레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

이 절차의 전반적인 목표는 PCR이 벌크 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고 결과 DNA 라이브러리를 염기서열 분석하여 정확한 통합 위치를 참조 게놈에 매핑할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 숙주 게놈 전체의 통합 부위 분포를 분석하여 기본 및 임상 레트로바이러스학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 DNA 염기서열분석 깊이와 한 번의 염기서열분석 실행으로 많은 샘플이 다중화될 수 있다는 사실입니다.

형질주입 하루 전, 5개의 100mm 접시에 각각 10ml를 보충한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium의 세포를 10 HEK293T 3.3배로 플레이트화합니다. 다음 날, 시판되는 transfection 시약 또는 인산칼슘을 사용하여 전장 레트로바이러스 분자 클론 10마이크로그램을 운반하는 플라스미드 또는 9마이크로그램의 enveloped elided single round 벡터와 1마이크로그램의 VSV-G 발현 구조체로 세포를 transfection합니다. 혼합물을 세포 배지에 적방울로 첨가합니다.

transfection 후 섭씨 37도의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다. 약 48시간 후, 부피 측정 피펫을 사용하여 바이러스가 포함된 세포 배지를 수확하고 중력 흐름에 의해 0.45 미크론 필터를 통과시킵니다. 다음으로, 200, 섭씨 4도에서 1시간 동안 000Gs의 초원심분리로 바이러스를 집중시킵니다.

원심분리 후 약 500마이크로리터의 DMEM FPS가 남을 때까지 상층액을 제거하고 바이러스 펠릿을 재현탁합니다. DNase 20 단위를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 HIV-1 p24 항원 포획 키트를 사용하여 p24 농도를 측정합니다.

감염 전날, 6개의 웰 플레이트에서 웰당 2.5ml의 DMEM FPS 2.5ml에 3.0 곱하기 5번째 HEK293T 세포를 플레이트하고 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 500마이크로리터의 새로운 DMEM FPS에서 밀리리터당 500나노그램의 최종 바이러스 p24 농도로 세포를 감염시킵니다. 조직 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다.

2시간 후, 섭씨 37도로 예열된 DMEM FPS 2ml를 각 웰에 넣고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.감염 후 48시간이 지나면 배지를 제거하고 2mL의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척합니다. 섭씨 37도로 예열된 0.5ml의 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 수확하고 몇 초 후에 웰의 세포 이탈 여부를 육안으로 검사합니다.

다음으로, 예열된 DMEM FPS 2ml를 추가하고 부피 피펫으로 위아래로 10회 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 18ml의 예열된 DMEM FPS가 들어 있는 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크에 용액을 옮기고 조직 배양 인큐베이터로 다시 넣습니다. 감염 후 최소 5일 후에 이전과 같이 세포를 채취하고 피펫팅을 통해 예열된 DMEM FPS 5ml에 재현탁합니다.

용액을 실온에서 2, 500Gs로 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡인하고 폐기합니다. 마지막으로, 시판되는 키트를 사용하여 세포 펠릿에서 게놈 DNA를 추출합니다. 제공된 이온 교환 컬럼에서 DNA를 pH 8.5에서 200마이크로리터의 밀리몰 Tris-HCL로 용리합니다.

게놈 DNA의 초음파 처리 후, PCR 정제 키트를 사용하여 초음파 처리 된 DNA를 정제합니다. 다음으로, 말단 복구 키트를 사용하여 DNA를 복구합니다. 이전과 같이 DNA를 정제한 후, A는 Klenow Exo-Minus 효소를 이용하여 DNA를 테일

또는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의한 단편화를 위해 5'TA 돌출부를 생성하는 효소 칵테일과 상류 바이러스 LTR에서 다운스트림으로 절단하는 BglII와 같은 호환되지 않는 효소로 게놈 DNA를 절단합니다. 100마이크로리터의 최종 부피에서 10마이크로그램의 게놈 DNA를 절단합니다. 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

PCR 정제 키트를 사용하여 최종 DNA를 세척합니다. 초음파 처리된 DNA와 함께 사용할 링커는 호환 가능한 T 3' 돌출부를 포함해야 하며, MseI 분해 DNA용 링커는 호환 가능한 5'TA 돌출부를 포함해야 합니다. 섭씨 90도까지 가열하고 분당 섭씨 1도 단위로 실온으로 천천히 냉각하여 35마이크로리터의 Tris-HCL EDTA 완충액에 있는 짧고 긴 링커 가닥의 10마이크로몰을 어닐링하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 50마이크로리터의 최종 부피에 1.5마이크로몰 결찰 링커, 단편화된 DNA 1마이크로그램 및 T4 DNA 리가제 800단위를 포함하는 게놈 DNA 샘플당 최소 4개의 병렬 결찰 반응을 준비합니다. 섭씨 12도에서 밤새 합자합니다. 초음파 처리로 준비된 샘플의 경우, 업스트림 LTR에서 다운스트림으로 절단하는 제한 효소로 정제된 ligation 반응을 분해합니다.

하룻밤 동안 제조업체가 권장하는 조건에서 적절한 효소 100 단위를 사용하십시오. PCR 정제 키트를 사용하여 최종 산물을 정제합니다. 여기에 표시된 시약을 사용하여 1차 PCR을 준비합니다.

2분 동안 섭씨 94도, 15초 동안 섭씨 55도, 45초 동안 섭씨 68도의 30회 주기와 같은 매개변수를 사용하여 첫 번째 라운드 PCR을 실행합니다. 섭씨 68도에서 10분 동안 마무리합니다. 1차 반응을 모으고 이전과 같이 DNA를 정제합니다.

그런 다음 여기에 표시된 시약을 포함하는 두 번째 라운드 PCR을 준비합니다. 첫 번째 라운드 PCR과 동일한 사이클링 매개변수를 사용합니다. 2차 반응에서 DNA를 풀링하고 정제한 후 품질 관리 및 차세대 염기서열분석을 수행하고 프로토콜의 서면 부분에 있는 자세한 지침을 사용하여 통합 부위를 분석합니다.

왼쪽과 같이 제한 효소를 사용한 소화로 준비된 라이브러리의 통합 사이트 또는 오른쪽과 같이 초음파 처리는 웹 로고 소프트웨어를 사용하여 정렬되었습니다. 적정 시리즈의 각 희석액은 그림 상단의 깔끔한 DNA에서 하단의 1에서 15, 625까지의 최대 희석까지 묘사되어 있습니다. 확실성의 정도는 감염된 세포 DNA의 희석이 증가함에 따라 감소합니다.

이 이미지는 50, 000개의 고유한 게놈 부위의 일치하는 무작위 제어를 위한 염기서열 로고를 보여줍니다. 대조적으로, MRC 데이터 세트에서 정렬된 무작위 사이트는 상당한 수준의 기본 선호도를 생성하지 못했습니다. 마스터링이 완료되면 3일 만에 게놈 DNA에서 통합 부위 라이브러리를 준비할 수 있습니다.

따라서 초기 감염에서 완료된 생물정보학에 이르기까지 통합 부위 매핑은 약 2주 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 수천 또는 수백만 개의 고유한 레트로바이러스 통합 부위를 목록화할 수 있으며, 삽입 부위와 게놈 주석 간의 연관성을 정량화하기 위해 다양한 분석을 수행할 수 있습니다.