Name: 레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 배우세요 레트로바이러스 통합 부위를 PCR 증폭하고 차세대 시퀀싱으로 분석하는 방법을. HEK293T 세포를 이용한 이 기술은 게놈 DNA 매핑을 통해 바이러스-숙주 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 Engelman 실험실에서 레트로 바이러스 통합 사이트 시퀀싱을위한 NGS 프로토콜을 확립하는 것이 중요했다 우리의 동료 스티븐 휴즈와 조언 헨리 레빈에 감사하고 있습니다. 이 작품은 AI039394과 (ANE에) AI052014 및 AI060354 (AIDS 연구를위한 하버드 대학 센터) 건강의 미국 국립 연구소에 의해 부여 지원되었다.

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게놈 분포 패턴의 매핑을 통한 바이러스 감염의 초기 단계에서 레트로 바이러스 통합 위치의 분석을위한 프로토콜은 기술되어있다. 이 프로토콜은 레트로 바이러스 감염 가능한 모든 세포 유형에 적용 가능하다. 또한, 상기 분석 파이프 라인은 6.4 × 10 -5의 MOI로 감염 개시의 게놈 DNA에 상당 희석액에서 고유 삽입 부위의 충분한 수를 복구 할 가능성 매우 민감하다. 세포의 작은 분획은 프로 바이러스 통합 항구 것이다 낮은 바이러스 부하를 포함 할 수있다 감염된 환자의 시료에 적용 할 때 감도는 프로토콜 특히 유용한다. 이 필드 36,38,41-43에서 이전의 방법론 논문과 일치,이 프로토콜의 생물 정보학 부분에 여러 단계 시퀀스 데이터의 큰 파일을 처리하기위한 사용자 정의 스크립트의 개발 혜택을 누릴 것입니다. BLAT (58)는 엄마는하지만이 프로토콜에 설명 된 유틸리티를 pping, 사용자가 적절한 대안이 될하기 위해 나비 넥타이 67 (ht...

숙주 세포 게놈 내로 바이러스 DNA (vDNA)의 통합은 레트로 바이러스 생활주기에서 필수적인 단계이다. 통합은 안정적으로 삽입 된 프로 바이러스 (1)의 구축을 초래할 두 가지 촉매 공정을 행한다 바이러스 인테그라 제 효소 (IN)에 의해 달성된다. 서브 유닛의 IN 합체 2-4에 의해 함께 고정 단부 vDNA와 고차 intasome 형성 역전사를 통해 생성 된 선형 vDNA의 단부를 결합. 절단 IN 3&#39;- 처리로 알려진 과정에서 서열 3 &#39;하류 불변 5&#39;-CA-3에서의 단부 vDNA&#39;는 &#39;3 오목 떠나는 각 vDNA 5-8 말단에 반응성 히드 록 실기로 종료한다. intasome이어서 호스트의 대형 어셈블리의 일부와 사전 통합 복합체 (PIC) 9-11로 알려진 바이러스 단백질과 핵으로 가져옵니다. 셀룰러 대상 DNA (tDNA)를 발생한 후, I​​N은 3&#39;- 수산기 촉진제 vDNA를 사용UPS는 지그재그 방식으로 tDNA의 상단과 하단 가닥을 절단하고 동시에 가닥 전송 12, 13의 과정을 통해 tDNA 5 &#39;인산 그룹에 vDNA에 합류한다. 로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 통합 사이트 환경 설정. 로컬, 합의 통합 사이트는 약 다섯 vDNA 삽입 사이트 14, 15에서 상류 BP와 하류 10에서 걸쳐 약하게 보존 팔린 드롬 tDNA 시퀀스로 구성되어 있습니다. 전 세계적으로 레트로 바이러스는 특정 염색질 주석 (16)을 대상으로. 엡실론, 렌티 및 spuma을 통해 알파 - 일곱 가지 레트로 바이러스 장군이있다. gammaretroviruses 우선적으로 전사 시작 사이트 (TSSs) 및 활성 증강 영역 18 ~ 20에 통합하면서 HIV-1을 포함 렌티 바이러스는 적극적으로 전사 유전자 (17)의 신체 내에서 통합을 선호. 대조적으로, spumavirus 강하게 heterochrom으로 바이어스이러한 유전자 가난한 얇은 관련 도메인 (21) 등의 ATIC 지역. 지역 tDNA 기본 환경 설정 IN과 tDNA 13,22,23 사이의 핵 단백질 연락처의 특정 네트워크에 의해 결정 큰 부분에 있습니다. 렌티 바이러스 및 gammaretroviruses를 들어, 게놈 주석에 통합 상대는 IN과 동족 세포 요인 24-27 사이의 상호 작용에 의해 지배 큰 부분이다. 요인의 상호 작용 25-27,29-32 각각 로컬 및 글로벌 수준의 통합을 재 타겟팅 전략을 입증 IN-호스트 인 - tDNA 상호 작용 네트워크 13,22,23,28의 세부 사항을 변경 및 중단하거나 다시 엔지니어링. 레트로 바이러스 통합 사이트 카탈로그 사용한 DNA 시퀀싱 방법의 힘은 지난 수십 년 동안 상당히 증가 하였다. 통합 사이트는 연구 33, 34 당 고유 한 사이트의 단지 소수를 산출하기 힘든 정화 및 수동 복제 기술을 사용하여 선구적인 작업에 복구되었다.천 (17)에 수백로 증가 외인성 조직 배양 세포 감염에서 회복 사이트의 수와 필드 변환 인간 및 마우스 초안 게놈 개별 통합 사이트 매핑하는 기능 LTR 호스트 DNA 접합부 LM-PCR 증폭의 조합 18. NGS 방법과 LM-PCR의 최근 조합 라이브러리 깊이 폭등을 보냈습니다. 라이브러리 고유 시퀀스 19-21,39 수백만 얻을 수 DNA 클러스터링의 사용을 통해 시퀀싱하는 동안 특히 pyrosequencing는 수십 고유 통합 사이트 30,35-38 수천 정도의 수득 하였다. 여기에서 우리는 증폭 DNA 클러스터링 NGS를 사용하여 레트로 바이러스 통합 사이트를 시퀀싱에 최적화 된 LM-PCR 프로토콜을 설명합니다. 상기 방법은 이에 sequen 전에 추가 어댑터에 결찰 공정에 대한 요구를 배제, 증폭 된 DNA 분자에 따라서 직접 PCR 프라이머에 어댑터 서열을 요구하고 통합한다(40)을 향. 생물 정보학 분석 파이프 라인은, 게놈 기능을 관련의 독특한 통합 사이트 매핑 LTR-호스트 DNA 접합에 대한 원시 시퀀싱 데이터의 분석에서, 또한 일반적으로 설명한다. 이 분야에서 종래 방법론 36,38,41-43 프로토콜에서 설정된 우선 순위에 따라서, 사용자는 스크립트 정보학 파이프 라인의 특정 단계의 완료를 돕기 위해 개발 될 수있다. 유틸리티 및 프로토콜의 민감도 감염 대략 다수 1.0 (MOI)뿐만 아니라,이 DNA의 적정 계열에 감염된 조직 배양 세포에서 HIV-1 삽입 부위를 증폭하여 시퀀싱 한 매핑 대표 데이터로 도시되어 6.4 × 10 -5의 대략 동등한 MOI을 얻었다 15625 :에 감염되지 않은 세포의 DNA를 희석 한 최대 희석 단계를 5 배.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>HEK293T 세포와 호환되는 표준 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>최적의 바이러스 생산을 위해 다양한 혈청을 사전 스크리닝해야 할 수 있음</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline</td><td>Mediatech</td>에 첨가할 항생제<td>21-040-CV</td><td>세포 세척에 사용</td></tr><tr><td>트립신 EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>조직 배양 플레이트에서 부착 세포를 분리하는 데 사용</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td></td><td>SL100688 DNA 트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>0.45 &micro; m Filters</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>바이러스 입자 함유 세포 배양 매체를 필터링하는 데 사용</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>바이러스 스톡에서 캐리오버 플라스미드 DNA를 분해하는 데 사용</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Antigen Capture Assay</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>바이러스 생산 DNeasy</td></tr><tr><td>Blood & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>세포에서 게놈 DNA를 정제하는 데 사용</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>이 초음파 발생기 모델로 듀티 사이클, 5%; 강도, 3, 버스트당 사이클, 200, 시간, 80</td></tr>초 <tr><td>뉴클레아제-프리 워터</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>샘플 교차 오염 가능성을 줄이기 위해 시판되는 물을 사용하는 것이 좋습니다</td></tr>. <tr><td>QIAQuick PCR 정제 Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>라이브러리 건설 중 DNA를 정제하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Epicenter</td><td>ER81050</td><td>초음파 처리된 DNA 샘플의 DNA 끝을 수리하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-5' exo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>dATP와 함께 A-tail repaired DNA fragments</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Deoxyadenosine triphosphate</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>게놈 DNA 절단을 위한 제한 엔도뉴클레아제</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>업스트림 HIV-1 U5 서열 T4 DNA 리가아제의 증폭을 억제하기 위한 제한 엔도뉴클레아제</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>호환 가능한 DNA 말단의 공유 결합을 위한 효소</td></tr><tr><td>DNA 올리고뉴클레오티드</td><td>통합 DNA 기술</td><td>맞춤형</td><td>회사에서 올리고를 정제하도록 합니다. HPLC 정제는 DNA에 충분합니다 < 30 개의 뉴클레오티드; PAGE 정제 더 긴 DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>장점 2: 중합효소 혼합물</td><td>Clontech</td><td>639202</td> PCR dNTP(100mM 용액<td>)용 DNA 중합효소를 함유한 상업용 혼합물</td></tr><tr><td>Thermo</td> <td>Scientific</td><td>R0181</td>: <td>4가지 화학물질을 멸균수로 얼음 위에 희석하여 중간 농도인 2.5mM에 도달합니다. dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>DNA 농도</td></tr> <tr><td>측정을 위한 분광광도계Qubit 형광측정기</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&reg; 3.0</td><td>통합 사이트 라이브러리 DNA 농도를 확인하는 데 사용되는 형광측정기</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>통합 사이트 라이브러리 DNA 크기 분포를 확인하는 테이프 기반 분석</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>NGS에 사용</td></tr></tbody></table>

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 dna 매핑

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

모두 로컬 및 글로벌 규모에 레트로 바이러스 전시 서명 통합 환경 설정. 여기서는 결찰 매개 PCR (LM-PCR) 증폭 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 레트로 바이러스 통합 위치의 다양한 라이브러리 (1)의 생성에 대한 상세한 프로토콜, (2) 각각의 바이러스에의 게놈 위치에 맵핑을 제시 BEDTools 접합을 이용하고, (3)에 대한 통계 관련 데이터를 분석하는 호스트. 감염된 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 제한 효소에 의해 또는 초음파 분해에 의해 분열된다. 적합한 DNA 최종 복구 한 후, 이중 가닥의 링커는 DNA 종료에 라이 게이션하고, 반 중첩 PCR은 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR) 단부와 결찰 링커 DNA 모두에 상보적인 프라이머를 사용하여 수행된다. 상기 증폭 된 PCR 프라이머는 별도의 어댑터 결찰에 대한 요구 사항을 부정, NGS 동안 DNA 클러스터링에 필요한 시퀀스를 수행한다. 품질 관리 (QC)의 DNA 단편 크기 분포를 평가하고 적응 수행NGS 이전에 DNA의 결합을 어. 시퀀스 출력 파일 LTR 함유 판독 필터링되고 LTR 링커 정의 서열 얻어 자른된다. 트림 숙주 세포 서열은 BLAT를 사용하여 참조 게놈 맵핑하고 참조 게놈의 독특한 지점에 최소 97 % 동일성 필터링된다. 고유 한 통합 사이트는 다양한 게놈 기능에 인접한 염기 (NT) 순서 및 유통 기준에 대해 자세히 조사하고 있습니다. 이 프로토콜을 이용하여, 매우 복잡한 통합 사이트 라이브러리 사흘 게놈 DNA로부터 구성 될 수있다. 통합 사이트 분석에 민감한 조직 배양 세포의 외인성 바이러스 감염을 포함하여 전체 프로토콜에 따라서 약 1-2 주에 수행 될 수있다. 이 기술의 최근의 애플리케이션은 HIV 감염 환자에서 통합 부위의 길이에 관계 분석.

표 4는 대표적인 실험 결과는 감염된 세포 배양 물로부터 통합 사이트 회수 NGS의 감도를 도시한다. 감염되지 않은 세포의 DNA 직렬 평균 모든 세포는 하나의 통합 (40)를 포함하는 감염으로부터 게놈 DNA를 희석하여 사용 하였다. 15,625 : 희석액 (1)의 최대 희석 다섯 단계로 제조 하였다. 적정 시리즈의 게놈 DNA는 초음파에 의해 조각난 또는 제한과 소화에 의해 LM-PCR 다음 MseI 및 BglII에를, 엔도 뉴 클레아했다. 고유 통합 사이트의 수뿐만 아니라, 선택된 게놈 주석에 사이트 매핑 기단의 수는, 상기 프로토콜에 따라 계산 하였다. 데이터 분석은 이론적으로 하나의 15,625에 감염 된 세포에서 준비 도서관에서 발견 한 유일한 통합 사이트 (양의 1 ~ 2 %가 깔끔한 게놈 DNA로부터 회수) 수십를 한 것으로 밝혀졌습니다. </p&gt; <p class="jove_content" fo:ke...

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

이 프로시저의 전체적인 목표는 벌크 게놈 DNA로부터 레트로바이러스 통합 부위를 PCR로 증폭하고, 결과물인 DNA 라이브러리를 시퀀싱하여 정확한 통합 위치를 참조 게놈에 매핑하는 것입니다. 이 방법은 호스트 게놈 전체에 걸친 통합 부위의 분포를 분석함으로써 기초 및 임상 레트로바이러스학의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 DNA 시퀀싱 깊이가 깊다는 점과, 한 번의 시퀀싱 런에서 많은 샘플을 멀티플렉싱할 수 있다는 점입니다.트랜스펙션 하루 전, 5개의 100 millimeter 디쉬 각각에 보충제가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium 10 milliliters와 함께 3.3 × 10⁶ 개의 HEK293T 세포를 분주합니다. 다음 날, 시판되는 트랜스펙션 시약 또는 인산칼슘을 사용하여 전장 레트로바이러스 분자 클론을 포함하는 플라스미드 10 micrograms 또는 엔벨로프가 제거된 single round 벡터 9 micrograms와 VSV-G 발현 컨스트럭트 1 microgram의 혼합물을 세포에 트랜스펙션합니다. 해당 혼합물을 세포 배지에 한 방울씩 천천히 첨가하십시오.형질전환 후, 5% carbon dioxide가 공급되는 가습 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 37 °C로 배양합니다. 약 48시간 후, 부피 피펫을 사용하여 바이러스가 포함된 세포 배지를 수확하고, 중력 흐름 방식으로 0.45 micron 필터에 통과시킵니다. 그다음, 4 °C에서 200,000 Gs로 1시간 동안 초원심분리하여 바이러스를 농축합니다.원심분리 후, DMEM FPS가 약 500 microliters 남을 때까지 상층액을 제거하고 바이러스 펠릿을 재현탁합니다. 20 units의 DNase를 첨가하고 37 degrees Celsius에서 1시간 동안 배양합니다. 제조사의 지침에 따라 HIV-1 p24 항원 캡처 키트를 사용하여 p24 농도를 측정합니다.감염 전날, 6-웰 플레이트의 웰당 2.5 mL의 DMEM FPS에 3.0 × 10⁵개의 HEK293T 세포를 분주하고 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 500 µL의 신선한 DMEM FPS 내에서 최종 바이러스 p24 농도가 500 ng/mL가 되도록 세포를 감염시킵니다. 조직 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다.2시간 후, 37°C로 예열된 DMEM FPS 2mL를 각 웰에

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Research

연구

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Biology

생물학

선형 증폭 중재 (LAM)-PCR은 게놈에 바이러스 벡터를 통합의 정확한 위치를 식별하기 위해 개발 된 방법입니다. 이 기술은 유전자 치료 환자 등 새로운 벡터 기술, T-세포의 다양성, 암 줄기 세포 모델의 바이오 안전성에 클론 역학을 공부하는 우수한 방법으로 진화하고있다...

선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

삽입 돌연변이 유발은 기능적 게놈 요소를 식별하기 위한 순 유전학의 필수 도구입니다. 여기에서는 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 검출하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)에 대해 설명합니다.

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

마우스 뒷면에서 게놈 DNA의 분리

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

풀링된 유전자 시퀀싱은 큰 무리에서 복잡한 phenotypes와 관련된 희귀한 변종을 탐지하기위한 빠르고 비용 효율적인 전략이다. 여기 가시가 소프트웨어 패키지를 사용하여 32 암 관련 유전자의 풀링, 차세대 시퀀싱의 전산 분석을 설명합니다. 이 방식은 확장성, 그리고 관심의 표현형에 적용됩니다.

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