레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

이 프로시저의 전체적인 목표는 벌크 게놈 DNA로부터 레트로바이러스 통합 부위를 PCR로 증폭하고, 결과물인 DNA 라이브러리를 시퀀싱하여 정확한 통합 위치를 참조 게놈에 매핑하는 것입니다. 이 방법은 호스트 게놈 전체에 걸친 통합 부위의 분포를 분석함으로써 기초 및 임상 레트로바이러스학의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 DNA 시퀀싱 깊이가 깊다는 점과, 한 번의 시퀀싱 런에서 많은 샘플을 멀티플렉싱할 수 있다는 점입니다.

트랜스펙션 하루 전, 5개의 100 millimeter 디쉬 각각에 보충제가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium 10 milliliters와 함께 3.3 × 10⁶ 개의 HEK293T 세포를 분주합니다. 다음 날, 시판되는 트랜스펙션 시약 또는 인산칼슘을 사용하여 전장 레트로바이러스 분자 클론을 포함하는 플라스미드 10 micrograms 또는 엔벨로프가 제거된 single round 벡터 9 micrograms와 VSV-G 발현 컨스트럭트 1 microgram의 혼합물을 세포에 트랜스펙션합니다. 해당 혼합물을 세포 배지에 한 방울씩 천천히 첨가하십시오.

형질전환 후, 5% carbon dioxide가 공급되는 가습 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 37 °C로 배양합니다. 약 48시간 후, 부피 피펫을 사용하여 바이러스가 포함된 세포 배지를 수확하고, 중력 흐름 방식으로 0.45 micron 필터에 통과시킵니다. 그다음, 4 °C에서 200,000 Gs로 1시간 동안 초원심분리하여 바이러스를 농축합니다.

원심분리 후, DMEM FPS가 약 500 microliters 남을 때까지 상층액을 제거하고 바이러스 펠릿을 재현탁합니다. 20 units의 DNase를 첨가하고 37 degrees Celsius에서 1시간 동안 배양합니다. 제조사의 지침에 따라 HIV-1 p24 항원 캡처 키트를 사용하여 p24 농도를 측정합니다.

감염 전날, 6-웰 플레이트의 웰당 2.5 mL의 DMEM FPS에 3.0 × 10⁵개의 HEK293T 세포를 분주하고 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 500 µL의 신선한 DMEM FPS 내에서 최종 바이러스 p24 농도가 500 ng/mL가 되도록 세포를 감염시킵니다. 조직 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다.

2시간 후, 37°C로 예열된 DMEM FPS 2mL를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 감염 48시간 후, 배지를 제거하고 2mL의 인산완충생리식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. 37°C로 예열된 Trypsin-EDTA 0.5mL를 첨가하여 세포를 회수하고, 몇 초 후 웰의 세포가 떨어져 나왔는지 육안으로 확인합니다.

다음으로, 미리 데워둔 DMEM FPS 2 mL를 첨가하고 볼륨메트릭 피펫으로 10회 천천히 파이펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 이 용액을 미리 데워둔 DMEM FPS 18 mL가 들어 있는 75 cm² 조직 배양 플라스크로 옮긴 후, 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 감염 후 최소 5일이 지나면, 이전과 동일한 방법으로 세포를 수확하고 파이펫팅을 통해 미리 데워둔 DMEM FPS 5 mL에 재현탁합니다.

용액을 상온에서 2,500 Gs로 5분간 원심분리한 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 마지막으로, 시판되는 키트를 사용하여 세포 펠렛에서 genomic DNA를 추출합니다. 제공된 이온 교환 컬럼에서 pH 8.5의 millimolar Tris-HCL 200 microliters를 사용하여 DNA를 용출합니다.

게놈 DNA를 초음파 처리한 후, PCR 정제 키트를 사용하여 초음파 처리된 DNA를 정제하십시오. 다음으로, 말단 수선 키트를 사용하여 DNA를 수선하십시오. 이전과 동일하게 DNA를 정제한 후, Klenow Exo-Minus 효소를 사용하여 DNA에 A-tail을 추가하십시오.

또는 제한효소 절단을 통한 단편화를 위해, 5'TA 오버행을 생성하는 효소 칵테일과 상류 바이러스 LTR의 하류 지점을 절단하는 BglII와 같은 비호환 효소를 사용하여 게놈 DNA를 절단하십시오. 최종 부피 100 µL에서 10 µg의 게놈 DNA를 절단합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

최종 DNA는 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하십시오. 초음파 처리된 DNA에 사용할 링커는 호환 가능한 T 3' 오버행을 포함해야 하며, MseI로 절단된 DNA용 링커는 호환 가능한 5'TA 오버행을 포함해야 합니다. 35 µL의 Tris-HCL EDTA 완충액에 10 µM의 짧은 링커 가닥과 긴 링커 가닥을 넣고 90 °C까지 가열한 후, 분당 1 °C씩 천천히 실온까지 냉각하여 어닐링을 시작하십시오.

다음으로, 게놈 DNA 샘플당 최소 4개의 병렬 라이게이션 반응을 준비하며, 최종 부피 50 microliters에 1.5 micromolar 라이게이트 링커, 1 microgram의 단편화된 DNA, 그리고 800 units의 T4 DNA ligase를 포함시킵니다. 12 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 라이게이션합니다. 초음파 처리를 통해 준비된 샘플의 경우, 정제된 라이게이션 반응물을 상위 LTR의 하류에서 절단하는 제한 효소로 소화시킵니다.

제조사 권장 조건 하에 적절한 효소 100 units를 사용하여 밤새 반응시킵니다. 최종 산물은 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하십시오. 여기에 표시된 시약들을 사용하여 1차 PCR을 준비합니다.

다음 매개변수를 사용하여 1차 PCR을 수행합니다: 94 °C에서 2분간, 이어서 94 °C에서 15초, 55 °C에서 30초, 68 °C에서 45초 과정을 30회 반복합니다. 마지막으로 68 °C에서 10분간 반응시킵니다. 1차 반응물들을 하나로 모은 후, 이전과 동일한 방법으로 DNA를 정제합니다.

그런 다음 여기에 표시된 시약들을 포함하여 2차 PCR을 준비합니다. 1차 PCR과 동일한 사이클링 파라미터를 사용하십시오. 2차 반응의 DNA를 풀링하고 정제한 후, 품질 관리 및 차세대 염기서열 분석을 수행하고, 프로토콜의 서면 부분에 기재된 상세 지침에 따라 통합 부위를 분석하십시오.

왼쪽에 표시된 제한 효소 소화 또는 오른쪽에 표시된 초음파 처리를 통해 준비된 라이브러리의 통합 부위를 웹 로고 소프트웨어를 사용하여 정렬하였습니다. 희석 시리즈의 각 희석 단계가 그림 상단의 원액 DNA부터 하단의 최대 희석 배수인 1:15,625까지 묘사되어 있습니다. 감염된 세포 DNA의 희석도가 높아질수록 확실성의 정도는 감소합니다.

이 이미지는 50,000개의 고유한 게놈 부위로 구성된 매칭 무작위 대조군의 시퀀스 로고를 보여줍니다. 이와 대조적으로 MRC 데이터셋에서 정렬된 무작위 부위들은 뚜렷한 수준의 염기 선호도를 생성하지 못했음에 유의하십시오. 숙달되면 게놈 DNA로부터 통합 부위 라이브러리를 3일 만에 준비할 수 있습니다.

따라서 초기 감염부터 바이오인포매틱스 완료까지의 통합 부위 매핑(Integration site mapping)은 약 2주 만에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 통해 수천 또는 수백만 개의 고유한 레트로바이러스 통합 부위를 카탈로그화할 수 있으며, 삽입 부위와 게놈 주석 간의 연관성을 정량화하기 위한 다양한 분석을 수행할 수 있습니다.