과 인큐베이션. </li><li> PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> PBS에서 3 ml의 1 % 소 태아 혈청에서 각 망막 부화정제 마우스 항 - 쥐 CD90 / 마우스 CD90.1 (1 : 300 희석) O / RT에서 N. </li><li> 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100로 한번 씻어 망막. </li><li> PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> 보조 알렉사 플 루어 594 염소 항 - 마우스 IgG로 3 ml의 PBS (NO FBS)의 각 망막을 품어 (1 : 300) O / RT에서 N. </li><li> 자유롭게 PBS로 망막을 씻으십시오. </li><li> 해부 현미경을 사용하여 조심스럽게 망막에서 선인장 바늘을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 전송 피펫과 현미경 슬라이드에 망막을 전송합니다. 천장에 직면 망막 신경절 세포 층과 방향을 유지해야합니다. 망막의 반구 모양도 고정 후 주목할 만하다. 망막 신경절 세포 층이 원하는 방향에있는 경우 망막의 곡률 천정을 향해 구부러 것이다. </li><li> 킴 와이프 ​​또는 다른 흡수제로 초​​과 PBS를 흡수한다. 망막을 흡수하지 않도록주의하십시오. </li><li> ½ 글리세롤 5 방울을 추가하고 오전과 같은 중량 PBS 1/2ounting 미디어. </li><li> 공기 방울을 방지 커버 슬립으로 망막을 커버. </li><li> 명확한 매니큐어, 접착제, 또는 다른 접착제를 사용하여 안전 커버 슬립. </li></ol>

저자는 공개할 상충되거나 경쟁되는 이해관계가 없습니다.

이 프로토콜은 생체 내 쥐 모델에서 녹내장과 같은 조건을 유도하는 방법을 설명한다. 이 절차는 29, 32. 흉터 조직을 개발하는 것은 전방에 압력을 증가 방수의 유출 폐색 섬유주에 흉터를 유발하는 고장 성 식염수 주사를 사용합니다. 감소 유출 및 압력 구축으로, 탄성 인대에 의해 중단 렌즈 다시 유리체 챔버로 푸시합니다. 유리체 유머는 깨지기 쉬운 망막 신경 세포의 손상을 망막에 압력을 적용합니다. 이 절차를 사용하여 우리의 결과는 망막 신경절 세포 수를 1 개월 후 절차에 신경절 세포 손실의 상당한 손실 2 주에 줄어들 시작을 보여준다. 이 프로토콜은 설치류에서 녹내장을 유발하는 단 하나의 방법이다. 망막 신경절 세포의 손상은 안압의 증가 또는 직접 D​​A로 인해서 달성하는 많은 다른 실험 모델이있다시신경 (30) 마술사. 종종, 이러한 방법은 더 큰 동물에서 개발하고 마우스 및 쥐 33 응용 프...

녹내장은 구체적으로는, 망막 신경절 세포 1-2, 망막 신경 세포에 영향을 눈 질환 군이다. 이러한 세포의 축삭 비전 인식되고 뇌에 시각 정보를 전달하는 시신경 될 모이다. 망막 신경절 세포 및 축삭 손상 때문에 시각적 결함을 발생합니다. 녹내장 질환과 관련된 주요 특성은 RGC 변성과 죽음, 증가 된 안압 (IOP), 및 광학 디스크 부항과 위축이다. 이러한 기능은 시야 손실 또는 전체, 돌이킬 수없는 시력 상실로 이어집니다. 현재 녹내장은 전 세계적으로 7천만명 3 실명가 발생했습니다. 따라서, 그것은 실명 (4)의 세계에서 세 번째로 큰 원인이다. 녹내장의 RGC 죽음의 정확한 메커니즘은 알 수없는 남아 있습니다. 많은 연구는 신비의 잠금을 해제하기 위해 수행되었다. 녹내장의 주요 위험 인자는 증가 나는 것을 그러나 알려져때문에 눈의 전방에서 수성 유머 (AH)의 불규칙한 순환에 n 개의 안압. AH는 눈의 무혈성 전방에 혈액 투명하고 무색의 대체 역할을합니다. 또한, 주변 셀 영양 대사 과정에서 분비 노폐물을 제거하고, 신경 전달 물질을 수송 및 병적 상태 일 동안 약물과 안구 내 염증 세포의 순환을 허용한다. 방수 순환의 유지 보수는 모양체와 섬유주을 포함한다. 방수는 모양체에 의해 생성된다. 그러므로 안구 조직의 전반적인 건강을 유지하기 위해 전방으로 흐른다. (75) - 유체가 모양체 근육의 해면 조직의 세 가지 레이어를 통해 여과 될 때 방수 유출의 80 %는 적극적으로 비 안료 섬모 상피를 통해 분비된다. 섬유주를 통해 어느 EMPT Schlemm의 운하를 통해 유체 종료(20)에 남아있는 혈액 계 5 국지적으로 이거 - 유출의 25 %는 섬유주를 무시하고 수동적으로 uveo - 공막 경로를 통해 한외 여과 및 확산에 의해 분비된다. 이 경로는 안압 1의 비교적 독립적으로 나타납니다. 방수의 생산과 유출이 균형을 때, 압력은 눈에서 작성합니다. 언급 한 바와 같이, 안압의 증가는 녹내장의 개발에 주요 위험 인자이다. 이러한 압력은 눈 뒤쪽의 망막 신경 세포의 복잡한 층에 손상을 야기한다. 시신경의 망막 신경절 세포의 축삭 손상은 더 이상 정확한 시각 정보를 수신하지 않으려면 뇌가 발생합니다. 그 결과, 시각 인식이 손실되고 완전한 실명이 발생할 수있다. 현재까지 녹내장에 대한 치료가 없습니다. 다른 처리 방법은 주로 안압을 감소시키는 것을 목표로 존재한다. 이러한 국소 포함이러한 베타 - 아드레날린 수용체 차단제, 또는 국소 프로스타글란딘 유사체와 같은 약물 클래스. 베타 차단제는 방수 (7)의 생산을 감소시켜 안압을 감소시킨다. 프로스타글란딘은 방수 8-14의 유출을 증가시킴으로써 IOP를 감소시키는 기능을한다. 알파 아드레날린 성 작용제 및 탄산 탈수 효소 저해제는 또한 보조 치료 방법으로 사용된다. 알파 아드레날린 작용제는 uveoscleral 경로 15-17을 통해 유출을 증가시킨다. 탄산 탈수 효소 저해제는 효소 저해 18 AH의 생산을 감소시킨다. 훨씬 더 침습적 절차는 녹내장을 치료하는 데 사용하고있다. 레이저 섬유주은 방수 (19)의 유출을 증가시키기 위해 사용된다. 섬유주 절제술이라는 또 다른 수술 치료, 전통 소주 경로가 20-21 차단 될 때 AH를 필터링 할 수있는 대안 배수 사이트를 만듭니다. 이러한 치료 방법은 EFF 것으로 알려져ectively 안압을 감소시킨다. 그러나, 녹내장 환자의 40 %가 더 완전한 치료 방법에 대한 필요성을 나타내는 정상 IOP 레벨을 나타낸다. (22, 23)는 또한 그것의 시작과 현재 치료 질환의 진행을 중지하지 일단 녹내장 볼 망막 신경절 세포의 사멸은 비가역 24-28. 이 뉴런 자체의 생존을 타겟팅 효과적인 신경 치료에 대한 필요성을 강조하고있다. 녹내장 모델의 개발이 개발에 매우​​ 중요합니다. 본 연구에서 우리는 원래 모리슨 (29)에 의해 설명 된 절차를 사용하여 변형 성인 긴 에반스 쥐들 녹내장과 같은 효과를 유도하는 방법을 설명한다. 이 과정에서, 상공 막 정맥총에 2 M 고장 성 식염수 주사 안압의 증가 및 망막 신경절 세포의 상당한 손실 w 선도 섬유주에 방수 유출을 줄이기 위해 조직 흉터 녹내장과 같은 조건을 유도절차 30-31 한 달 ithin. 이러한 여기에 설명 된 것과 녹내장 유발 절차, 녹내장 치료의 새로운 발전을 잠금 해제의 열쇠가 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, 최소 99%</td><td>Sigma, 생명과학</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride 주사, USP, 100mg/ml&nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml 병</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>병 세럼 병, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>보로실리케이트 유리</td></tr><tr><td>1 ml 인슐린 주사기&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28G 바늘&nbsp;</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S7653</td><td>2M 솔루션&nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로전극 풀러&nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>헤비 폴리시드 스탠다드 및 얇은 벽 보로실리케이트 튜빙&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>필라멘트 없음, 0.86 mm</td></tr><tr><td>마이크로필 주사기 바늘 채우기 위한 마이크로피펫 World</td><td>Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 게이지 루어-락 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>주사기 바늘</td></tr><tr><td>유연한 폴리에틸렌 튜빙</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>22046941 0.034 인치 직경, 약 10 인치&nbsp;</td></tr><tr><td>프로파라카인 하이드로클로라이드 안과 솔루션, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&nbsp; 멸균 병&nbsp;</td></tr><tr><td>곡선형 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica&nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>지혈 클램프&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>1310912 곡선 가장자리</td></tr><tr><td>트리플 항생제 연고&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 #11</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm 일회용 페트리 디쉬</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 10x 농축</td>액 <td>시그마, 생명 과학&nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1배 희석&nbsp;</td></tr><tr><td>봄 가위</td><td>파인 사이언스 도구&nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>펜치 (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 트랜스퍼 피펫, 폴리에틸렌, 비멸균</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 또는 52947-948</td><td>1 및 2 ml 졸업식</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>선인장 바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>PX0055-3 또는 818715.0100</td><td>4% 용액으로 만든&nbsp;</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마&nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>1% 및 0.1% 용액으로 제작&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청&nbsp;</td><td>애틀랜타 생물학</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>정제 마우스 안티-랫 CD90/마우스 CD90.1</td><td>BD 파밍겐</td><td>고양이 554892</td><td>1:300 희석&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 희석&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>G5516-100 ml&nbsp;</td><td>50% 글리세롤에서 50% PBS, 중량 기준&nbsp;</td></tr><tr><td>커버글라스&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>2975-225</td><td>두께 1 22 x 50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C2 이클립스 Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

녹내장 유도 절차<em&gt; 생체</em&gt; 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

녹내장은 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)에 영향 중추 신경계 질환이다. 시신경을 구성하는 RGC 축삭은 시각적 인식에 대한 뇌 영상 입력을 수행한다. 망막 신경절 세포 및 축삭 손상은 시력 상실 및 / 또는 실명에 이르게. 녹내장의 특정 원인 불명이지만, 병의 주 위험 인자 안압 상승이다. 동물 모델에서 녹내장 유발 절차는 RGC 죽음의 메커니즘을 공부하는 연구자들에게 유용한 도구입니다. 이러한 정보는 시력 상실의 예방에 도움이 있었다 효과적인 신경 보호 치료제의 개발로 이어질 수있다. 2 M 고장 성 식염수 50 μL가 상공 막 정맥총 주입되는 생체 래트 모델에서와 같은 조건 -이 문서에서 프로토콜 녹내장을 유도하는 방법을 설명한다. 선박의 창백 성공적인 주사를 나타냅니다. 이 절차는 녹내장을 시뮬레이션하는 망막 신경절 세포의 손실이 발생합니다. 다음 한 달주입, 동물 희생하고 눈은 제거됩니다. 다음으로, 각막, 렌즈, 유리체는 아이 컵을 제거한다. 망막은 안구의이면으로부터 박리 선인장 바늘을 사용하여 실 가드 접시에 고정된다. 이 시점에서, 망막 신경 세포 분석을 위해 염색 할 수있다. 이 실험의 결과는 내부 통제에 비해 망막 신경절 세포의 약 25 %가 절차의 1 개월 이내에 손실 된 것으로 나타났다. 이 절차는 생체 녹내장 래트 모델의 망막 신경절 세포 사멸의 정량 분석을 허용한다.

이 섹션은 생체 녹내장 래트 모델 녹내장과 같은 조건을 유도하기 위해 사용되는 장치 구성 요소 및 방법을 도시한다. 우리는 안압의 증가를 일으키는 고장 성 식염수 주입을 수행하는 데 사용되는 개별 도구 및 장치를 나타낸다. 우리는 그 특성 창백 효과와 결과 전방의 흐린 외관 상공 막 정맥 얼기에 주사를 보여줍니다. 우리는 또한 망막 제거 및 손실 망막 신경절 세포의 분석을 위해 평면 설치하는 과정을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 망막 신경절 세포의 생존에 대한 주입의 효과를 나타낸다. 망막 신경절 세포의 분포가 래트 망막의 상이한 영역에 요철로서, 이미지 4mm 얻어 시신경 유두의 중심으로부터 각각의 망막, 네 개의 200 ㎛의 2 영역으로부터 획득된다. 각 섹션의주의 1.1 표지 망막 신경절 세포의 총 수는 실험 및 제어 방식에서, 계산 평균과 비교<html> 올 31 망막. 이 방법을 사용 RGC 카운트 (N...

녹내장은 망막 신경절 세포의 손상이 특징입니다. 동물 모델에서 녹내장을 유도하면 이 질병에 대한 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 생체 내 쥐 모델에서 망막 신경절 세포의 소실을 유도하고 분석을 위한 전체 마운트 망막의 준비를 보여주는 절차를 간략하게 설명합니다.

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

이 절차의 전체적인 목적은 녹내장과 유사한 조건을 유도하여 쥐의 망막에서 망막 신경절 세포의 상당한 손실을 일으키는 것입니다. 이 방법은 녹내장 및 신경 보호 분야의 주요 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간의 녹내장에서 관찰되는 것과 유사하게 망막 신경절 세포의 점진적인 손실을 유발한다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 마이크로전극 풀러(microelectrode puller)를 사용하여 연마된 표준 박벽 붕규산 유리관(Borosilicate Tube)에서 가늘게 테이퍼진 유리 마이크로니들을 두 개 뽑아냅니다. 그런 다음, 1 mL 주사기를 사용하여 마이크로니들 하나에 2 M 식염수를 역충전합니다. 전극 끝단에서 기포를 톡톡 쳐서 제거합니다.다음으로, 두 번째 1 mL 주사기에 2 M NaCl을 채웁니다. 이를 18 게이지 바늘에 연결한 후, 바늘을 10인치 폴리에틸렌 튜브에 부착합니다. 주사기 플런저를 사용하여 바늘을 통해 폴리에틸렌 튜브 내부에 식염수를 채웁니다.마이크로니들과 튜브가 모두 식염수로 채워지면, 두 장치를 조심스럽게 연결합니다. 연결 부위를 가볍게 두드려 기포를 제거함으로써 내부의 공기를 완전히 없앱니다. 그 다음, 마이크로니들 팁을 페이퍼 타월에 가볍게 긁어 끝부분을 미세하게 베벨 처리합니다.종이 타월 위로 액체가 가느다란 줄기로 보일 때까지 주사기의 플런저를 천천히 밀어 마이크로니들의 저항력을 확인합니다. 바늘 끝의 적절한 무결성을 보장하기 위해 액체 줄기의 너비는 0.5 밀리미터 이하여야 합니다. 이 절차에서는 KAX 칵테일로 동물을 마취한 후, 동물의 발이나 꼬리를 꼬집어 반사 반응을 확인함으로써 동물이 의식 없는 상태인지 확인합니다.그 다음, 가위로 수염을 다듬습니다. 이어서 면봉에 베타딘 용액을 적셔 실험 대상인 눈 주변 부위를 닦아냅니다. 현미경 하에서 지혈鉗子(hemostat)를 사용하여 아래 눈꺼풀을 집어 안구를 돌출시키고, 공막 정맥을 노출시키며, 안구의 움직임을 제한합니다.다음으로, 마이크로니들을 정맥과 10도에서 20도 사이의 각도로 하여 공막 정맥을 조심스럽게 찌릅니다. 혈액이 마이크로니들 팁으로 들어오는 것이 관찰되면 정맥 천자가 성공적으로 이루어진 것입니다. 50 µL의 식염수를 정맥 내로 천천히 주입합니다.염액이 혈관계를 통해 순환함에 따라 혈관이 하얗게 탈색되지만, 일부 영역은 핏빛 빨간색을 유지할 수 있습니다. 이 과정에서 가장 중요한 단일 단계는 2M 염화나트륨 용액을 주입할 때 발생합니다. 성공적인 결과를 보장하기 위해서는 혈관 내에서 탈색이 반드시 일어나야 합니다.이 절차에서는 바늘을 안정적으로 유지하고 20도 각도를 유지하는 것이 매우 중요합니다. 그 후, 망막 신경절 세포층이 충분히 손상되도록 정맥에 두 번째 주사를 실시하십시오. 염분이 혈관계를 통해 순환함에 따라 수 분 내에 눈의 홍채를 통해 뚜렷하게 흐릿해진 모습이 관찰되어야 합니다.이제 메스를 사용하여 안구를 둘러싸고 있는 안와강의 결합 조직을 절개하되, 안구 자체가 손상되지 않도록 주의하십시오. 그다음, 곡선 가위로 시신경과 남은 조직을 조심스럽게 절단하여 손상되지 않은 안구를 적출합니다. 적출한 안구를 신선한 PBS가 담긴 멸균 페트리 접시에 넣으십시오.다음으로, 홍채와 공막 사이의 경계 바로 뒤쪽을 메스로 작게 절개하여 안구에서 안컵(eye cup)을 만듭니다. 안구 둘레를 따라 절개를 계속하여 안구에서 각막 반구를 제거합니다. 핀셋으로 망막의 색소층을 잡아 안컵을 고정시킨 후, 다른 핀셋을 사용하여 분홍빛 베이지색의 온전한 망막 전체를 안구 뒷면에서 조심스럽게 떼어냅니다.그 후, 시신경이 망막에 부착된 부위를 절단하거나 집어 떼어냅니다. 망막에서 남아 있는 색소 상피 또는 공막 조직을 반드시 완전히 제거하십시오. 그런 다음, 분리된 망막을 신선한 PBS가 담긴 깨끗한 Sylgard 코팅 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다.Sylgard 디시에 안착시킨 후, 망막을 핀으로 고정합니다. 망막 신경절 세포층이 위를 향하게 하고, 시신경은 아래를 향하게 유지합니다. 다음으로, 시신경 유두로부터 방사형으로 뻗어 나가는 네잎클로버 모양이 되도록 망막을 4분면으로 절개합니다.그 다음, 망막의 4분면을 추가적인 선인장 가시로 고정하여 망막을 늘리지 않으면서 최대한 평평하게 폅니다. 이후, 표준 염색 과정을 수행하기 전, 고정된 망막을 3 mL의 4% paraformaldehyde가 담긴 Sylgard 디쉬에 넣고 실온에서 하룻밤 동안 고정합니다. 여기는 녹내주 유도 식염수 주입 1개월 후의 대조군 미처리 안구와 실험군 안구의 비교 모습입니다.망막 신경절 세포는 Thy 1.1 항체를 이용해 표지되었습니다. 이 절차는 RGC 수의 감소, 주요 축삭 다발에서 축삭의 탈다발화, 그리고 남아있는 RGC의 원형도 왜곡을 유발합니다. 이들은 식염수 주입으로 인해 나타나는 전형적인 탈다발화 축삭들입니다.망막 내의 혈관과 축삭 다발이 보입니다. 이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 신선하고 날카로운 베벨형 마이크로니들을 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차 이후에는 망막 신경절 세포의 소실이 동물의 시력에 어떤 영향을 미치는지와 같이 녹내장과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 면역세포화학, 웨스턴 블롯, 인시튜 하이브리다이제이션, mRNA 시퀀싱 또는 행동 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 개발된 이후, 녹내장 분야의 연구자들은 쥐에서 신경 보호 전략을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 상공막 정맥에 고장성 식염수를 주입하여 쥐의 망막 신경절 세포의 상당한 소실을 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Bosco, A., et al. In vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma(신경 퇴행 중 망막 미세아교세포 활성화의 생체 내 역학: 마우스 녹내장의 컨포칼 안과 영상 및 세포 형태 측정).   J. Vis. 특급 (2015년) 이 비디오는 녹내장의 마우스 모델에서 망막 미세아교세포의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 형광 단백질 발현 망막 미세아교세포를 가진 형질전환 마우스가 검안경 아래에 위치합니다. 적외선 조명은 시신경두(ONH)를 찾는 데 사용되며, 초점면은 망막 혈관을 랜드마크로 사용하여 설정됩니다. 그런 다음 형광 미세아교세포를 시각화하기 위해 형광 이미징을 사용합니다. 세포체가 커지고 분지 복잡성이 감소하는 것을 특징으로 하는 활성화된 미세아교세포를...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

여기서는 관찰 녹내장, 망막 신경절 세포의 손실을 초래 쥐 눈 안압을 유도 프로토콜을 제시한다. 자기 마이크로 비드는 전방에 주입과 방수의 유출을 차단하는 자석을 이용하여 홍채 각막 각도에 매료된다.

자기 마이크로 비드 폐색 모델 마우스의 녹내장 안구 고혈압 종속 유도합니다

다음 보고서는 적절한 염료, 콘택트렌즈 및 레이저 매개변수를 사용하여 비동맥 전방 허혈성 시신경병증(rNAION)의 설치류 모델을 복제하는 방법을 설명합니다. 또한 in vivo에서 rNAION 병변을 평가하기 위한 적절한 단계를 밝힙니다.

Nonarteritic 전방 허혈성 시신경 병증의 설치류 모델 (rNAION)

이 프로토콜 wholemount 쥐 망막에서 생체 외에서 신경 전달 물질 글루타민 산 염의 화학 신경의 형태를 조사 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 화학 신경 망막의 포토 리셉터 퇴행 성 질환으로 인 한 돌이킬 수 없는 실명을 치료에 대 한 기존의 전기 통제에 유망한 대안 이다.

쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론

쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo 섹션, 전체 마운트 및 혈관 네트워크의 침투성 절연의 immunohistochemical 시각화를 위한 3 개의 다른 조직 준비 기술을 설명합니다.

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

만성 안구 고혈압 쥐와 쥐, 일치 녹 내장 망막 신경 절 세포의 기능 및 구조 저하로 이어지는 circumlimbal 봉합을 적용 하 여 유도 된다.

쥐와 쥐에 Circumlimbal 봉합에 의해 유도 된 녹 내장의 모델

산소 유발 망막병증(OIR)은 미숙아 및 증식 성 당뇨병 망막증의 망막병증과 같은 허혈성 망막 질환을 모델링하고 신생아 질환에 대한 항 혈관 신생 약물을 평가하는 개념 증명 연구의 모델로 사용될 수 있다. OIR는 정량화 될 수있는 망막에서 견고하고 재현 가능한 신생 혈관화를 유도합니다.

설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형

당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

학습하세요 쥐 망막 신경절세포 손실을 유도하는 녹내장 동물 모델 수술법을. 외막정맥 고삼염수 주사로 RGC 손실을 일으키고 전체 마운트 망막 준비를 통해 신경 보호 전략 연구에 활용할 수 있습니다.

녹내장 유도 절차

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