Name: 유방암에서 에스트로겐 수용체 신호 전달에 의해 대사 규제 시스템 생물학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 학습하세요 유방암에서 ER Alpha에 의한 대사 규제 메커니즘을 전사체, 시스트롬, 대사체 데이터 통합으로 분석하는 방법을. MCF7 세포 배양 및 다중 오믹스 기법을 활용한 종양 대사 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 식량 농업 연구소, 농업의 미국학과, 수상 ILLU-698-909 (ZME)과 화이자, Inc의 (ZME)에서 보조금에 의해 지원되었다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 농무부의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

RNA-SEQ 샘플 1. 준비 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 문화 개선 MEM (IMEM)을 더한 10 %의 열 불활성 FBS, 1 % 페니실린 / 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 스트렙토 페놀 레드 배지에서 MCF7 세포. 참고 : 동일한 세포주 및 세포 배양 조건을 연구 전반에 걸쳐 사용된다. </li><li> 6 웰 플레이트에 잘 당 종자 10 만 MCF7 세포. 각각의 치료를위한 삼중있다. 3 일에, 매체를 제거하거나 잘 각각 10 -8 M E2없이 2 ml의에게 신선한 매체를 추가합니다. 가습 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 세포 수확을 위해, 각 웰에 1 ml의 RNA 분리 시약 (산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름)를 첨가하고, 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양. 그 후 1.5 ㎖의 튜브에 피펫 예금 의해 파쇄 시약 수집 </li></ol></li><li> RNA 분리 <ol><li> 200 μL chlorofo 추가10 초 동안 1 ml의 세포 용 해물 시약 (1.1.3)와 소용돌이에 RM. 실온에서 5 분간 인큐베이션. 4 ℃에서 15 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기 샘플. 원심 분리 후, 다른 단계를 방해하지 않고 새로운 튜브로 수성 단계 (위)를 전송합니다. </li><li> 전송 된 수성 위상 새로운 튜브에 500 ㎕를 100 % 이소프로판올을 추가하고 반전 섞는다. -20 ° C에서 밤새 품어. 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 튜브의 하단에 펠렛을 관찰한다. 뜨는을 취소하고 간단한 소용돌이에 의해 750 μL의 RNase없는 70 % 에탄올로 펠렛을 씻는다. </li><li> 원심 분리기 샘플 4 ° C에서 5 분 6,000 XG에. 상층 액을 제거하고 나머지 모든 에탄올을 수집하기 위해 4 ° C에서 1 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 10 분 동안 공기 건조에 이르기까지 측 튜브를 겔 로딩 팁 피펫으로 남아있는 에탄올을 제거하고 설정합니다. 에 의존적 20 ~ 50 μL DEPC 처리 수의 펠렛을 해산펠렛의 크기에 땡. </li></ol></li><li> 프로토콜 4 다음 RNA 정화 키트를 사용하여 RNA를 정제 하였다. 프로토콜 9 따르는 대해 형광 계 분석 키트를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. 주 : 260 nm에서의 OD는 260 nm에서 OD RNA의 농도 및 비율을 결정하기 위해 수행되며, 280 nm의이 샘플의 순도를 결정하기 위해 사용된다. 이는 바이오 분석기 분석을 사용하여 RNA 품질 검사를 권장합니다. </li><li> 시퀀싱 약 0.5-1 μg의 정제 된 RNA를 가져 가라. 참고 : 생명 공학 센터 시퀀싱 라이브러리를 준비하고 쌍 엔드 이전에 2 상세한 방법을 사용하여 염기 서열을 읽어 수행한다. </li></ol> 칩-SEQ 샘플 2. 준비 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 씨앗 성장 매체에서 10cm 접시 당 50 만 MCF7 세포. 참고 : 각각의 풀다운은 16 판을 사용 하였다. 3 일에, 배지를 제거하고 또는 각 10 -8 M E2없이 5 ml의에게 신선한 매체를 추가플레이트. 45 분 (가습 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C)에 대한 세포 치료. </li></ol></li><li> 가교 및 세포 수확 <ol><li> 염색질 가교 실온에서 15 분 동안 배양 5 ㎖ 매체에 250 μL의 37 % 포름 알데히드를 추가한다. 5 ml의 얼음 차가운 1X MEM으로 세포를 세척하여 가교 중지합니다. </li><li> 플레이트 당 250 ㎕의 세포 용해 완충액 (10 mM의 EDTA, 50 mM의 트라이 HCl을 1 % SDS, 0.5 % N, N-dimethyldodecan -1- 아민 옥사이드)에서 세포를 수확. </li></ol></li><li> 염색질의 분열 <ol><li> 염색질 필요한 크기에 도달하는 30 A, 30 초 X 8 세포를 초음파 처리. 30 sec의 초음파 후 얼음에 각각의 샘플을 쿨. </li><li> 원심 분리기 16, 000 4 ° C에서 10 분 동안 XG, 조심스럽게 하단에있는 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 피펫. </li><li> 상층 액의 5 μL 나누어지는을 가지고, 이전 10 설명 된대로 1.5 % 아가 로스 젤을 통해 전기 영동에 의해 DNA의 크기를 확인합니다. 이상적인 크기DNA의 200 ~ 500 bp의 사이에 있어야한다. </li></ol></li><li> 크로 마틴 면역 침전 <ol><li> 입력으로 세포 용 해물 25 μl를 저장합니다. 50 ㎖의 튜브에 20 ㎖의 IP 버퍼 (2 mM의 EDTA, 100 mM의 염화나트륨, 20 mM의 트리스 -HCl 및 0.5 % 트리톤 X) ERα 항체 (500 μL의 F10 500 μL와 세포 용 해물의 4 ml의 혼합 cell에서 reverse 20) 500 μL와 동지 ProtG 단백질 자성 비드 코팅. chromatin- 항체 복합체의 형성을 허용하기 위해 4 ℃로 밤새 회전에 의해 상기 혼합물을 인큐베이션. </li></ol></li><li> 세척과 역 가교 <ol><li> 세척 완충액을 제거하기 위해 자화 측의 자성 비드를 수집하는 자기 받침대를 사용한다. </li><li> 25 ml의 세척 완충액으로 세척 자성 비드 I (2 mM의 EDTA, 20 mM 트리스 염산 01 % SDS, 1 % 트리톤 X 및 150 mM의 염화나트륨). 철저하게 25 ml의 모든 자성 비드가 혼합 잘 위스콘신 때까지 다음 튜브를 반전 측면을 따라 튜브에 천천히 버퍼 씻어 추가, DNA - 단백질 복합체를 방해하지 않고 자기 구슬을 씻어펠릿으로 나타나지 않고 세척 완충액을 토륨. 다른 방법으로, 튜브를 반전하는 회 전자를 사용한다. 샘플 와동하지 마십시오. 다음 단계에서 동일한 방법을 이용하여 상기 자성 비드를 세척 하였다. </li><li> 25 ml의 세척 버퍼 II (2 mM의 EDTA, 20 mM 트리스 염산 01 % SDS, 1 % 트리톤 X, 500 mM의 염화나트륨)에 자기 구슬을 씻으십시오. </li><li> 25 ml의 세척 버퍼 III에 자석 구슬을 씻으 (1.6 mM의 EDTA, 10 mM 트리스 염산, 1 % NP-40, 1 % Dexycholate 250 밀리미터의 LiCl). </li><li> 두 번 25 ㎖의 1X TE 완충액 (1 mM의 EDTA, 10 mM 트리스 염산)에 자석 구슬을 씻으십시오. </li><li> 500 ㎕의 용출 완충액에서 DNA를 용리 (1 % SDS, 10 mM의 NaHCO3을), 그리고 (4) 튜브에 500 ㎕의 DNA 용출을 할당. 입력으로부터의 DNA의 경우, 125 ㎕의 용출 완충액에서 DNA를 용출시킨다. </li><li> 가열 블록에서 밤새 65 ℃에서 인큐베이션 튜브. 심지어 모든 튜브를 통해 열을 유지하기 위해 알루미늄 호일로 가열 블록 튜브 커버. 개방에서 그들을 유지하기 위해 튜브에 무게를 둡니다. &lt;/ 리&gt; </ol></li><li> DNA 분리 <ol><li> 5 분간 RT에서 튜브를 냉각시키고. 칩 DNA 분리 키트를 이용 풀다운 시료로부터 DNA를 분리. 제조업체의 지시 사항을 따르십시오. <ol><li> 65 ℃에서의 용출 완충제를 워밍업. 각 튜브에 결합 완충액 625 μl를 추가합니다. 용액이 선명해질 때까지 침전물을 형성하는 경우, 또 다른 250 μL 바인딩 버퍼를 추가합니다. </li><li> 30 초 동안 16,000 XG에서 열 원심 분리기 상에 샘플을로드합니다. 250 μL 세척 버퍼와 샘플을 씻으십시오. 처음 사용하는 경우에 세척 완충액에 에탄올을 추가해야. 세탁을 반복합니다. </li><li> 15 ㎕의 용출 완충액에서 DNA를 용출시킨다. 동일의 DNA는 약 55 μl의 DNA를 달성하기 위해 4 관에서 풀다운 결합합니다. </li></ol></li><li> 하는 DNA 정제 키트를 사용하여 입력 DNA를 분리. <ol><li> 65 ℃에서의 용출 완충제를 워밍업. 각각의 튜브에 625 μL 바인딩 버퍼를 추가하고 10 분 동안 품어. 2 ML의 collecti에 컬럼에 샘플을로드튜브. </li><li> 1 분 동안 16,000 XG에 750 μL 세척 버퍼, 원심 분리기와 샘플을 씻으십시오. 남아있는 버퍼를 제거하기 위해 원심 분리를 반복합니다. EB 30 μL로 DNA를 용출시킨다. </li></ol></li><li> 수정 (11)와 상업 형광 색소 분석을 사용하여 DNA 농도를 측정한다. <ol><li> 시약 및 DNA 샘플을 희석 세이 버퍼로 1X TE로 20 배 TE 버퍼를 희석. 5 μL를 격리 DNA를 가지고 1X TE 50 μL로 희석. </li><li> 2 μg의 / ㎖ DNA 스톡 용액으로부터 빈 1, 10, 100, 1000 μg의 / ㎖ 범위의 DNA 표준을 만든다. 96 웰 플레이트에서, 25 각 표준의 μL뿐만 아니라 중복의 DNA 희석을 할당합니다. (표준 세중 권장합니다.) </li><li> 플라스틱 튜브로 1X TE 완충액 dsDNA 시약에서 200 배 희석함으로써 작업 시약을 준비한다. 광을 피하기 위해 알루미늄 호일로 작업 시약 용액을 커버. 각 샘플에 시약을 작업 200 μl를 추가합니다. 에서실온에서 5 분간 cubate. 빛을 피하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버. </li><li> (480 nm의 방출은 520nm에서 여기)를 형광 플레이트 판독기를 사용하여 샘​​플의 형광을 측정한다. DNA 농도에 비해 개화의 DNA 표준 곡선을 생성합니다. 생성 된 DNA를 표준 곡선에 기초하여, 시료의 농도를 결정한다. </li></ol></li></ol></li><li> qPCR에 사용 칩 실험의 검증 <ol><li> DNA를 분리하고 물에 20 μL로 희석 2 μl를 가져 가라. 2.5 ㎕의 DNA 희석, 5 ㎕를 그린 I PCR 마스터 믹스, 1 μL 프라이머, 1.5 μL 클레아없는 물을 혼합하여 세중의 qPCR에 반응을 설정합니다. </li><li> 다음과 같은 프로그램을 사용하여 빠른 리얼 타임 PCR 시스템으로 qPCR에를 실행 1 단계 : 95 ° C 60 초, 단계 2 : 60 초, 2 단계를 반복 39 회 10 초 95 ° C, 60 ° C. </li></ol></li><li> 시퀀싱 생명 공학 센터 10 NG의 DNA 샘플을 보낼 수 있습니다. 참고 : BIOTEC시간 센터는 지시에 따라 라이브러리에 칩 DNA를 준비하고, 이전에 2 상세한 방법을 사용하여 하나의 읽기 순서를 수행한다. </li></ol> 3. 대사 체학 분석 샘플 준비 <ol><li> 세포 배양 및 치료 <ol><li> 씨앗 성장 매체에서 10cm 접시 당 40 만 MCF7 세포. 각각의 치료를 위해 3 개의 시료를 준비합니다. 검출을위한 충분한 세포를 받기 위해 각 샘플에 두 접시를 사용합니다. 3 일에, 배지를 제거하고 세포 또는 10-8 M E2없이 5 ml의에게 신선한 매체를 추가합니다. 24 시간 (가습 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C)에 대한 세포 치료. </li></ol></li><li> 샘플 컬렉션 <ol><li> 플레이트에 PBS 1X 5 ml의 얼음 차가운 추가 간략 판을 여러 번 틸팅 후 PBS를 대기음. 두 번 반복하고, 마지막 세척 후 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. </li><li> 각각의 판에 미리 차가운 아세톤 750 μl를 추가하고 세포를 긁어. 두 플레이트로부터 아세톤 세포 수확기얼음에 2 ML 튜브에. </li><li> 정상화 세포 수 <ol><li> 각각의 치료를위한 세포 정량이 추가 플레이트를 사용합니다. 하려면 플레이트에서 세포를 탈 부착 HE 각 플레이트에 (1X HBSS, 10 mM의 HEPES, 0.075 %의 NaHCO3, 1 mM의 EDTA)를 버퍼 및 5 분 동안 품어 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 수집하고 HE 버퍼에 세포를 피펫 팅하여 잘 세포를 섞는다. 혈구를 사용하여 세포 수를 계산하는 20 ㎕의 세포 용액의 총을 사용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 식별하고, 가스 크로마토 그래피 질량 분석법 (GC-MS) 분석을 이용하여 대사 물질을 정량 할 대사 체학 센터로 전송하기 전에 -80 ° C에서 샘플들을 저장한다. </li></ol> 4. 통합적인 분석 <ol><li> RNA-서열 데이터 분석 : <ol><li> FastQC를 사용하여 FASTQ 파일의 품질 검사를 수행 읽기 QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> FastQC를 선택 NGS의 도구에서 읽기 : 품질 관리 및 조작. 현재 histor에서 원시 데이터 파일을 업로드와이. 참고 : 출력 파일 작업이 다중 출력이있을 수 있으므로에 대해 무엇을 생각 나게하는 제목을 제공하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 실행하고 출력 파일은 역사에 표시됩니다. 각 시퀀스 파일에 대한 동일한 절차를 반복한다. FASTX 툴킷 : NGS에서 클립을 사용하여 트림 어댑터. </li><li> 정렬이 나온 RefSeq 게놈 참조 주석 12 (기본값)으로 Tophat2를 사용 hg19을 읽습니다. <ol><li> NGS의 도구에서 Tophat2을 선택 RNA 분석. 라이브러리 쌍 유형 (쌍 엔드 대 단일 엔드)을 표시합니다. </li><li> 현재 역사의 입력 FASTQ 파일을 업로드합니다. 참조 게놈을 선택합니다. 기본값으로 설정을 선택합니다. 또는 수정 전체 매개 변수 목록을 사용합니다. </li><li> 실행하고 두 개의 출력 파일을 생성합니다 : 하나의 접합의 UCSC 침대 곡을; 다른 하나는 BAM 형식으로 읽기 정렬의 목록입니다. </li></ol></li><li> 시퀀싱 데이터 분석 도구에 BAM 파일을 업로드합니다. 정량적하여 식 값을 계산형 치수 도구. </li><li> 기본값을 사용하여 표현 분석 도구를 사용하여 차등 상향 조절 유전자를 확인하고 변경&gt; 2, p 값이 &lt;0.05 배. 마찬가지로, 기본값을 사용하여 표현 분석 도구를 사용하여 차등 하향 조절 유전자를 식별하고 변경 &lt;0.5 p- 값 &lt;0.05 배. </li></ol></li><li> 칩 - 서열 데이터 분석 : <ol><li> 정렬 FASTQ 갤럭시에 Bowtie2 13 (기본값)를 사용하여 hg19에 읽어들입니다. <ol><li> NSC의 도구에서 Bowtie2를 선택 매핑. 라이브러리가 동료-쌍 (쌍 엔드 대 단일 엔드) 인 경우 확인합니다. 현재의 역사에서 FASTQ 파일을 업로드합니다. </li><li> 참조 게놈을 선택합니다. 기본 매개 변수 설정을 사용합니다. 실행 및 매핑 순서가 BAM 파일로 읽어와 출력 파일을 생성합니다. 모든 시퀀스 파일에 대해이 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 이전에 2 설명 된 바와 같이, MACS (14) 6.0E-7의 p- 값 컷오프 0.01의 FDR을 사용하여 봉우리를 식별합니다. </li></올&gt; </li><li> 대사 체학 데이터 분석 : <ol><li> KEGG_IDs에 대사 산물의 화학 이름을 변환합니다. </li><li> VS. E2 차량 검출 레벨을 비교하여 차별적으로 조절 대사를 확인하고 (2 배 컷오프가 본 연구에 사용 된) 샘플을 처리 하였다. </li></ol></li><li> 통합 분석 : <ol><li> 시퀀싱 데이터 분석 도구를 사용하여 ERα 결합 부위가 유전자를 식별합니다. 거리의 차단으로 20킬로바이트를 사용하여 유전자 기능에 지역을 번역합니다. </li><li> 차단으로 각각 p- 값 &lt;0.05로, 배 변경&gt; (2)를 사용하여 RNA-서열 데이터 분석에서 차동 위쪽 및 아래쪽 조절 유전자를 확인하고 변경 &lt;0.5 배. 벤 다이어그램을 비교하여 ERα 바인딩 사이트를 함유하는 유전자의 목록과 비교한다. </li><li> Cytoscape의 Metscape 15 모듈을 사용하여 E2 변조 대사 경로를 식별하기 위해이 목록을 사용합니다. <ol><li> 앱 Metscape 모듈을 선택하여 네트워크 다음 경로-BAS 빌드 선택에드 옵션을 선택합니다. </li><li> 유기체 (인간)을 선택합니다. E2 제어형 화합물 목록 선택 데이터 파일 (KEGG ID)는도 E2 유전자 목록을 조절. </li><li> 네트워크 유형으로 -Reaction -Enzyme - 유전자 및 화합물 선택합니다. 쿼리와 같은 화합물 / 유전자를 선택합니다. </li><li> 네트워크를 구축 할 수 있습니다. E2를 하향 조절 화합물 및 유전자를 사용하여 반복합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

일리노이 대학은 화이자 ZME에서 탐정 개시 허가를받은 YCZ이 기금에서 급여 지원을 받았다.

본 논문에서는 E2로 치료 MCF-7 세포에서 생성 및 RNA-서열, 칩 - 서열 및 대사 체학 데이터의 통합 분석을 설명했다. 우리는 생물학적으로 중요한 발견을 생산하는 가장 효율적인 방법과 사용자 친화적 인 부드러운 상품을 활용하는 전략 수립 프로토콜을 개발. 우리의 지식으로, 우리는 세 가지 분석 ERα 직접 유방암 세포 규제 식별 새로운 대사 경로에서 -omics 데이터를 통합하는 최초의 연구이다. Transcriptomics 성공적인 transcriptomic 분석을위한 고품질의 RNA를 시작하는 것이 중요합니다. 좋은 방법은,의 RNase없는 벤치를 만들어 자주 장갑을 변경, C °에서 -80 저장하고 사용 얼음에 유지를 포함하여 RNA 분해의 가능성을 제거합니다. -20 ºC에서 하룻밤 배양의 추가는 RNA 복구를 향상시킨다. 반복 동결 융해의 RNA를 방지하기 위해, 하나는 다운 스트림 procedur의 RNA를 할당 할 수단리 및 정제시 에스. 시...

에스트로겐은 생식 조직, 대사 조직, 뇌와 뼈 하나를 포함하여 모두 여성과 남성의 많은 생리 학적 과정의 중요한 규제입니다. 이 조직에서의 유익한 효과에 더하여, 에스트로겐은 유방 및 생식 조직에서 발생하는 암을 구동한다. 에스트로겐은 주로 세포 유형 특정한 효과를 유도 ERS를 통해 작동한다. 칩-서열을 이용하여 RNA-서열 및 게놈 전체 ERα DNA 결합 부위 분석을 사용 ERα에 의해 규제 성적 증명서의 깊은 순서는 ERα 그들로부터 발생하는 다른 조직과 암에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 유용한 것으로 입증되었다. 우리와 다른 유전자 발현 (ERβ 대 ERα) 다른 수용체와 관련된 프로파일 2, 3, 다른 리간드 3-5 다른 coregulators 2,4,6,7를 발표했다. RNA-서열은 마이크로 어레이 바에 비해 높은 정밀도와 효율성을 제공하는 전 사체를 검사하는 주요 방법입니다SED의 유전자 발현 분석 (8). 세포주 2-4,7, 조직 또는 종양 샘플에서 얻은 RNA 게놈이 가능한 어셈블리에 매핑 서열화되고 차등 조절 유전자 식별된다. 염색질 면역 침전 (칩)은 알려진 규정 결합 부위에 결합하는 전사 인자와 coregulator 염색질을 해부하기 위해 사용된다. 칩-SEQ (높은 처리량 시퀀싱 뒤에 칩)는 글로벌 결합 부위의 편견 검출을 제공한다. 대사 체학은 다른 점점 사용하는 시스템 생물학 접근, 정량적으로 측정, 화학 물질 및 유전 적 교란 등의 다양한 자극에 살아있는 시스템의 동적 multiparametric 반응이다. 글로벌 대사 프로파일 링을 수행하여, 판독 기능은 세포, 조직 및 혈액에서 수득 할 수있다. 또한, 사체 실험에​​서 정보는 항상 생화학 적 경로에 기여하는 효소의 수준에서 실제 변화를 반영하지 않습니다. 결합 된사체 및 대사 체 데이터의 분석을 확인하고 실제 대사 산물의 변화와 유전자 발현의 변화의 상관 관계를 우리에게 있습니다. 이러한 대규모 데이터 집합은 기계적 세부 사항을 제공 모두로부터 정보를 모으고 복잡한 생물학적 시스템, 인간 발달과 암, 당뇨병과 같은 질환들에 관련된 특히 조절 전사 인자의 역할을 이해한다. 포유 동물 게놈의 복잡한 본질은 도전 통합 완전히 사체, cistrome 대사 체 및 실험으로부터 얻은 데이터를 해석 할 수있다. 일단 기능적 결합 부위가 확인되어 있기 때문에 표적 유전자의 발현에 중요한 변화를 초래할 것이다 기능적 바인딩 이벤트를 식별하는 단계; 전사 바인딩 (TF) 모티브 분석을 포함, 분석 계속되는, 높은 정밀도로 수행 될 수있다. 이는 생물학적으로 의미있는 TF 캐스케이드 및 메커니즘의 식별을 이끈다. 또한 직접 comparis각 실험의 데이터가 저울과 소음을 다른 어떤 경우에는 의미있는 신호가 인구 노이즈에 의해 가려하는이 있기 때문에 RNA-서열 및 칩-SEQ 실험에 항상 가능한 것은 아니다. 우리는 유방암에 ERα에 의해 직접 신진 대사 조절을 이해하는 세 가지 독립적이지만 관련 접근 방식에서 정보를 통합하는 연구의 인식하지 못합니다. 따라서, 본 논문에서 우리의 전반적인 목표는 유전자 발현 및 대사 산물의 변화에​​ 생산 바인딩 이벤트를 관련하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해, 우리는 RNA-SEQ 칩-SEQ와 대사 체학 실험으로부터 데이터를 통합 및 대사 경로에서의 유전자 발현 변화를 야기 할 이벤트를 결합 ERα 유도 이러한 에스트로겐을 확인 하였다. 처음으로, 우리는 유방의 대사를 조절하는 신규 한 유전자 회로를 밝히기 위해서 칩 서열, RNA-SEQ와 대사 체학 프로파일을 생성하고, 상기 데이터의 통합 분석을 수행하기위한 프로토콜 (도 1)의 완전한 세트를 제공 할암 세포주.

<table><tbody><tr><td>트리글리세라이드 믹스</td><td>시그마</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>올레산&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>올레산-수용성 분말&nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>생명 기술&nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Life 기술&nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life 기술&nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>입력 샘플의 DNA 분리&nbsp;</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA 분리 키트&nbsp;</td><td>자이모 리서치&nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA 클린 & 농축기</td></tr><tr><td>Quant-iT&ordf; 피코그린&uml; dsDNA 어세이 키트</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P7589</td><td>DNA 정량</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase 세트</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA 정제</td></tr><tr><td>DEPC 처리된 물&nbsp;</td><td>LIFE TECH</td><td>462224</td><td>Dnase/Rnase Free</td></tr><tr><td>Model 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB120110</td><td>1/8 프로브&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; 피셔 사이언티픽 사운드 인클로저</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>소음 감소용</td></tr><tr><td>&nbsp; Eppendorf 튜브 5.0 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 튜브 (2 봉지 100 개)</td></tr><tr><td>랜덤 프라이머 믹스&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV 역전사효소</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR 그린 마스터</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>피셔&nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1.5% 아가로스 젤&nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS 어세이 키트</td><td>생명 기술&nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA 정량화(100개 분석)&nbsp;</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>시그마</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제&nbsp;</td><td>로슈&nbsp;</td><td>4693116001</td><td>각 정제는 10 ml 용해 완충</td></tr>액 <tr><td>PhosSTOP Phosphatase 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche에 충분합니다.</td><td>4906845001</td><td>각 정제는 10 ml 용해 버퍼에 충분합니다.</td></tr> 큐<tr><td>비트 어세이 키트</td><td>라이프 테크놀로지스&nbsp;</td><td>Q32850</td><td>100 분석</td></tr><tr><td>자동 세포 카운터</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>튜브 로테이터&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 멀티플 플레이트 리더&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>자석 스탠드</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>빠른 Real-time PCR 시스템</td><td>응용 과학&nbsp;</td><td></td><td></td>4351405</tr></tbody></table>

유방암에서 에스트로겐 수용체 신호 전달에 의해 대사 규제 시스템 생물학

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

-omics의 출현으로 암과 대사 증후군과 같은 만성 질환에 대한 우리의 이해가 개선 된 접근한다. 그러나, 유전자 발현 마이크로 어레이 깊이 순서화 실험 대사 프로파일로부터 획득되는 대규모 데이터 집합의 정보를 효과적으로 마이닝 발견하는 것이 필수적이다하고 효과적으로 병든 세포 표현형의 중요한 표적 레귤레이터. 에스트로겐 수용체 α (ERα)은 에스트로겐 반응 유방암에 중요한 유전자 프로그램을 조절하는 마스터 전사 인자 중 하나입니다. ERα는 유방암 대사에 신호의 역할을 이해하기 위해서 우리는 에스트라 디올로 치료 MCF-7 세포에서 transcriptomic cistromic 및 메타 볼로 데이터를 이용했다. 이 보고서에서 우리는 RNA-서열, 칩 - 서열 및 대사 체학 실험 얻어진 데이터의 통합 전산 분석을 위해 샘플의 생성을 설명했다. 이 방법은 새로운 몰을 서술에 유용하다정상 또는 병에 걸린 세포의 영향 대사 특정 전사 인자에 의해 조절된다 큘라 메커니즘과 유전자 조절 회로.

Transcriptomics E2 처리에 의한 차등 발현 유전자를 분석하기 위해, 우리는 RNA-SEQ 실험을 수행하기로 결정했습니다. mRNA 수준에 대한 정보를 제공 할뿐만 아니라, RNA-SEQ 데이터는 비 코딩 RNA를 (길이 비 코딩 RNA를, 마이크로 RNA)와 스 플라이 싱 이벤트의 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 본 연구의 범위는 대사 조절에 중요​​한 단백질 코딩 유전자를 식별하기 때문에 우리는 RNA를 코딩 비 또는 대안 전사 유전자의 분석에 대한 정보를 제공하지 않았다. 그러나, RNA-SEQ 차등 유전자 발현 이벤트에 대한 정보를 얻을 수있는 훌륭한 방법이다. 고품질 판독 얻기 위해서는 고순도의 RNA를 얻기 위해 중요하다. RNA를 분리 한 후 우리는 RNA 청소 키트를 사용하여 RNA를 정제 하였다. 불행하게도 R...

게놈 전체 염기서열 분석 실험과 대사체학 실험의 데이터를 통합하는 것은 어려운 일입니다. 이 논문에서는 처음으로 에스트라디올로 처리된 유방암 세포에서 전사체, 시스톰 및 대사체 데이터의 생성, 분석 및 통합을 보고합니다.

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

이 실험의 전반적인 목표는 전장 유전체 전사체, 시스템롬 및 대사체 데이터를 사용하여 유방암에서 ER Alpha의 직접적인 대사 조절을 이해하는 것입니다. 이 방법은 특정 전사 인자가 대사를 조절하여 세포의 공격성에 기여하는 역할과 같이, 핵 수용체 및 암 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유전자와 그로 인한 대사 조절의 미세한 차이를 전역적인 관점에서 파악할 수 있다는 점입니다.실험 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Yiru Chen이 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 MCF7 세포를 배양한 후, 각 웰에 1 mL의 RNA 분리 시약을 첨가하여 세포를 수확하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 파이펫을 사용하여 세포 용해물을 수집하고 이를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.RNA를 분리하려면, 1 mL의 세포 용해물에 200 µL의 클로로포름을 첨가하고 10초 동안 볼텍싱합니다. 상온에서 5분 동안 배양한 후, 4 °C에서 16,000 x g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면, 상층의 수용액층을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.수성상에 100% isopropanol 500 µL를 첨가하고, 뒤집어 섞어 줍니다. 그다음, -20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 샘플을 4 °C에서 1600 x g로 10분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고, RNase-free 70% ethanol 750 µL를 첨가한 뒤 짧게 볼텍싱합니다. 샘플을 6,000 x g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고, 샘플을 16,000 x g, 4 °C에서 1분 동안 원심분리합니다.겔 로딩 팁을 사용하여 피펫팅으로 남은 에탄올을 제거합니다. 그런 다음 튜브를 거꾸로 세워 10분 동안 공기 건조시킵니다. 이후 20~50 µL의 DEPC water를 가해 펠릿을 녹인 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 RNA를 정제하고 정량합니다.텍스트 프로토콜에 따라 MCF7 세포를 배양한 후, 염색질을 가교시키기 위해 5 mL의 배지가 들어있는 세포에 16% formaldehyde 250 µL를 첨가하고 상온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음, 얼음처럼 차가운 1X PBS 5 mL를 사용하여 세포를 세척하고 가교 반응을 중단시킵니다. 플레이트당 250 µL의 세포 용해 버퍼를 사용하여 세포를 회수합니다.그 다음, 염색질을 필요한 크기로 단편

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 대사 산물 프로파일링을 위해 유방암 세포 샘플을 준비하는 기술에 대해 설명합니다. 유방암 세포는 에스트로겐 수용체 알파에 결합하여 대사 산물 구성에 변화를 일으키는 에스트라디올로 치료됩니다.

Sample Preparation for Metabolomics: A Method to Prepare Cell Samples for Metabolitecs(대사체학을 위한 시료 준비: 대사체를 위한 세포 시료 전처리 방법)

이 비디오는 식물 유래 화합물의 에스트로겐 활성을 결정하기 위한 세포 기반 리포터 분석에 대해 설명합니다. 에스트로겐과 같은 활성을 가진 화합물은 에스트로겐 수용체에 대한 결합을 모방하고 다운스트림 리포터 효소 유전자 전사를 유도합니다. 리포터 효소는 반응에서 생물 발광을 생성하여 화합물의 에스트로겐 활성을 나타냅니다.

에스트로겐 수용체-리포터 활성 분석법은 식물성 에스트로겐 에스트로겐 활성을 스크리닝합니다.

에스트로겐과 마이크로 RNA 모두를 통해 신호 분자는 유방암의 발전과 성장에 중요하다. 에스트로겐은 전사 인자이다 에스트로겐 수용체를 활성화합니다. 많은 전사 인자는 마이크로 RNA의 발현을 조절할 수 있으며, 에스트로겐 조절 마이크로 RNA는 다른 대규모 기법을 사용하여 프로파일 링 할 수있다.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하기위한 새로운 생체 모델을 개발했다. 이 조직 구조, 세포 간 상호 작용 및 분비 신호를 보존 수술 유방 조직 표본으로부터 분리 미세 조직에 기초한다.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

임상적으로, 갱년기 여성의 에스트로겐 결핍은 지질 장애및 동맥 경화증의 발생률을 악화시킬 수 있습니다. 우리는 apoE-/- 마우스에 있는 이중 등측 절개를 통해 양측 난소 절제술에 의하여 생체 내 에스트로겐 부족 모형을 설치했습니다. 마우스 모델은 폐경 후 심혈관 기능 장애의 외인성 에스트로겐 치료를 스크리닝하는 데 적용가능하다.

폐경 후 심장 혈관 기능 장애의 외인성 에스트로겐 치료를 선별하기위한 생체 내 에스트로겐 결핍 마우스 모델

우리는 에스트로겐 활성에 대한 인간 및 비 인간 영장류 식품을 선별하기위한 기자 분석 β 시판 가능한 에스트로겐 수용체를 최적화했습니다. 우리는 알려진 에스트로겐 성 인간 음식 콩 높은 등록 을 보여 줌으로써이 분석 확인, 다른 식품은 활동을 표시 하지 않는 동안.

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

이 프로토콜은 선반 재료가 없는 1차 인간 유방 조직을 사용하여 유방암을 연구하기 위한 체외 미생물 시스템의 건설을 설명합니다.

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

본 프로토콜은 MCF-7 세포 증식 및 이동을 억제하는 살리드로사이드의 약리학적 작용 및 기전을 평가하기 위한 포괄적인 전략을 설명합니다.

MCF-7 세포 증식 및 이동 억제에서 Salidroside의 약리학적 작용 및 분자 메커니즘 탐구

뼈 전이의 pathogenesis에서 angiogenesis가 중요한 공정이므로 이미징 및 치료를위한 목표를 나타냅니다. 여기서는 특정 사이트 유방암 골 전이의 쥐 모델을 제시하고 비 invasively 이미지 angiogenesis에 전략을...

자기 공명 영상, 체적 계산의 Tomography 및 초음파를 이용한 유방암의 뼈 전이의 누드 쥐 모델에서 Angiogenesis의 멀티 모달 이미징

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

학습하세요 유방암에서 ER Alpha에 의한 대사 규제 메커니즘을 전사체, 시스트롬, 대사체 데이터 통합으로 분석하는 방법을. MCF7 세포 배양 및 다중 오믹스 기법을 활용한 종양 대사 연구에 활용됩니다.

유방암에서 에스트로겐 수용체 신호 전달에 의해 대사 규제 시스템 생물학

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