Name: 쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 학습하세요 쥐 간 세포에서 DNA 가닥 나누기 및 산화적 DNA 손상을 측정하는 알카라인 혜성 분석법을. 효소 수정 기법을 활용한 이 방법은 유전독성학 연구와 규제 안전성 평가에 필수적인 도구입니다.

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이 작업은 미국 식품의약국(FDA)의 지원을 받았습니다. Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG의 CPA 연구의 원본 간행물을 인정합니다. cyproterone acetate-treated F344 rats의 유전독성에 대한 성별별 용량 반응 분석. 돌연변이 연구 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

윤리 문 : 동물과 관련된 절차 독성 연구를위한 미국 FDA / 국립 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 참고 : 여기에 설명 된 연구 설계가 생체 내 설치류 알칼리 혜성 분석 (18)의 타당성에 대한 대체 방법의 유효성 검사를위한 일본 센터 (JaCVAM)에 의해 개발 된 프로토콜을 기반으로하고, 또한 OECD 가이드 라인의 권장 사항에 따라 수정 된 TG489 19 . 1. 준비 <ol><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 1 %에서 일반 용융 아가로 오스를 용해 (W / V) 인산 버퍼 (칼슘, 마그네슘 2+ 무료 페놀 레드 무료) 전자 레인지에 가열. </li><li> 55 ° C의 물을 욕조에 용융 1 % 표준 아가로 오스 솔루션을 놓고 욕실 온도를 평형. 딥 유리 현미경은 exces을 배출, 아가로 오스 용액에 슬라이드아가로 오스 S와 깨끗한 슬라이드의 뒷면을 닦아냅니다. 실온에서 건조 슬라이드를 평평한 표면에 수직 슬라이드를 놓고 수 있습니다; 건조한 장소에 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li><li> 혜성 시험 용액의 제조 <ol><li> 0.5 % 저 융점 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 인산 버퍼에 아가로 오스 (칼슘, 마그네슘을 2 +, 페놀 레드 무료) 저 융점을 용해 전자 레인지에 가열. 혜성 슬라이드 준비하는 동안 37-45 ℃에서 솔루션을 유지; 이후에 남아있는 아가로 오스 솔루션을 폐기합니다. </li><li> 용해 버퍼를 준비합니다. 디 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (디 소듐 EDTA 씨 372.24 g / mol)을 2.5 M 염화 나트륨 (NaCl을 씨 58.44 g / 몰) 및 10 mM 트리스 히드 록시 메틸 아미노 메탄 (트리스베이스 씨 121.14 g / 몰) 100 mM의 용액을 정제수, 10 N 수산화 나트륨 수용액 (NaOH로 씨 40g / mol)을 사용하여 pH 10로 조정한다. 사용 당일 최종 정광을 달성하기 위해 용액에 트리톤 X100 및 디메틸 설폭 사이드 (DMSO 씨 78.13 g / 몰) 부가각각 1 %, 10 %, 이온, 및 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 4-9 ℃에서 교반 하였다. </li><li> 사용 당일에 신선한 효소 버퍼를 확인합니다. 40 mM의 2- [4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 일] - 에탄 설 폰산 (HEPES 씨 238.3 g / 몰) 100 mM의 염화칼륨 (KCl을 씨 74.55 g / mol)를 0.5 mm로 함유하는 용액을 준비 디 소디움 EDTA, 정제수를 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA, 씨 66,463g / 몰). 10 N 수산화 칼륨 용액 (KOH, 56.1 g / mol)을 8.0의 pH를 조정한다. 실온에서 교반하고, 사용하기 전에 완전히 용해를 확인합니다. </li><li> 300 mM의 수산화 나트륨 정제수 1 mM의 EDTA이 나트륨을 함유하는 알칼리 완충액을 준비한다. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 4-9 ℃에서 교반 하였다. 사용하고, pH가&gt; 13 인 확인하기 전에 용액의 pH를 측정한다. </li><li> 정제 된 물에 0.4 M 트리스 자료의 용액을 제조하고, 염산 (HCl을, 미스터 36.46)으로 pH 7.5로 조정한다. 4-10 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 이 버퍼를 중화한다. </li><li> F 만들기resh 사용 당일에 버퍼를 닦지. 행크의 균형 소금 용액에 20 mM의 디 소듐 EDTA, 10 % DMSO를 함유 용액 (HBSS, 칼슘, 마그네슘 2+, 페놀 레드 무료)을 준비합니다. 얼음에 사용할 때까지 보관합니다. </li><li> 염색 용액을 제조하려면 1에서 트리스 - 보레이트-EDTA (TBE 버퍼)와 핵산 형광 얼룩 원액을 희석 : 10,000 (v / v)로. 알루미늄 호일을 사용하여 빛의 솔루션을 보호합니다. 2-8 ° C에서 보관하고 24 시간으로 사용합니다. </li></ol></li></ol> 쥐의 간에서 단일 세포 현탁액 2. 준비 <ol><li> 동물의 안락사에 대한 미국 수의학 의료 가이드 라인에서 권장하는 CO 2 가스를 다음과 같은 방법으로 쥐를 안락사 : 2013 판 20. <ol><li> 2.75에서 CO 2 유량을 설정합니다. 안락사 챔버에서 쥐를 착용 할 것 (예를 들어, 데시 케이 터 항아리, 배출 뚜껑 쥐 케이지)와 탱크 밸브를 개방하여 CO 2를 켭니다. 까지 1.5 ~ 2.5 분 동안 기다립니다쥐 의식이된다. 최대 설정으로 CO 2 흐름을 증가시킵니다. 호흡의 중단 후 안락사를 위해 약 1 분 동안 챔버에서 래트를 떠난다. 쥐가 더 하트 비트가 없음을 확인 palpating하고 쥐가 다리를 철회하지 않는 것을 결정하기 위해 발가락을 곤란하게하여 안락사를 확인합니다. </li></ol></li><li> 70 % 에탄올로 머리 피부를 소독. 복강을 열고 수술 가위 그대로 간을 제거합니다. 간을 제거한 후, 수술 가위로 남아있는 간에서 왼쪽 측면 로브를 제거합니다. 커팅 보드에 왼쪽 측면 로브를 놓고 일회용 단일 양날 면도날을 사용하여 두 개의 인접한 3-4mm 두께의 횡단면을 잘라. </li><li> (섹션의 컬링을 방지하기 위해) 필터 종이에 하나의 횡단면을 배치, 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)에 섹션을 배치합니다. 1 이상 : 조직 10 % NBF의 비율이 10 있는지 확인하십시오. 적어도 72 시간, 시저의 고정 시간 후조직 병리학 (아래 7 항 참조) 간을 ESS. </li><li> 6cm 페트리 접시에 5 ml의 얼음처럼 차가운 닦지 버퍼 (섹션 1.2.6)에 두 번째 횡단 간 부분을 놓고 잔류 혈액을 제거하기 위해 3 번 씻어. </li><li> 1 ml의 얼음처럼 차가운 닦지 버퍼를 포함하는 새로운 2 ML의 원심 분리기 튜브에 간 섹션을 전송합니다. 세포를 분리하는 미세 가위로 잘 세정 간 부 말하다. 모든 조직 덩어리를 제거하기 위해 40 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액 스트레인. </li><li> 얼음에 단일 세포 현탁액을 놓고 1 시간 내에 슬라이드를 만들기 위해 사용합니다. 농도가 약 2 X10 106 세포 / ml 인 것을 확인하기 위해 (또는 전자 혈구 세포 계수기 예) 계수하여 세포의 농도를 확인한다. </li></ol> 혜성 슬라이드 3. 준비 <ol><li> 열 용융의 권, 37 ° C, 0.5 % 저 융점 아가로 오스 용액 (섹션 1.2.1)를 단일 세포 현탁액 하나의 볼륨을 섞는다.즉시 일반 융점 아가로 오스 (섹션 1.1)로 코팅 된 슬라이드에 100 μl를 피펫. 즉시 세포 아가로 오스 혼합물을 통해 커버 슬립을 배치합니다. 각 샘플에 대한 최소 8 슬라이드를 확인합니다. 참고 : 모든 슬라이드는 숫자 또는 이와 유사한 코드로 식별되어야하고 슬라이드가 눈을 멀게 방식으로 획득 할 수 있도록 자신의 정체성 (아래, 6.2.2 참조), 기록했다. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에 슬라이드가 평평하고 멋진 놓습니다. </li><li> 젤이 응고 후, 부드럽게 커버 전표를 제거하고 미리 냉각 용해 버퍼 (섹션 1.2.2)에 슬라이드를 담가. 빛으로부터 슬라이드를 보호하고 O에 1 시간 (최소)에서 4 ° C에서 용해 버퍼에 슬라이드를 유지 / N (최대). </li></ol> 혜성 슬라이드 4. 효소 처리 <ol><li> 용해 버퍼에서 각 조직 샘플로부터 제조 된 8 슬라이드 6을 제거하고 그들을 실온에서 효소 버퍼 (섹션 1.2.3) 5 분마다 3 배 씻어. 알칼리 혜성 분석 w에 대한 나머지 두 슬라이드를 사용하여ithout 효소 처리 (아래 5.1 참조). 세척 한 후, 배수 및 조직과 슬라이드를 모래 바닥으로 물기를 제거합니다. </li><li> 1 효소 버퍼 hOGG1 및 엔도 III 효소 주식을 희석 : 1,000 (v / v)로. 얼음에 사용할 때까지 놓습니다. </li><li> 혼자 효소 버퍼 (참고 슬라이드로 사용이 슬라이드), 200 μl를 hOGG1 용액 (2 슬라이드) 또는 200 ㎕의 엔도 III 솔루션 (2 슬라이드) 200 ㎕를 각 치료 그룹에서 제조 된 슬라이드에 다음과 같은 솔루션을 200 μl를 적용합니다. </li><li> , 젖은 종이 타월로 줄 지어 페트리 접시에 슬라이드를 넣어 파라 필름과 슬라이드를 포함하고, 엔도 III-처리 및 참조 슬라이드와 hOGG1 처리 슬라이드에 30 분 동안 45 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 배양 후, 증류수로 슬라이드를 씻어 이하, 5.2에 설명 된대로 처리를 계속합니다. </li></ol> 5. 풀기 및 전기 영동 <ol><li> 슬라이드가 효소로 처리하지 않은 경우, 용해 완충액에서 슬라이드를 삭제상기 슬라이드를 드레인과 잔여 세제 염을 제거하기 위해 5 분 동안 차가운 중화 완충액 (섹션 1.2.5) 회 헹군다. </li><li> 공백을 피하고 단계 4.5 수평 겔 전기 영동 탱크에 무작위 5.1에서 장소 슬라이드. 액면 그냥 슬라이드를 커버 할 때까지 갓 만든 산도&gt; (13) 전기 영동 버퍼 (섹션 1.2.4)와 탱크를 채우십시오 (아가로 오스를 통해 거품을 방지하고 있는지 탱크 레벨 확인). DNA의 풀림의 시작에서 버퍼 pH와 온도를 기록한다. </li><li> 20 분 알칼리 책임 손상의 DNA와 표현의 풀림을 허용하는 슬라이드는 알칼리 버퍼에 남아 보자. </li><li> 푸는 동안 프로그램 전원은 전기 조 (양극과 음극 사이 cm의 거리로 나눈 값 V / cm = 볼트)에서 0.7 V / cm를 생성한다. </li><li> 풀림 후, 전원 공급 장치의 실행 버튼을 누릅니다. 필요한 경우, 상승 또는 버퍼 레벨을 낮춤으로써 300mA의 전류를 조정한다. 제 유지그냥 슬라이드의 표면 위의 전자 버퍼 수준입니다. 20 분 동안 4 ° C에서 전기 영동을 수행합니다. 시작과 끝에서의 전기 슬라이드 위치 버퍼의 온도와 전류 (A)를 기록한다. 참고 : 너무 많은 버퍼가 DNA의 이동을 방해 할 수 있습니다 낮은 전압 발생합니다. </li><li> 전기 영동 후, 5 분 동안 부드럽게 (섹션 1.2.5)을 탱크에서 슬라이드를 해제하고, 중화 완충액에 침지시켜 과량의 알칼리를 중화. 슬라이드를 배출하고 두 번 더 반복한다. </li><li> 5 분 동안 차가운 100 % 에탄올에 침지하여 슬라이드를 고정한다. 저장을위한 건조 지역에서 자연 건조와 장소에 슬라이드를 허용합니다. </li></ol> 6. DNA 염색, 혜성 시각화 및 분석 <ol><li> DNA 염색 <ol><li> 판지 또는 금속 트레이에 슬라이드를 놓고 각 슬라이드에 핵산 형광 염색 가공 솔루션 (섹션 1.2.7)의 200 μl를 추가하고 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 에서 슬라이드를 보호광은 슬라이드 채점 전에 적어도 30 분 동안 염색 용액과 접촉을 유지하도록 허용한다. 한 번에 20의 배치에 슬라이드를 얼룩. </li><li> 각 슬라이드를 읽기 전에, 부드럽게 커버 유리를 방해하지 않도록주의, 과잉 염색 액을 멀리시킨다. </li></ol></li><li> 혜성 시각화 및 채점 <ol><li> 컴퓨터 모니터에 혜성 슬라이드의 라이브 영상을보기 위해 형광 현미경에 장착 된 비디오 카메라를 사용한다. </li><li> 무작위로 세포를 포함 현미경 필드를 선택합니다. 마우스를 사용하여 셀을 선택합니다. 마우스 왼쪽 클릭으로 &quot;혜성의 머리&quot;의 중심을 클릭합니다. 주 : 컴퓨터 소프트웨어는 모든 셀에 대한 측정 파라미터를 계산하고, 데이터 파일에 데이터를 추가한다. </li><li> 현재 필드 (단계 6.2.4 참조)에있는 모든 세포 점수, 다음 세포의 또 다른 세트를 찾기 위해 현미경의 스테이지를 제어하고 화면의 영상을 사용합니다. 6.2.2에 설명 된대로이 세포 점수. </li><li> 슬라이드 F 점수롬 오른쪽 왼쪽 위로 아래로합니다. 약 10 필드 랜덤을 선택합니다. 이 과정에서보기 필드에 나타납니다 적당한 혜성 셀은 편견없이 득점해야합니다. 참고 : 다음 중 하나에 해당하는 경우 혜성 점수하지 마십시오 : 1)는 슬라이드의 가장자리 중 하나에 있습니다; 2) 두 개 이상의 혜성은 중복; 3) 꼬리에 파편이있다; 4) 소프트웨어는 머리와 꼬리를 구분할 수 없다; 5) 핵 및 / 또는 꼬리의 염색 슬라이드에 다른 혜성 크게 다르다. 참고 : 꼬리 거의 모든 DNA 형광와 혜성은 종종 &#39;고슴도치&#39;혜성이라고합니다. 고슴도치 혜성은 득점하지 않아야하지만, 슬라이드 득점 중에 감지 고슴도치의 수를 기록, 총 혜성의 백분율로보고되어야한다. </li><li> 적어도 150 혜성 세포 / 총 샘플을 얻기 위해 장기 / 조직 당 두 개의 슬라이드를 읽고 슬라이드 당 최소 75 혜성을 분석합니다. 슬라이드에서 세포의 필요한 수의 후 수 있습니다실내는 결과는 나중에 데이터 분석을위한 스프레드 시트 파일로 저장됩니다 얻었습니다. </li></ol></li></ol> 7. 조직 병리학 분석 <ol><li> 조직 (21)을 트리밍 한 다음 10 % NBF에서 72 시간 고정 최소, 이후 정기적으로 처리하고 22 배지 계 파라핀 왁스 시료의 왼쪽 측면 간 로브를 포함. 제 샘플에서 약 5 미크론 유리 슬라이드에 수집합니다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)와 섹션을 얼룩 : <ol><li> 염색 과정에 앞서 2 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 파라핀 조직 절편과 슬라이드를 가열한다. </li><li> 측면을 deparaffinize하는 자일 렌을 사용합니다. 실행중인 수돗물 린스에 등급 에탄올 (EtOH로)와 슬라이드를 재수. </li><li> 2 분 40 초 동안 헤 마톡 실린 450 ml의에서 슬라이드를 놓습니다. 4 초 동안 산 린스 슬라이드 (450 ml의 탈 이온수 2 ml의 빙초산는) 5 분 실행 수돗물 린스 다음과 같습니다. </li><li> 미끄러 배치2 분 30 초, 1 분 동안 70 %의 EtOH 린스 수돗물 린스를 실행하여 다음 2 분 동안 1 ㎖의 수산화 암모늄을 함유하는 450 ㎖의 70 % EtOH 중 에스. </li><li> 3 분 동안 4 ml의 빙초산을 함유하는 450 ml의 에오신 Y 용액 슬라이드 부화. </li><li> 등급 EtOH로 슬라이드 탈수. 자일 렌과 슬라이드 (세 번 각각 1 분)을 취소 한 커버 슬립이 슬라이드에 배치 될 때까지 크실렌에 슬라이드를 개최합니다. </li></ol></li><li> 1 (최소), 2 (가벼운), 3 (보통), 4로 심각도에 대한 광학 현미경, 기록 결과, 학년이 아닌 양성 병변에 의해 슬라이드를 검사 (표시). 참고 :; 가벼운 = 16~35%가 보통 = 36-60%, 특정 병변에 적용 심각도 등급이 병변에 간 상대적 비율 (최소 = &lt;1-15%에 기초하고 표시 = 61 100 %). </li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> 동물은 통계적 평가를위한 실험 장치로 간주됩니다. DNA 손상은 %로 표현된다 DN꼬리에. </li><li> 다음 산화성 DNA 손상을 계산한다 : 레퍼런스 슬라이드 (NO 효소 처리)는 백그라운드 DNA 가닥 나누기 (SB)의 추정치를 제공한다. 참고 : 효소 처리 된 슬라이드 가닥 나누기의 측정 및 산화 기지 (SB + OX)를 제공합니다. DNA 손상의 함수로 꼬리 %의 DNA에 대한 선형 용량 반응을 가정하면, SB + OX에서 SB의 감산은 산화 피리 미딘 / 변경 퓨린 (23)로부터 DNA 가닥 나누기의 추정치를 제공합니다. </li><li> 차량 제어에 처리 된 동물에서의 답변 페어의 비교에 대한 던넷 시험 다음 편도 ANOVA에 의해 투여 량의 함수로 꼬리 %의 DNA를 분석합니다. 참고 : 모든 테스트는 하나의 꼬리하고 0.05의 p- 값이 통계적 유의성의 기준으로 설정됩니다. </li></ol>

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저자 중 누구도 경쟁하는 이해관계나 상충되는 이해관계를 가지고 있지 않습니다. 이 자료의 정보는 FDA의 공식적인 정보 배포가 아니며 기관의 입장이나 정책을 나타내지 않습니다.

이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 쥐의 간에서 모두 직접 산화 DNA 손상의 동시 측정을 설명합니다. 일반적인 프로토콜 (즉, DNA 손상되지 테스트 에이전트하지만 동물 조직의 취급 및 가공에 의해 유도 된) 단일 세포 또는 핵 최소 처리 유도 된 DNA 손상과 분리 될 수있는 모든 조직에 적용 할 수있다. 우리의 연구에서는 골수 7,9, 위 (6), 신장 (9), 방광 (9), 폐 (9), 심장 (10), 유선 (5), 자궁 (5), 고환 5, 혈액 5 세포에 알칼리 혜성 분석을 실시했다. 이러한 분석은 다수의 기관 및 실험 동물의 조직에서 생체이 인한 DNA 손상을 연구하는데 빠르고 간단하고 저렴한 방법을 제공 할 수있다. 또한,이 방법은, 말초 혈에, 예를 들면, 전도성 분석하여 인간 생체 모니터링 연구에 사용될...

알칼리 혜성 분석은 단일 세포 수준에서 DNA 가닥 나누기를 측정한다. 단일 세포 현탁액은 현미경 슬라이드에 아가에 매립하고 세포의 DNA를 포함하는 수퍼 코일 루프 nucleoids을 형성 용해. 양극으로 마이그레이션하는 DNA의 해제 가닥으로 가닥 나누기를 포함하는 DNA 루프에서 수퍼 코일의 손실 산도&gt; (13) 결과에서 전기 영동, 형광 현미경으로 관찰 할 수 혜성 같은 구조를 생성. 단편화 된 DNA는 DNA 파괴 하나를 정량화하는데 사용될 수있는 단편의 크기 및 총 강도 (머리와 꼬리)에 비해 혜성 꼬리의 상대적 형광에 기초하여 &quot;꼬리&quot;에 혜성의 &quot;헤드&quot;에서 마이그레이션 2. 분석은 단순 구분, 다양한, 빠른, 1 상대적으로 저렴하다. DNA를 손상 에이전트에 의한 단편화 된 DNA의 검출은 세포의 DNA 손상을 정량화하기위한 분석을 사용 또는에서 핵을 격리 INDIVI잠재적 유전 독성 물질 (들)로 처리 동물의 이중 조직. 장점으로 인해 생체 내 혜성의 분석은 현재의 가늠자 조정에 국제 회의 (ICH) (3)과 유럽 식품 안전청에서 제품의 안전성 평가를 수행하기위한 (생체 내 소핵 분석과 쌍) 두 번째 생체 내 유전 독성 분석 (EFSA로 추천 ) 4 규제 지침. 우리가 실험실에서, 우리는 음식 재료, 의약품, 나노 물질 5-10에 의한 생체 내 DNA 손상을 평가하기위한 분석을 사용했다. 쥐 간 이러한 프로토콜의 예로서 사용되지만, 혜성 분석은 실험 동물의 다른 조직 / 기관만큼 조직으로부터 단리 할 수​​있다 그대로 단셀로 수행 될 수있다. DNA 손상의 특정 타입은 염기성 알칼리 혜성 시험을 수정하지 않고 DNA 가닥 나누기로 검출하기 어렵다. 산화성 DNA 손상의 경우에, 스트랜드 Breaks은 같은 8 oxoguanine (8 oxoGua) 및 메틸 fapy - 구아닌 (11)에서 휴식을 만들어 인간의 8-oxoguanine-DNA-N-글리코 1 (hOGG1, 같은 수리 효소로 소화에 의해 DNA의 산화 적 병변에서 만들 수 있습니다. 또한, 효소 III (엔도 III)의 산화 피리 미딘 1 주로 휴식을 생성한다. 따라서, 효소 분해 단계의 추가가 분석을 생체 (12)의 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 구체적이고 민감한 방법을한다. 이러한 분석을 활용, 우리는 증명하고있다 쥐와 생쥐 6-8의 간에서 쥐 (10)의 중심부에 독성 물질에 의한 산화 적 DNA 손상. 시험관 내에서 민감한에 의해 식별 genotoxins에 대한 생체 분석에서 후속는 3,13 테스트로 1), 2) 여러 조직에서 생체 이물에 의한 DNA 손상의 메커니즘을 평가하기 : 알칼리 혜성 분석은 유전 독성과 인간 생체 모니터링에 많은 응용 프로그램이 있습니다 14 3)하면 조사발암 물질, 4), 5) 사람의 질병 직업적 노출 (16)을 조사하고 DNA 손상을 복구 (15)을 평가하기 위해 유전자 독성 또는 동작의 비 유전 독성 모드 (MOA) (7)를 사용하여 동작 6)에 대한 잠재적 인 높은 처리량 스크리닝 검사로서 기관 고유의 유전 독성 17.

<table><tbody><tr><td>커버슬립(1호, 24 x 50mm)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 디소듐</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염</td>수 <td>Fisher</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free)HyClone</td><td></td> <td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스 ( LMP)</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>NuSieve GTG 아가로스</td></tr><tr><td>노멀 멜팅 아가로스(NMA)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>pH 테스트 종이 스트립(pH 7.5-14)</td><td>Fisher</td><td>M95873</td><td></td></tr><tr><td>클로라이드 칼륨</td><td>Fisher</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>Fisher</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 라벨(0.94 x 0.5인치)</td><td>Fisher</td><td>NC9822036</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 (NaOH)&nbsp;</td><td>피셔</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade; 골드&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>피셔</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-402-6</td><td></td></tr><tr><td>셀 여과기 (40 &micro; m)</td><td>피셔</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>엔도뉴클레아제 III(N번째)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0268S</td><td>희석 1:1,000</td></tr><tr><td>hOGG1&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0241S</td><td>희석 1:1,000</td></tr></tbody></table>

쥐 간에서 dna 가닥 나누기 및 산화 적 dna 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

복구되지 않은 DNA 손상은 유전적 불안정으로 이어질 수 있으며, 이는 차례로 암 발병을 촉진할 수 있습니다. 따라서 잠재적인 DNA 손상 인자를 식별하는 것은 공중 보건을 보호하는 데 중요합니다. 가닥이 끊어질 때 DNA 손상을 감지하는 in vivo 알칼리 혜성 분석법은 생체 내 흡수, 조직 분포, 화학 물질의 대사 및 배설(ADME) 및 DNA 복구 과정을 반영하기 때문에 생체 이물의 유전독성 위험을 평가하는 데 특히 적합합니다. 다른 in vivo DNA 손상 분석과 비교했을 때, 이 분석은 빠르고, 민감하며, 시각적이고, 저렴하며, 특정 복구 효소를 사용하여 산화적 DNA 손상을 가닥 절단으로 변환함으로써, 효율적이고 상대적으로 아티팩트가 없는 방식으로 산화적 DNA 손상을 측정할 수 있습니다. 혜성 분석을 통한 DNA 손상 측정은 급성 및 아만성 독성학 연구 설계를 모두 사용하여 수행할 수 있으며, 혜성 분석을 다른 독성 평가와 통합함으로써 이 분석은 동물 자원을 최대한 활용하여 동물 복지 요구 사항을 해결합니다. 이 분석법의 또 다른 주요 장점은 소량의 세포만 필요하고 증식하는 세포 집단에서 세포를 유도할 필요가 없다는 것입니다. 이 분석은 또한 임상적 또는 직업적으로 노출된 개인으로부터 얻은 다양한 인간 샘플로 수행할 수 있습니다.

생체 내 알칼리성 혜성 분석은 사이 프로 테론 아세테이트 (CPA) (5)로 처리 된 래트의 간에서 직접 및 산화성 DNA 손상을 모두 측정하는 효소 변성 혜성 분석과 함께 수행 하였다. CPA와 함께, 섹스 특정 방식으로 쥐의 간 종양을 유도하는 합성 호르몬 약물 여성 (24)에 비해 남성 쥐에서 간 종양을 유도하는 데 필요한 높은 용량을 5 배. 우리 수컷 및 암컷 쥐의 간에서 CPA 제조 직접적인 DNA 손상이 hepatotumorigenicity 같은 성별 특정 패턴을 가지고 있음을 발견 CPA의 5 배 - 고용량이있는 DNA 손상의 상당한 증가를 유도하는 데 필요한 여성에 비해 남성의 간 (그림 1). 우리는 섹스 관련 혜성 분석 결과가 15 배 높은 하이드 록시 s...

알칼리 혜성 분석은 진핵 세포에서 DNA 가닥 절단을 측정합니다. Endonuclease III 또는 human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step을 추가함으로써 이 분석은 산화적 DNA 손상을 효율적으로 검출할 수 있습니다. 우리는 쥐 간에서 DNA 손상을 검출하기 위하여 이 분석을 사용하는 방법을 기술한다.

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

in vivo 알칼리 코멧 분석법 및 효소 변형 알칼리 코멧 분석법의 전반적인 목표는 단일 세포 수준에서 직접적인 DNA 손상과 산화적 DNA 손상을 동시에 측정하는 것입니다. 이 방법은 FDA 규제 제품의 안전성 분석을 위한 규제 도구로 처음 제안되었습니다. 이 방법은 규제 안전성 평가부터 분자 역학, 기초 암 연구에 이르기까지 다양한 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술은 민감하고 다재다능하며 비용 또한 상대적으로 저렴합니다. 거의 모든 동물 조직에서 DNA 손상을 검출할 수 있습니다. 일반적으로, 다양한 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 빠르게 준비하는 과정이 까다로울 수 있으며, 이는 실험자에게 도전적인 과제가 될 수 있다는 점이 잘 알려져 있습니다.이 방법은 과학적 지식뿐만 아니라 어느 정도의 숙련된 기술이 필요하므로 시각적 시연이 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이산화탄소 가스로 쥐를 안락사시킨 후, 촉진을 통해 심박동이 없는지 확인하고 발가락을 집어 사지를 움츠리지 않는지 확인하십시오. 에탄올로 피부를 소독한 다음, 외과용 가위로 복강을 절개하여 온전한 간을 적출합니다.가위로 좌측 외측 엽을 장기의 나머지 부분에서 분리하여 도마 위에 놓습니다. 다음으로, 일회용 외날 면도날을 사용하여 3~4 mm 두께의 인접한 횡단면 두 개를 절단합니다. 횡단면 하나를 거름종이 위에 놓은 후, 10% 중성 완충 포르말린(NBF)에 넣습니다.두 번째 간 절편을 6 cm 페트리 접시에 담긴 5 mL의 차가운 mincing buffer에 넣고, 잔류 혈액을 제거하기 위해 세 번 헹굽니다. 그런 다음, 간 절편을 1 mL의 차가운 mincing buffer가 들어 있는 새로운 2 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 미세 가위를 사용하여 절편을 잘게 다져 세포를 분리한 후, 40 µm 세포 스트레이너로 세포 현탁액을 걸러 조직 덩어리를 제거합니다.단일 세포 현탁액을 얼음 위에 두고, 혈구계수기를 사용하여 농도가 약 2 × 10⁶ cells/mL인지 확인합니다. 코멧 슬라이드를 준비하려면, 단일 세포 현탁액 1부피를 37 °C의 용융된 0.5% 저융점 아가로스 용액 10부피와 혼합합니다. 즉시 100 µL를 미리 준비된 아가로스 코팅 슬라이드 위에 피펫팅하고, 커버슬립을 사용하여 아가로스 세포 혼합물을 덮습니다.슬라이드를 평평하게 놓고 4°C에서 30분 동안 냉각합니다. 겔이 응고되면 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 미리 냉각시킨 용해 버퍼에 담급니다. 암소 상태의 4°C에서 1시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.배양 후, 각 조직 샘플당 준비한 8장의 슬라이드 중 6장을 용해 완충액에서 꺼내고, 상온의 효소 완충액으로 각각 5분씩 3회 세척합니다. 그 다음, 조직지로 과잉 용액을 닦아냅니다. 이어서, hOGG1 및 Endo III 효소 스톡을 효소 완충액으로 1:1000 비율로 희석하여 얼음 위에 둡니다.젖은 종이 타월을 깐 페트리 접시에 슬라이드를 놓고, 각 처리군 슬라이드에 다음 용액들을 200 microliters씩 도포합니다. 슬라이드 2개에는 효소 버퍼만, 슬라이드 2개에는 hOGG1 용액을, 나머지 슬라이드 2개에는 Endo III 용액을 처리한 후 Parafilm으로 슬라이드를 덮습니다. 그 다음 슬라이드를 37 degrees Celsius에 두고, Endo III 처리 슬라이드와 대조군 슬라이드는 45분 동안, hOGG1 처리 슬라이드는 30분 동안 배양합니다.배양 후 슬라이드의 액체를 제거하고, 대조군 슬라이드의 경우 차가운 중화 완충액을 사용하여 잔류 세제와 염을 제거하십시오. 그런 다음 증류수를 사용하여 효소 처리된 슬라이드를 헹굽니다. 빈 공간이 생기지 않도록 슬라이드를 수평 젤 전기영동 탱크에 무작위로 배치하십시오.그다음 기포가 생기지 않도록 주의하며 슬라이드가 겨우 덮일 때까지 갓 제조한 전기영동 완충액을 탱크에 채웁니다. 전원 공급 장치를 cm당 0.7 V로 설정하고, DNA의 변성과 알칼리에 민감한 손상의 발현을 위해 슬라이드를 알칼리 완충액에서 20분 동안 배양합니다. 슬라이드 배치, 완충액 온도 및 전류를 기록합니다.풀림을 위한 배양 후, 전기영동 탱크를 4 °C에 둡니다. 그런 다음 전원 공급 장치의 Run 버튼을 누르고, 필요한 경우 버퍼 레벨을 슬라이드 바로 위까지 높이거나 낮추어 전류를 300 mA로 조정합니다. 샘플을 20분 동안 실행한 후, 다시 슬라이드 배치, 버퍼 온도 및 전류를 기록합니다.전기영동 후 슬라이드를 탱크에서 조심스럽게 꺼내어 중화 완충액에 담가 과량의 알칼리를 중화합니다. 그다음 슬라이드의 액체를 제거하고 중화 과정을 두 번 더 반복합니다. 차가운 100% ethanol을 사용하여 슬라이드를 5분 동안 고정합니다.슬라이드를 공기 중에서 건조시킨 후 건조한 환경에 보관하십시오. DNA를 염색하려면 슬라이드를 판지 또는 금속 트레이에 놓고, 각 슬라이드에 200 microliters의 핵산 형광 염색 작동 용액을 추가한 후 커버슬립으로 덮으십시오. 슬라이드를 빛으로부터 차단하고 최소 30분 동안 배양하십시오.그 다음 슬라이드를 판독하기 위해, 커버글라스를 건드리지 않도록 주의하며 과잉 염색액을 부드럽게 닦아냅니다. 이어서 비디오 카메라가 장착된 형광 현미경의 스테이지 위에 코멧 슬라이드를 올리고, 세포가 포함된 시야를 무작위로 선택합니다. 코멧 분석 소프트웨어를 실행한 후, 마우스를 사용하여 세포를 선택하고 해당 세포의 코멧 헤드 중심을 왼쪽 클릭합니다.소프트웨어가 세포의 파라미터를 계산하여 데이터 파일에 추가합니다. 현재 시야 내의 모든 세포에 대한 점수 측정이 완료되면, 다른 시야로 이동하여 나타나는 적절한 코멧 세포를 편향 없이 반복하여 측정합니다. 슬라이드당 10개의 무작위 시야와 최소 75개의 코멧을 측정하십시오.마지막으로, 추후 분석을 위해 데이터를 스프레드시트에 저장합니다. 이전에 보고된 바와 같이, CPA는 성별 특이적 방식으로 쥐의 간 종양을 유발하는 합성 호르몬 약물이며, 수컷 쥐의 경우 암컷에 비해 간 종양 유발에 5배 더 높은 용량이 필요합니다. 여기서 보여준 바와 같이, in vivo 알칼리 혜성 분석(alkaline comet assay)과 효소 변형 혜성 분석(enzyme-modified comet assay) 결과, 수컷의 간에서 DNA 손상의 유의미한 증가를 유발하기 위해서는 암컷보다 5배 더 높은 CPA 용량이 필요함이 입증되었습니다.하이드록시스테로이드 설포트랜스퍼라제(Hydroxysteroid sulfotransferase, HST)는 성체 암컷 쥐에서 성체 수컷 쥐보다 15배 더 높게 발현됩니다. HST 대사는 CPA가 DNA 결합 대사물질로 활성화되는 과정에서 속도 결정 단계입니다. 여기서 볼 수 있듯이, CPA로 유도된 산화적 DNA 손상은 일반적으로 암컷보다 수컷 쥐의 간에서 더 크게 나타났으며, 따라서 수컷 쥐의 종양 형성 과정에서는 속도 결정 단계가 될 가능성이 더 낮았습니다.이 표들에 보고된 바와 같이, CPA 처리된 쥐 간의 조직병리학적 평가 결과, 약제 유도성 세포 사멸이나 괴사의 증거가 나타나지 않았으며, 이는 양성 코멧 분석 결과가 세포 독성의 이차적 영향이 아니었다는 이전의 결론을 확인시켜 주었습니다. 이 절차를 수행할 때는 단일 세포 현탁액을 수집하고 코멧 분석 슬라이드를 가능한 한 빨리 준비하는 것이 중요합니다. 개발 이후, 이 기술은 유전 독성학 분야의 연구자들이 거의 모든 동물 조직과 인간 샘플에서 DNA 손상 및 복구를 정량적으로 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.본 영상을 시청한 후, 동물 조직의 단일 세포 수준에서 쥐의 DNA 절단과 산화적 DNA 손상을 동시에 측정하기 위해 in vivo 알칼리 코멧 분석법과 효소 변형 코멧 분석법을 함께 사용하는 방법에 대해 더 잘 이해하시기를 바랍니다. DNA 손상 시약 작업은 매우 위험할 수 있음을 유념하십시오. 이러한 절차를 수행할 때는 항상 개인 보호 장구를 착용하시기 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 독소루비신 처리된 세포에서 단일 및 이중 가닥 DNA 절단을 모두 정량화하는 알칼리 단일 세포 전기영동 분석을 시연합니다. 알칼리성 조건은 DNA 염기쌍 사이의 수소 결합을 방해하여 DNA 가닥의 완전한 풀림 및 분리를 초래합니다. 이를 통해 전기영동 시 아가로스 겔에서 손상되지 않은 DNA 단편과 손상된 DNA 단편의 차등 이동을 가능하게 하여 손상되지 않은 DNA가 원형 혜성 머리를 형성하고 손상된 DNA 단편이 빠르게 이동하는 혜성 모양의 구조를 드러낼 수 있습니다.

알칼리성 단세포 겔 전기영동: 화학요법 후 개별 암세포의 DNA 손상을 정량적으로 추정하기 위한 민감한 기술

이 비디오는 유해 물질에 노출된 후 DNA 손상을 감지하기 위한 혜성 분석을 보여줍니다. 알칼리성 조건에서는 DNA가 풀리고 변성되며, 전기영동에 따라 손상되지 않은 DNA와 손상된 DNA가 아가로스 겔에서 다르게 이동하여 혜성 모양의 구조를 형성합니다. 천천히 이동하는 손상되지 않은 DNA는 원형 혜성 머리를 형성하고, 빠르게 이동하는 손상된 DNA 조각은 길쭉한 혜성 꼬리를 형성합니다.

세포의 DNA 손상 감지를 위한 Comet Assay

혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트와 hippocampal 뉴런을 포함한 모든 세포의 DNA에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다. 방법은 DNA 손상의 양의 차이로 인해 전기 분야에서 DNA의 차동 마이그레이션을 활용합니다.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

유세포 분석을 이용하여 DNA 이중 가닥 절단의 마커인 인산화된 히스톤 H2AX를 측정하여 마우스 비장 림프구에서 만성 생체 내 저선량 조사로 인해 유발될 수 있는 DNA 손상 수준 및 DNA 복구 용량의 변화를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

혜성 분석 결과 단일과 이중 가닥 DNA를 포함 하 여 DNA 손상 나누기를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 화학 요법의 치료 효과 평가 하기 위해 암 세포의 DNA 손상을 측정을 설명 합니다.

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

이 프로토콜은 DNA 손상을 평가하기 위해 혜성 분석실험에 사용하기 위해 부검 시 고품질 냉동 조직 샘플을 준비하기 위한 몇 가지 절차를 설명합니다: 1) 다진 조직, 2) 위장관에서 긁힌 상피 세포, 3) 큐브 조직 조직 다진 장치를 사용하여 균질화를 요구하는 샘플.

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

여기서 우리는 병변 유도 후 DNA를 복제하는 데있어 단일 가닥 DNA 갭을 조사하기 위해 DNA 섬유 분석의 두 가지 변형을 설명합니다. S1 섬유 분석은 ssDNA 특이적 S1 엔도뉴클레아제를 사용하여 복제 후 갭을 검출할 수 있게 하며, 갭 채우기 분석은 갭 복구의 시각화 및 정량화를 가능하게 합니다.

DNA 섬유 분석을 이용한 인간 세포에서의 복제 후 갭 축적 및 복구 검출

혜성 분석은 DNA 손상을 감지하는 널리 사용되는 수단입니다. 이 연구는 혜성 분석의 대표적인 변형에서 슬라이드를 실행하는 접근 방식을 설명합니다. 이 접근 방식은 샘플 수를 크게 늘리는 동시에 분석 실행 시간, 슬라이드 조작 횟수 및 젤 손상 위험을 줄였습니다.

세포 DNA 손상 평가를 위한 고처리량 혜성 분석 접근법

학습하세요 쥐 간 세포에서 DNA 가닥 나누기 및 산화적 DNA 손상을 측정하는 알카라인 혜성 분석법을. 효소 수정 기법을 활용한 이 방법은 유전독성학 연구와 규제 안전성 평가에 필수적인 도구입니다.

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

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