낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱
April 11th, 2016
종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 습식 실험실 시약, 표준화된 대조군 및 생물정보학 제품군을 결합한 까다로운 암 표본의 염기서열분석을 위한 포괄적인 시스템을 설명하는 것입니다. 이 방법은 정확한 DNA 변이 분석 및 해석을 달성하기 위해 소량 및 저질 종양 생검의 염기서열을 분석하는 방법과 같은 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 염기서열 분석이 어려운 샘플은 사용 가능한 DNA 수량이 제한되어 있고 단일 소스 시약 및 대조군과 완전히 통합된 생물정보학 소프트웨어를 사용하여 빠르고 안정적으로 분석할 수
있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 표적 NGS의 복잡성으로 인해 어려움을 겪을 수 있으며, 이 방법은 이를 단순화합니다. 그러나 라이브러리 정량화 및 시료 풀링 절차는 모든 시료 라이브러리에서 균일한 적용 범위를 달성하기 위해 특별한 주의가 필요합니다. 이 프로토콜은 까다로운 암 표본의 염기서열분석을 위해 습식 및 건식 벤치 프로세스를 통합합니다.
첫 번째 단계는 실시간 PCR로 증폭할 수 있는 DNA 템플릿 사본의 수를 결정하기 위한 DNA의 정량화 및 적격성 평가입니다. 시료 정량 분석 및 품질 관리를 위한 절차를 시작하려면 마이크로 원심분리기 튜브에 충분한 양의 마스터 믹스를 준비합니다. 샘플당 5마이크로리터의 2x 마스터 믹스, 0.5마이크로리터의 프라이머 프로브 믹스, 0.5마이크로리터의 억제 프라이머 프로브 믹스, 0.05마이크로리터의 ROX 및 2.95마이크로리터의 희석제를 사용하십시오.
96웰 플레이트의 각 웰에 9마이크로리터의 마스터 믹스를 추가합니다. DNA 표준물질 1마이크로리터를 복제하여 첨가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 혼합합니다. 핵산 샘플이 잘 혼합되었는지 확인한 후 샘플 1마이크로리터를 마스터 믹스에 추가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 혼합합니다.
밀봉된 플레이트를 PCR 시스템에 놓습니다. 섭씨 95도에서 10분의 PCR 주기를 수행한 다음 섭씨 95도에서 15초, 섭씨 60도에서 1분씩 40주기씩 수행합니다. 각 중복 DNA 표준물질에 대한 선형 회귀 플롯을 생성하여 qPCR 데이터를 분석합니다.
그런 다음 마이크로리터당 기능적 또는 증폭 가능한 복제 수에서 알려지지 않은 DNA의 농도를 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 계산합니다. 시료 정량화 및 품질 관리 후 다음 단계는 단일 튜브 멀티플렉스 PCR에 의한 암 핫스팟 염기서열을 강화하는 것입니다. 유전자 특이적 또는 gsPCR은 21개의 암 유전자에서 46개의 유전자좌를 농축하기 위해 수행됩니다.
시료당 다음 부피, 5마이크로리터의 2x 증폭 마스터 믹스 및 1마이크로리터의 범암 프라이머 패널을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에 충분한 양의 gsPCR 마스터 믹스를 준비합니다. 6마이크로리터의 gsPCR 마스터 혼합물을 96웰 플레이트의 각 웰에 분취합니다. 각 핵산 샘플 4마이크로리터를 개별 웰에 추가합니다.
위아래로 5회 피펫팅하여 혼합합니다. 적절한 컨트롤을 포함합니다. 다음 PCR 주기 동안 밀봉된 플레이트를 thermocycler에 놓습니다.
섭씨 95도에서 분, 섭씨 95도에서 15초, 섭씨 60도에서 4분, 섭씨 95도에서 15초, 72도에서 4분, 23사이클로
5분.마지막으로 섭씨 72도에서 10분 연장한 후 섭씨 4도에서 유지합니다. 유전자 특이적 PCR 후 tag-PCR을 10회 수행하여 차세대 염기서열분석과의 호환성을 위해 플랫폼 특이적 어댑터를 통합합니다. 7.5 마이크로리터의 2x 인덱스 마스터 믹스와 5.5 마이크로리터의 인덱스 코드를 96 웰 플레이트의 지정된 웰에 추가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 혼합합니다.
gsPCR 플레이트를 조심스럽게 열고 마스터 믹스와 함께 새 플레이트에 2마이크로리터의 gsPCR 제품을 추가합니다. 뒤에 오는 PCR 주기, 95 섭씨 온도에 5 분, 95 섭씨 온도에 30 초, 55 섭씨 온도에 30 초, 및 10 주기 동안 72 섭씨 온도에 1 분 및 72 섭씨 온도에 10 분의 마지막 연장 뒤에 오는 PCR 주기를 위한 thermocycler에 있는 밀봉한 판을 두십시오. 그 후 섭씨 4도에서 유지합니다.
tag-PCR 후, 라이브러리 정제 및 크기 선택은 마그네틱 비드 화학을 사용하여 수행됩니다. 11마이크로리터의 라이브러리 순수 분취 마그네틱 비드를 96웰 플레이트의 별도 웰에 추가하여 이 절차를 시작합니다. tag-PCR 플레이트를 열고 10마이크로리터의 tag-PCR 산물을 비드에 첨가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 혼합합니다.
혼합물을 실온에서 4분 동안 배양합니다. 96웰 플레이트를 마그네틱 스탠드에 4분 동안 놓습니다. 96웰 플레이트를 스탠드에 놓고 피펫으로 상층액을 제거하고 폐기합니다.
프로토콜 텍스트에 설명된 대로 세척 버퍼가 포함된 에탄올로 비드를 두 번 세척한 후 실온에서 비드를 2분 동안 건조시킨 다음 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 각 웰에 20마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 비드를 재현탁합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다.
96웰 플레이트를 마그네틱 스탠드에 4분 동안 다시 놓고 18마이크로리터의 투명한 상등액을 조심스럽게 제거하고 새 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 이 프로토콜의 다음 단계는 상대적으로 경쟁력 있는 real time PCR을 통해 각 정제된 시료 라이브러리를 정량화하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 샘플당 부피 5마이크로리터의 2x LQ 마스터 믹스, 2마이크로리터의 LQ 프라이머 프로브 믹스, 0.5마이크로리터의 LQ 표준 및 0.5마이크로리터의 LQ ROX를 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에 충분한 양의 LQ 마스터 믹스를 준비합니다.
8마이크로리터의 LQ 마스터 믹스를 광학 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 별도의 웰에 라이브러리의 연속 희석 2마이크로리터, LQ 양성 대조군 2마이크로리터, LQ 희석제 2마이크로리터를 넣고 위아래로 5회 피펫팅하여 혼합합니다. 밀봉된 플레이트를 PCR 시스템에 배치하고 각 샘플에 대해 FAM 및 VIC 검출기를 모두 할당합니다.
다음 사이클링 조건을 사용하여 95°C에서 5분, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분을 40주기로 PCR 증폭을 수행합니다. 그런 다음 각 샘플의 농도를 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 계산합니다. 라이브러리 정량화 후, 각 샘플 라이브러리는 측정된 농도를 기반으로 정규화되고 염기서열분석을 위해 단일 튜브로 풀링됩니다.
단순화된 분석 모듈은 라이브러리 정규화 및 샘플 풀링을 위한 계산을 용이하게 하는 데 사용됩니다. 라이브러리를 정규화하려면 먼저 풀링할 고유한 쌍별 인덱스를 포함하는 모든 샘플에서 나노몰 단위의 중간 농도를 결정합니다. 다음으로, 모든 샘플의 중간 농도에 5를 곱한 다음 개별 농도로 나누어 풀링할 개별 샘플 부피를 마이크로리터 단위로 결정합니다.
각 샘플에 대한 정규화된 부피를 단일 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 샘플 풀을 생성합니다. 염기서열분석 희석제를 사용하여 샘플 풀을 1.25나노몰로 희석합니다. phix control V3가 있는 곳에서 변성하여 염기서열분석을 위해 샘플 풀을 준비합니다. 15마이크로리터의 1.25나노몰 샘플 풀, 3마이크로리터의 0.5나노몰 픽스 및 2마이크로리터의 1N 수산화나트륨 풀을 결합합니다.
짧은 와류와 원심분리 후, 실온에서 5분 동안 배양합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 8마이크로리터의 사전 냉각된 HT1 하이 버퍼에 8마이크로리터의 라이브러리를 추가합니다. 600마이크로리터의 변성 및 희석된 라이브러리를 시약 카트리지의 위치 번호 17에 추가합니다.
마이크로 원심분리기 튜브에서 각 염기서열분석 프라이머 4마이크로리터를 636마이크로리터의 HT1 높은 완충액으로 별도로 희석합니다. 600마이크로리터의 희석된 read-1 염기서열분석 프라이머를 염기서열분석 시약 카트리지의 18번 위치에 추가합니다. 600마이크로리터의 희석된 인덱스 판독 프라이머는 19번 위치로, 600마이크로리터의 희석된 read-2 염기서열분석 프라이머는 20번 위치에 배치합니다.
차세대 염기서열분석 기기에 시약을 로드하고 제조업체 지침에 따라 2 x 150 사이클 염기서열분석 실행을 쌍으로 수행합니다. 마지막으로, 동반 생물정보학 소프트웨어를 사용하여 염기서열분석 데이터를 분석합니다. 벤치탑 염기서열분석기를 사용하여 단일 NGS 실행으로 총 90개의 샘플을 처리할 수 있습니다.
표시된 데이터 세트의 경우 샘플에는 세포주, 잔류 임상 공식 및 고정 파라핀 임베딩(FFPE) 및 합성 템플릿 DNA가 포함되었으며 높은 깊이의 염기서열분석과 균일한 적용 범위를 제공했습니다. 이상치는 템플릿 대조군이 없는 것, 복제 수 증폭이 큰 하나의 세포주 DNA로 구성된 희석 시리즈, 전분석 qPCR 기반 QC 분석에 의해 PCR 억제로 표시된 FFPE DNA 1개로 구성되었습니다. 46개 앰플리콘에 걸친 커버리지 균일성은 3개의 서로 다른 연산자를 사용하여 서로 다른 저품질 FFPE DNA 샘플에 대해 유지되었습니다.
FFPE 종양에서 알려진 5% BRAF V600E 돌연변이로 구성된 DNA 대조군 혼합물은 400개의 증폭 가능한 사본을 입력하는 3명의 조작자에 의해 평균 5.2% 플러스 마이너스 1.3%의 표적 BRAF 돌연변이를 갖는 것으로 보고되었습니다. 복제 수 증폭이 입증된 세포주 및 FFPE DNA 샘플의 희석은 EGFR 및 KRAS의 증폭에 대한 의존성을 나타냅니다. 당연히 FFPE DNA 입력은 증폭 가능한 사본 50개 또는 벌크 DNA 1.2나노그램으로 줄어들 수 있습니다.
거짓 긍정 호출 없이 알려진 돌연변이의 검출을 보존합니다. 일단 마스터되면 이 기술은 적절하게 수행된다면 한 번에 24개의 샘플로 구성된 배치 크기에 대해 약 3시간 30분의 수작업으로 11시간 내에 완료할 수 있습니다.
개요
본 기사는 특히 저품질 및 저량의 종양 생검 같은 어려운 종양학 시료에 대한 표적 차세대 시퀀싱(NGS)을 위한 포괄적인 시스템을 제시합니다. 이 통합된 접근법은 습식 실험실 시약, 표준화된 컨트롤, 그리고 전용 생물정보학 스위트를 결합하여 정확한 DNA 변이체 분석을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 종양학
- 유전체학
- 생물정보학
배경
- 저품질 종양 생검의 시퀀싱은 암 연구에서 중요한 도전입니다.
- 기존 방법은 종종 DNA 양이 부족하여 실패합니다.
- 이 연구는 어려운 시료에 대한 신뢰할 수 있는 시퀀싱 방법의 필요성에 대응합니다.
- 습식 및 건식 실험실 과정의 통합은 시퀀싱 워크플로우의 전반적인 효율성을 향상시킵니다.
연구 목적
- 저품질 암 시료에 대한 표적 NGS를 단순화하는 시스템을 개발합니다.
- 정확한 DNA 변이체 분석을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 개선된 데이터 해석을 위한 생물정보학 도구를 통합합니다.
사용된 방법
- 실시간 PCR을 이용한 시료 정량화 및 품질 관리.
- 암 핫스팟 서열 강화를 위한 유전자 특이적 PCR.
- 플랫폼 특이적 어댑터를 통합하기 위한 Tag-PCR.
- 자기 구슬 화학을 이용한 라이브러리 정제 및 크기 선택.
주요 결과
- 이 방법은 저량의 종양 생검을 성공적으로 분석했습니다.
- 통합된 시스템으로 정확한 DNA 변이체 분석을 달성했습니다.
- 표준화된 컨트롤은 결과의 신뢰성을 향상시켰습니다.
- 생물정보학 스위트는 효과적인 데이터 해석을 용이하게 했습니다.
결론
- 이 통합된 시스템은 어려운 암 시료 시퀀싱에 있어서 중요한 발전을 나타냅니다.
- 표적 NGS에 익숙하지 않은 연구자들을 위한 워크플로우를 단순화합니다.
- 이 접근법은 종양학에서 정확한 유전체 통찰력의 잠재력을 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This integrated NGS system addresses a critical bottleneck in oncology drug development: the reliable sequencing of low-quality, low-quantity tumor biopsies that are common in clinical and preclinical samples. By linking wet bench sample qualification with dry bench variant calling, the method improves predictive confidence in target validation and reduces false-negative calls in heterogeneous cancer specimens. This enables more accurate molecular profiling for target identification and biomarker-driven trial design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional DNA quantification to determine amplifiable copy number, supporting hypothesis testing in low-input tumor models.
- Operational Value: Uses single-source reagents and analytically-defined controls to reduce variability in early-stage target de-risking.
- Predictive Value: Links pre-analytical QC data to variant calling algorithms, improving accuracy in distinguishing true mutations from artifacts in heterogeneous samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative library normalization and pooling based on measured concentration, enabling uniform coverage across multiplexed amplicons.
- Operational Value: Streamlines workflow to produce 24 sequence-ready libraries in a single day, increasing throughput for assay validation campaigns.
- Platform Compatibility: Uses tag-PCR to embed platform-specific adaptors, ensuring compatibility with common benchtop NGS instruments for scalable screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports sequencing of FFPE and FNA tumor biopsies, which are clinically relevant models for preclinical-to-clinical translation.
- Biomarker Alignment: Enables sensitive detection of variants at low allele frequency (e.g., 5% BRAF V600E) using as few as 400 amplifiable DNA copies.
- Risk-Adjusted Advancement: Two-tiered control system (positive and inhibition controls) safeguards call accuracy, reducing false negatives in low-quality samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where accurate genotyping of preclinical models informs compound selection and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Quantifies functional DNA and enriches cancer hotspot sequences, enabling reliable genotyping of genetically complex tumor models.
- Screening: Delivers normalized, pooled libraries with uniform coverage, supporting reliable compound sensitivity and resistance profiling.
- Analytics: Integrates pre-analytical QC metrics into bioinformatics variant calling, improving measurement accuracy and reproducibility.
- Translational Research: Uses clinically relevant sample types (FFPE, FNA) to bridge discovery and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Modular design allows incorporation of new gene content, supporting long-term reuse across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves variant call accuracy in low-quality samples by linking wet bench QC to dry bench analysis.
- Operational Value: Reduces hands-on time to ~3.5 hours per 24-sample batch through streamlined, integrated workflow.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on reliable molecular data from challenging specimens, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by increasing confidence in preclinical genotype-phenotype correlations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR-based DNA quantification and qualification for accurate input normalization.
- Needs access to thermocycler, magnetic bead purification system, and benchtop NGS instrument with compatible optics.
- Demands standardization of library quantification and pooling procedures across users to maintain coverage uniformity.
- Must adapt input volume and cycling conditions based on sample quality, as indicated by pre-analytical QC flags (e.g., PCR inhibition).
- Dependent on consistent use of analytically-verified controls to distinguish true variants from false positives or negatives.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
DNA Functional Quantification and Quality Control
2:55
Library Preparation
5:22
Library Purification and Size Selection
6:50
Library Quantification
8:21
Library Normalization and Sample Pooling
9:23
Sequencing
11:09
Results: High-depth, Multiplexed Sequencing and Sensitive Analysis of Challenging Cancer Specimens by Targeted NGS
13:01
Conclusion
