Name: 인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에 E. 대장균 X 선 결정학에 대한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 인간 노로바이러스 돌출 도메인을 E. coli에서 발현 및 정제하여 X선 결정학용 고순도 단백질을 얻는 방법을. 이 프로토콜은 4주 이내에 완료되며 구조생물학 연구에 활용됩니다.

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이 연구의 자금은 CHS 재단에서 제공했습니다. 우리는 결정 스크리닝을 위한 하이델베르크 대학의 우수 클러스터 CellNetworks 및 싱크로트론 방사선 시설 제공을 위한 유럽 싱크로트론 방사선 시설 내의 단백질 결정화 플랫폼을 인정합니다.

1. P 도메인 복제 <ol><li> 노로 바이러스 균주의 서열 정렬하여 P 도메인 코딩 영역을 결정합니다 (예를 들어, GII.10 변형, GenBank 등록 : AF504671, PDB-ID : 3ONU) 6. 또한, P 영역 (도 2a)의 C 말단에있는가요 성 영역을 제거한다. E.위한 DNA를 코돈 - 최적화 대장균 발현 및 BamHI에 서브 클론을 위해 (터미널 N) 및 NotI을 (C 터미널) 제한 다음 사이트 pMalc2x 발현 벡터 6,7로 영역을 코딩 P 도메인을 포함한다. 참고 : P 도메인 코딩 영역은 최적화 된 상용 서비스에 의해 합성된다. 지역 (삽입)를 코딩 P 도메인은 약 1 길이 킬로바이트 및 표준 전송 벡터에서 제공합니다. </li><li> 각각의 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)로 제한 제조업체 버퍼를 공급하여 37 ℃에서 1 시간 동안 효소로 전사 벡터의 2 μg의 다이제스트. </li><li> 1 % 아가로 오스 겔에서 분해 삽입 별개135 V에서 20 분 동안 시판 키트를 사용하여 겔로부터 삽입 DNA를 정제. </li><li> 각 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)에 제한은 37 ° C에서 1 시간 동안 효소로이 벡터의 2 μg의 소화하여 pMalc2x 발현 벡터를 준비한다. (1.3) 상술 한 바와 같이, 아가 로스 젤에서 벡터를 정제. 참고 : 두 샘플 (1.2 및 1.4)는 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> 실온 (RT) (그림 2B와 2C)에서 15 분 1 μL T4-DNA 리가 아제 (40 U / ㎖)와 BamHI 및 NotI에 제한 부위에서 절단 pMalc2x 벡터로 정제 인서트를 결찰. 삽입 비율 1 : 3 (분자량)를 pMalc2x 벡터와 벡터의 적어도 20 NG를 사용한다. 결찰 혼합물은 일반적으로 20 ~ μL이다. </li><li> 50 μL 화학적 관할 E.로 결찰 믹스 2㎕의 변형 대장균 DH5α 표준 변환 프로토콜 (얼음에서 10 분, 열 쇼크 42 ° C에서 45 초)을 이용하여 박테리아 세포 성장이 60037 ° C에서 1 시간 동안 ㎕의 SOC 배지. 원심 분리기는 형질 전환 된 세포는 1,000 XG에 3 분 동안, 상층 액을 제거하고, SOC 매체의 30 μL에 펠렛을 재현 탁. <ol><li> 선택에 100 ㎍ / ml 암피실린, LB 한천 플레이트 상 변환 혼합 플레이트, 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장한다. 적어도 다섯 식민지를 선택합니다. </li></ol></li><li> 다섯 식민지의 각각에 대해, 50 μg의 / ㎖ 앰피 실린 (LB-A)로 보충 LB-매체의 2-3 ml의 문화를 접종하고 37 ℃에서 160 rpm으로 밤새 진탕 성장한다. </li><li> 상용 키트를 사용하여 야간 문화 플라스미드의 압축을 풉니 다. pMalc2x 정방향 프라이머 (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;)와 염기 서열에 의한 P 도메인 삽입의 존재를 확인하고 프라이머 역 (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> 2. P 도메인 표현 <ol><li> MBP-그의-P 도메인에 대한 pMalc2x 벡터 코딩 - (400 NG / μL 150 NG / μL) 1 μl를 변환관할 E.의 50 μL에 융합 단백질 표준 변환 프로토콜 (얼음에서 10 분, 열 쇼크 42 ° C에서 45 초)을 이용하여 대장균 BL21 세포는 37 ° C에서 1 시간, 600 μL의 SOC 배지에서 자란다. 밤새 160 rpm으로 37 ° C에서 LB-A의 120 ml의에 하위 문화. </li><li> 차 배양 (100 일)와 LB-A의 (1.5 L 매체 각각 예를 들어, 6 × 5 L 플라스크) 구리터을 접종한다. 0.6 - 외경 (600)가 0.4에 도달 할 때까지 160 rpm으로 37 ° C에서 진탕 세포 성장. 그 후, ~ 1 시간 동안 22 ° C까지 온도를 낮추고 다음 이소 프로필 β-D-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드의 0.66 밀리미터 (IPTG) 8 단백질 발현을 유도. 하룻밤 22 ° C (~ 18 시간)에서 세포를 성장. 온도는 다양 할 수 있지만, 우리는 22 ° C 이하를 사용하는 것이 좋습니다 있습니다. </li><li> 원심 분리 (10,543 XG, 15 분, 4 ° C)에 세​​포를 수확. 뜨는을 취소하고 -20 ° C에서 세포 펠렛을 동결. </li></ol>1 차 정제 단계 및 프로테아제 절단 <ol><li> 실험의 재현성 및 안정성을 보장하기 위해 재고 솔루션에서 단백질 정제 단계 동안 사용되는 버퍼를 준비합니다. 고정 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피에 대 한 4 개의 서로 다른 버퍼 (IMAC), 이미 다졸의 다른 농도를 포함하는 각 (10 밀리미터, 20 밀리미터, 50 밀리미터, 250 밀리미터)를 준비합니다. SEC에 대해보다 높은 염 농도와 겔 여과 완충액 (GFB)을 제조하지만, 이미 다졸없이. 탈 이온수를 사용하여 0.45 ㎛의 공극 크기를 사용하기 전에 모든 버퍼를 필터링. 참고 : 자세한 버퍼 준비 방식은 표 1을 참조하십시오. </li><li> 아홉 리터의 문화에서 세포 펠렛을 해동하고 4 ° C에서 150 ml의 PBS에 용해. 세포를 파괴하는 세포 현탁액을 2 분 (파워 130 W, 20 %의 진폭, 펄스 주파수 50 %) 3 회 초음파 처리. 초음파 동안 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li><li> CentrifuGE는 초음파 세포 현탁액 (43,667 × g으로 30 분, 39 ° C에서)이 발현 된 단백질을 함유하는 상청액으로부터 세포 찌꺼기를 분리한다. 상층 액을 수집하고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 세척 및 니켈 (Ni) 크로마토 그래피 컬럼에서 10 mM의 이미 다졸 버퍼 -NTA 아가 로스 비드 10 ㎖ (= 1 열 볼륨 [CV]) 슬러리를 평형. 단계 3.3에서 뜨는로 평형 니켈 구슬을 추가 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 발현 느린 회전 4 ° C에서 30 분 동안 품어 함유. </li><li> 배양 후, 크로마토 그래피 컬럼에 전체 니켈 비드 단백질 혼합물을 적용합니다. 10 밀리미터, 20 밀리미터, 10 밀리미터, 다음 20 mM의 마지막 50 밀리미터 (그림 3A)로 시작하는 50 mM의 이미 다졸 버퍼, 각각 5 이력서와 함께 천천히 열을 씻으십시오. </li><li> 250 mM의 이미 다졸 완충액 (도 3a)을 사용하여 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 용출시켰다. 용출 동안에, 융합 단백질의 용출 (OD (28)의 증가를 확인 OD를 280 ㎚를 점검를 0㎚). 외경의 280 ㎚가 ~ 0.1에 떨어질 때까지 용출을 계속합니다. 10 mM의 이미 다졸 버퍼의 적어도 10 약력이어서 250 mM의 이미 다졸 완충액 (적어도 10 CV들) 과량으로 비드를 세척 하였다. 두 번째 정제 단계 (섹션 4)의 구슬을 저장합니다. </li><li> 12 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (10 × 8cm) (9) (도 3A)을 이용하여 SDS-PAGE로 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질의 존재를 확인한다. 45에서 겔 전기 영동을 수행하고 45 분 동안 200 V. </li><li> ~ 3 mg / ml의 최종 농도로 (상업적 농축기를 사용하여, 예) 용출 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 농축시킨다. (~ 1 : 100)을 10 mm의 2 L에 대해 투석하는 동안 이미 다졸 버퍼를 HRV-3C 프로테아제와 MBP-그의-P 도메인 융합을 절단 밤새 4 ° C (도 3A)에서. 농축 된 단백질의 최종 부피에 따라 투석 카세트 또는 투석 튜브로 투석을 수행한다. 주 : 단백질 HRV-3C 단백질 분해 효소의 양은분열은 특정 프로테아제 활성에 따라 계산되고, 발현 량에 변화하고, SDS-PAGE의 결과로부터 추정 될 수 용출 된 융합 단백질의 양 (3.7 (2 U / ㎕의 1 U 100 단백질 μg의을 절단하기에 충분하다) ). </li></ol> 4. 2 차 정화 단계 <ol><li> 10 mM의 이미 다졸 버퍼의 단계 3.6에서 니켈 구슬 평형. </li><li> 느린 회전으로 ​​39 ° C에서 30 분 동안 평형화 니켈 비드 (4.1)와 (P 절단 도메인 MBP 단백질 및 HRV 프로테아제 함유)을 단계 3.7에서 투석 된 단백질을 부화. </li><li> 컬럼에 니켈 비드 혼합물을 적용하고 흐름을 통해 (절단 P 도메인) (그림 3B)를 수집합니다. 외경의 280 ㎚가 ~ 0.1에 도달 할 때까지 열을 벗기으로 단백질 농도를 측정한다. 참고 : MBP-그분은 니켈 구슬 (그림 3B)에 결합 된 상태로 유지해야합니다. </li><li> 1과 함께 SDS-PAGE를 이용하여 절단 된 P 영역의 존재를 확인2 % 겔은 다음과 같이 (도 3b) 상술. ~ 3 ㎎ / ㎖로 용출 P 도메인을 집중 이후 SEC의 정제 GFB에 대한 4 ° C에서 하룻밤 투석. </li></ol> 제 3 차 정제 단계 <ol><li> 세척 펌프 및 HPLC 정화 시스템의 파이프 및 사전 평형 증권 거래위원회 (SEC) 열을 GFB와 (자료 목록 참조). </li><li> 농축 된 시료의 양에 따라, 1 ㎖ (3 ㎖까지)을 superloop (최대 12 ㎖) 또는 루프를 사용 / 분의 유속으로 컬럼에 P 도메인을 주입한다. 분사가 완료되면 / 분으로 2.5 ml의 유량을 증가시킨다. </li><li> 외경이 증가하고, P 도메인 열 벗기 같이, 1.5 ㎖로 분획을 수집한다. 12 % 겔 SDS-PAGE를 이용하여 분획을 확인 (도 4a 및도 4b). 수영장 만 순수한 분수와 ~ 3 ㎎ / ㎖하고 ~ 8 ㎎ / ㎖에 집중한다. 참고 : 110 ~ 후 ㎖ (공극 부피) 대부분의 불순물이 320 ml의 침대 볼륨과 SEC 컬럼에서 용출됩니다. 그만큼P 도메인은 일반적으로 이량 체로서 용출된다. 는 P 도메인 이량 체의 용출 시간 / 볼륨은 SEC 컬럼의 사전 등급 (PG)에 따라 달라집니다. </li></ol> 는 P 도메인 6. 결정화 <ol><li> 초기 결정화 스크리닝 ~ 3 ㎎ / ㎖, 8 ㎎ / ㎖에서 P 도메인을 사용합니다. 384 시중에서 판매하는 선별 조건을 초기 화면에 대한 농도 별 P 도메인의 최소 100 μl를 준비합니다. 리저버 어머니 용액 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트 형식에서 18 ° C에서 스크리닝을 수행하고 드롭 0.2 μL 머더 용액 0.2 μL 단백질로 구성된다. </li><li> 반복 성공적으로 결정화 조건을 최적화 할 수 있습니다. 따라서, 3 행을 포함 15 웰 플레이트를 사용합니다. 100 % 어머니 솔루션, 90 %의 어머니 용액과 10 %의 물과 80 %의 어머니 용액과 20 %의 물과 세 번째 행과 두 번째 행과 첫 번째 행을 설정합니다. 2 μL (1 μL 단백질 + 1 μl의 어머니 용액) 500의 방울 크기를 사용하여81, 저수지 볼륨으로 어머니 솔루션의 리터. </li><li> 공 결정화 리간드와 P 도메인에 최적화 된 결정 조건을 사용합니다. 6.2에 설명 된대로 판을 준비합니다. 대신에 2 ㎕의 방울 크기, 1 μL 모 용액 1 ㎕의 단백질 및 1 ㎎ / ㎖ 농도의 리간드 1 μl를 함유 방울을 설정. </li><li> 싱크로트론 방사선을 이용한 단결정의 데이터 세트를 수집한다. 초기 탐색 모델 6,10-13 같은 높은 서열 유사성과 출판 P 도메인 구조를 이용하여 분자량 교환을 수행한다. 참고 : 리간드의 존재는 전자 밀도의 취소 모델링 덩어리로 표시됩니다. </li></ol>

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여기, 우리는 높은 품질과 수량에서 노로 바이러스의 P 도메인의 발현 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. Noroviruses 잘 연구되지 ​​않고 구조적 데이터가 지속적으로 필요하다. 우리의 지식에, 다른 프로토콜 (예를 들면, GST 태그가 P 영역)을 이용하여 P 영역 생성은 지금까지 문제가되고 있으며, 노로 바이러스 호스트 상호 작용에 충분한 구조적 데이터가 누락되어있다. 방법은 여기에 설명과 함께, 우리는 최근에 결합 탄수화물 노로 바이러스의 분자 세부 사항의 이해에 크게 기여했다. 본 프로토콜은 다양한 단백질로 구성 될 수있다. 그러나,이 프로토콜의 성공적인 구현은 정제 방법의 각 부분에서 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 발현 구조체의 디자인의 중요성의 제 1 단계이다. 우리는 E.의 발현 수율을 향상시키기 위해 P 도메인 발현 구조체의 코돈 최적화를 수행 대장균 제거 rele코딩 영역 내에 존재 VANT 제한 ...

인간의 noroviruses는 급성 위장염 전 세계적으로 하나의 주요 원인이다. 이 바이러스는 노로 바이러스, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus 및 Nebovirus 포함 적어도 다섯 장군이가있는의 Caliciviridae 제품군에 속한다. 의료 시스템과 다양한 유통에 높은 영향에도 불구하고, 인간의 noroviruses의 연구는 강력한 세포 배양 시스템의 부족에 의해 방해된다. 현재까지 사용 가능한 승인 된 백신이나 항 바이러스 전략이 없다. 노로 바이러스의 주요 캡시드 단백질, VP1이 되나, 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P)이 영역들로 분할 될 수있다. P 개의 도메인이가요 성 힌지 (H) 영역으로 S 도메인에 접속된다. P 개의 영역은 바이러스 캡시드의 최 외측 부분을 형성하는 반면, S 도메인은 바이러스 RNA의 주위에 지지체를 형성한다. 박테리아에서 발현 될 때 P 도메인은 생물학적으로 중요한 이합체로 어셈블. 는 P d를IMER은 탄수화물 구조와 상호 작용, 타액에 용해 항원으로 존재하는 특정 숙주 세포 3에서 볼 수 있습니다 히스 - 혈액형 항원 (HBGAs를)라고. 는 P 도메인 HBGA의 상호 작용은 감염 4 중요한 것으로 생각된다. 사실, 최근의 보고서는 합성 HBGAs 또는 시험 관내 5 인간의 노로 바이러스 감염 박테리아를 HBGA가 발현의 중요성을 밝혔다. noroviruses의 숙주 세포 부착에 관한 현재의 연구는 주로 곤충 세포 혹은 대장균 (대장균)에서 발현 된 재조합 P 도메인으로 표현 될 수있는 바이러스 입자 (VLP를)로 수행된다. 원 해상도의 P HBGA 도메인 상호 작용을 이해하기 위해, P-도메인 HBGA 복잡한 구조는 X 선 결정학을 이용하여 해결 될 수있다. 여기서, 우리는 높은 수량과 품질 P 도메인의 생산은 X 선 crystall 용으로 사용될 수 있도록 P 도메인 발현 및 정제를위한 프로토콜을 기술ography. 또한,이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역과 비 구조 단백질에 적용 할 수있다. P 개의 도메인 E. 대한 코돈 최적화 대장균 발현과 표준 전송 벡터에 클로닝. P 개의 도메인이어서 폴리 히스티딘 (그의) 태그 및 프로테아제 절단 부위 다음된다 만노오스 결합 단백질 (MBP)를 코딩하는 발현 벡터로 재 클로닝된다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질로 표현 E. 대장균은 세 정제 단계 하였다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질은 고정화 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC)를 이용하여 정제한다. 다음에, 융합 단백질은 인간 리노 바이러스 (HRV) -3C 프로테아제 및 P 영역이 분리되어로 절단된다 MBP-그의 부가 IMAC 정제 단계에 의해. 마지막으로, P 도메인은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 이용하여 정제한다. 정제 된 P 영역은 X 선 결정학에 사용될 수있다. 단백질 결정화 조건의 스크리닝 PERFO 인다른 P 도메인 단백질 농도를 사용하여 시판의 스크리닝 키트 rmed. 결정 성장이 관찰되고, 가장 유망한 조건이 최적화된다. 방법은 여기에 설명과 함께, 그것은 미만 사주 내에서 구조화 단백질 유전자에서 갈 수 있습니다. 따라서, P 도메인의 발현, 정제, 결정화의 우리의 방법은 분자 수준에서 노로 바이러스 - 호스트 상호 작용을 연구하고 최신 백신 디자인 및 약물 검사를 지원하기 위해 중요한 데이터를 제공하기에 적합하다.

<table><tbody><tr><td>P domain DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt Gene Synthesis</td></tr><tr><td>pMalc2x&nbsp; vector</td><td>요청</td><td></td><td></td>시</tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column Chromatography Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2.5 x 10 cm, 다른 크기</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>다양한</td> <td>사용 가능10 kDa, 30 kDa 및 50 kDa의 컷오프는</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&alpha를 사용했습니다. 유능한 세포</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) 화학적 유능한 E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C 프로테아제</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>SEC 열</td></tr><tr><td>JCSG 코어 스위트</td><td>Qiagen</td><td>다양한</td><td>4 각 96 웰</td></tr><tr><td>Carbohydrates</td><td>Dextra Laboratories, UK</td><td>다양한</td><td>혈액형 제품</td></tr> 스크리닝</tbody></table>

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; e. 대장균</em&gt; x 선 결정학에 대한

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

노로 바이러스의 캡시드는 하나의 주요 구조 단백질로 구성되어, VP1 불린다. VP1은 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P) 영역으로 나누어진다. 의 S 도메인은 P 도메인 형태의 S 도메인에 바이러스 성 스파이크 반면, 바이러스 성 RNA 주위에 연속 골격을 형성하고 항원 및 호스트 세포의 상호 작용에 대한 결정을 포함한다. 는 P 영역, 즉., 생각된다 히스 - 혈액형 항원이, 노로 바이러스 감염에 대한 중요한 것으로, 탄수화물 구조를 결합한다. 이러한 프로토콜에서는, 고 수율 고품질 노로 바이러스의 P 영역의 제조 방법을 설명한다. 이러한 단백질은 항원 후 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해 X 선 결정학 및 ELISA에 사용될 수있다. P 개의 도메인 우선 발현 벡터에 클로닝 한 다음 박테리아에서 발현된다. 단백질은 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피를 고정화 것을 포함 세 단계를 사용하여 정제한다. 에서원칙적으로, 명시 클론 정제,이 프로토콜 신흥 노로 바이러스 균주 분석을위한 신속하게 시스템 개 미만 주 단백질을 결정화 할 수있다.

기술 된 프로토콜의 개략도가도 2. 프로토콜은 표적 유전자의 클로닝, 발현, 세 단계의 정제 및 결정화 포함 6 주요 부분을 포함한다.도 1에 도시 된 식 구조의 설계를 도시한다 (EC) 및 pMalc2x 발현 벡터의 특징. pMalc2x 벡터의 다중 클로닝 부위 (MCS)의 순서는 제한 프로테아제 절단 부위를 나타낸다.도 3은 제 두개의 대응하는 회로도와 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질의 대표적인 SDS-PAGE 결과 및 절단 P 영역을 도시 정화의 단계. 세 번째 정제 단계는도 4에 도시되고 정제 방식 정제 P 영역의 용출 크로마토 그램 수집 분획물의 대표적인 SDS-PAGE 결과를 포함한다. 순수한 분획을 풀링, 정광 (SDS-PAGE에 따라)ED 및 X 선 결정학에 사용. <p class="jove_content" fo:keep-t...

여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 X선 결정학 연구를 위해 극도로 순수한 단백질을 얻고자 E.coli에서 인간 노로바이러스 돌출 도메인을 생산하고 정제하는 것입니다. 단백질 발현, 정제 및 결정화에 관한 본 프로토콜은 신속하고 견고하며, 구조 단백질과 비구조 단백질 모두에 적용할 수 있습니다. 본 프로토콜의 장점은 단백질의 순도가 매우 높아 고해상도로 회절되는 결정을 형성할 수 있다는 점입니다.당사의 경험에 따르면, 용해도가 낮은 단백질의 경우 프로토콜 조정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질 발현 중의 배양 배지나 배양 온도를 변경할 수 있습니다. 우선, 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여 MBP-His-P 도메인 융합 단백질을 코딩하는 pMalc2x 벡터 1 µL를 컴피턴트 E.coli BL21 세포 15 µL에 형질전환합니다.세포에 SOC 배지 600 µL를 첨가합니다. 그리고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 형질전환된 세포를 120 mL의 LB-ampicillin 배지에 접종하여 37 °C, 160 rpm 조건에서 하룻밤 동안 계대 배양합니다.9L의 LB-ampicillin 배지에 계대 배양물을 접종합니다. 600nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.4에서 0.6에 도달할 때까지 37°C의 배양기에서 160rpm의 진탕 속도로 세포를 배양합니다. 그 후, 온도를 22°C로 낮추어 약 1시간 동안 유지합니다.수용성 단백질 발현을 위해, 낮은 농도의 IPTG로 유도하기 전 온도가 22 °C에 도달할 때까지 기다리는 것이 중요합니다. 0.66 mM의 IPTG를 사용하여 단백질 발현을 유도하십시오. 유도 후, 세포를 22 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.원심분리를 통해 세포를 회수합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 -20 °C에서 냉동 보관합니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 바와 같이 스톡 솔루션을 사용하여 단백질 정제 단계에 사용될 버퍼를 준비합니다.9L 배양액에서 얻은 세포 펠렛을 해동하고 4°C에서 150mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해합니다. 세포를 파쇄하기 위해 세포 현탁액을 2분 동안 3회 초음파 처리합니다. 초음파 처리된 세포 현탁액을 원심분리하여 세포 파편과 발현된 MBP-His-P domain 융합 단백질이 포함된 상층액을 분리합니다.상층액을 수집하고 펠릿은 제거합니다. 크로마토그래피 컬럼에서 10 millimolar imidazole 버퍼를 사용하여 10-milliliter 분량의 nickel-NTA agarose 비드 슬러리를 세척하고 평형화합니다. 평형화된 니켈 비드를 발현된 MBP-His-P 도메인 융합 단백질이 포함된 상층액에 추가하고 4 °C에서 천천히 회전시키며 30분 동안 배양합니다.배양 후, 니켈 비드-단백질 혼합물 전체를 크로마토그래피 컬럼에 도포합니다. 4°C에서 10 millimolar, 20 millimolar, 50 millimolar imidazole 완충액을 각각 5 CV씩 사용하여 컬럼을 천천히 세척합니다. 4°C에서 250 millimolar imidazole 완충액을 사용하여 MBP-His-P 도메인 융합 단백질을 용출합니다.용출 과정 중에 280 nm에서 광학 밀도를 확인하여 융합 단백질의 용출 여부를 검증하십시오. 280 nm에서의 광학 밀도가 약 0.1까지 떨어질 때까지 용출을 계속합니다. 4 °C에서 작업하며, 과량의 250 mM imidazole 버퍼로 비즈를 세척한 후, 이어서 10 mM imidazole 버퍼로 세척하십시오.비즈는 두 번째 정제 단계에서 사용하기 위해 보관하십시오. 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 MBP-His-P 도메인 융합 단백질의 존재를 확인하십시오. 그 후, 용출된 MBP-His-P 도메인 융합 단백질을 최종 농도가 약 3 mg/mL가 되도록 농축하십시오.MBP-His-P 도메인을 효과적으로 절단하는 데 필요한 프로테아제의 양을 세심하게 계산해야 합니다. 이는 용출된 융합 단백질의 총량과 SDS-PAGE 결과에 따라 달라집니다. 10 millimolar imidazole 버퍼 2L로 하룻밤 동안 4°C에서 투석하며 HRV 3C protease를 사용하여 MBP-His-P 도메인 융합 단백질을 절단하십시오.농축된 단백질의 최종 부피에 따라, 투석 카세트 또는 투석 튜브를 사용하여 투석을 수행합니다. 따로 보관해 두었던 니켈 비드를 10 millilmolar imidazole 완충액으로 평형화합니다. 절단된 P 도메인, MBP 단백질 및 HRV 프로테아제가 포함된 투석 단백질을 평형화된 니켈 비드와 함께 4°C에서 30분 동안 천천히 회전시키며 배양합니다.니켈 비드 혼합물을 컬럼에 적용하고 4°C에서 통과액을 수집합니다. 이것이 절단된 P 도메인입니다. 280 nm에서의 광학 밀도가 약 0.1에 도달할 때까지 컬럼에서 나오는 단백질의 농도를 측정합니다.MBP-His는 니켈 비드에 결합된 상태로 유지되어야 하며, 절단된 P 도메인은 통과액(flowthrough)으로 용출됩니다. 이전과 동일하게 12% 젤을 이용한 SDS-PAGE로 절단된 P 도메인의 존재를 확인하십시오. 용출된 P 도메인을 밀리리터당 약 3밀리그램으로 농축한 후, 이후의 크기 배제 크로마토그래피 정제를 위해 겔 여과 버퍼를 사용하여 4도에서 하룻밤 동안 투석하십시오.고성능 액체 크로마토그래피 정제 시스템의 펌프와 파이프를 세척하고, 겔 여과 버퍼로 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사전 평형화합니다. 농축된 시료의 부피에 따라 superloop 또는 loop를 사용하여 1 mL/min의 유속으로 P domain을 컬럼에 주입합니다. 주입이 완료되면 유속을 2.5 mL/min으로 높입니다.광학 밀도가 증가하고 P 도메인이 컬럼에서 용리되기 시작하면, 1.5 milliliters씩 분획을 수집합니다. P 도메인은 일반적으로 이량체 형태로 용리됩니다. 12% 겔을 이용한 SDS-PAGE로 분획을 확인한 후, 순도가 가장 높은 분획만을 모아 약 세 milligrams per milliliter 및 약 여덟 milligrams per milliliter로 농축합니다.초기 결정화 스크리닝을 위해 P domain을 약 3 mg/mL 및 8 mg/mL 농도로 사용하십시오. 384가지의 상용 스크리닝 조건을 이용한 초기 스크리닝을 위해 농도당 최소 100 µL의 P domain을 준비하십시오. 스크리닝은 18 °C에서 96-well 플레이트 형식으로 수행하며, 리저버에는 100 µL의 모액이 포함되고 드롭은 0.2 µL의 모액과 0.2 µL의 단백질로 구성됩니다.세 개의 행으로 구성된 15-웰 플레이트를 사용하여 성공적인 결정화 조건을 최적화하십시오. 저장조 부피로 모액 500 microliters를 사용하십시오. 첫 번째 행은 100% 모액으로 설정하십시오.두 번째 줄에는 모액 90%와 물 10%를, 세 번째 줄에는 모액 80%와 물 20%를 넣습니다. 단백질과 모액을 동일한 부피로 혼합하여 2 µL 크기의 방울로 현탁 적하법(hanging drop)을 설정합니다.P 도메인과 리간드를 공동 결정화하기 위해 최적화된 결정 조건을 사용하십시오. 이전과 동일하게 플레이트를 준비하되, 드롭 크기를 2 µL 대신 모액 1 µL, 단백질 1 µL, 그리고 1 mg/mL 농도의 리간드 1 µL를 포함하는 드롭으로 설정하십시오. 여기에 제시된 것은 대표적인 SDS-PAGE 결과로, nickel-NTA agarose 비즈를 사용하여 MBP-His-P 도메인 융합 단백질을 정제한 1차 정제 단계 후 용출된 MBP-His-P 도메인 융합 단백질의 양을 보여줍니다.절단된 P 도메인으로부터 MBP-His를 분리한 후, 용출된 절단된 P 도메인의 양을 SDS-PAGE로 분석합니다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 최종 정제 단계 이후, 결정 스크리닝을 통해 최적의 결정 조건을 도출하였습니다. 여기에서는 돌출된 도메인의 회절 패턴을 보여줍니다.원칙적으로 단백질의 클로닝, 발현, 정제 및 결정화는 4주 이내에 가능하며, 이는 본 프로토콜을 새로 나타나는 노로바이러스 변이주를 분석하기 위한 신속한 시스템으로 만들어 줍니다. 이 절차를 수행할 때는 양보다 질이 더 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 정제된 P 도메인의 높은 품질 덕분에 항체 생산을 위한 면역화, NMR 실험, ELISA 기반 연구를 포함한 추가 연구가 가능합니다.또한, 정제된 P 도메인은 항체 단편 및 나노바디와의 복합체 형성에 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜을 시청하고 나면, 고품질의 노로바이러스 P 도메인을 발현하고 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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