March 25th, 2016
호중구는 백혈구 중 가장 풍부한 유형입니다. 밀도 구배 분리 방법에 의한 인간 혈액에서 호중구의 분리 및 과립구 경로를 따른 인간 전골수구(HL60) 세포의 분화가 여기에 설명되어 있습니다. 항림프종제에 대한 림프종 세포의 민감도에 대한 역할을 테스트합니다.
이러한 절차의 전반적인 목표는 밀도 구배 원심분리를 통해 인간 혈액 샘플에서 고도로 정제된 호중구를 신속하게 분리하여 2개의 D 및 3개의 D 세포 배양 모델을 사용하여 암 치료에 대한 림프종 세포 민감도에서 호중구의 역할을 조사하는 것입니다. 이러한 방법은 암 치료에서 호중구 매개 종양 세포 반응이 어떤 역할을 하는지 등 선천성 면역 체계와 암 간의 상호 작용에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 밀도 구배 분리의 주요 장점은 세포를 기능 변경 자극에 노출시키지 않고 단기간에 순수한 면역 세포 집단을 격리할 수 있다는 것입니다.
원발성 백혈병 세포와 호중구를 분리하려면 먼저 만성 림프구성 백혈병 환자 샘플에서 EDTA 처리된 혈액 15ml를 개별 멸균 50ml 튜브에 추가합니다. RPMI 15ml로 혈액을 희석합니다. 그런 다음 혈액 아래에 15ml의 실온 밀도 구배 용액을 조심스럽게 천천히 첨가하고 층이 섞이지 않도록 주의하십시오.
원심분리로 세포를 분리한 후 4개의 뚜렷한 단계를 볼 수 있습니다. 상단에는 혈소판과 혈장, 단핵 세포의 흰색 고리, 밀도 구배 용액, 하단에는 과립구와 적혈구가 있습니다. 플라스틱 목초지 피펫을 사용하여 먼저 원발성 백혈병 세포의 흰색 고리를 새로운 50ml 튜브로 옮깁니다.
칼슘과 마그네슘이 함유된 최대 50ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 그리고 5ml의 신선한 PBS로 미각을 다시 매달아 놓으십시오. 그런 다음 PBS 45ml를 더 세포에 넣고 세포를 다시 스핀다운합니다.
두 번째 세척 후 완전한 RPMI 배지에 입천장을 다시 매달아 놓습니다. 그리고 생존 가능한 원발성 백혈병 세포의 수를 세십시오. 다음으로, 혈소판 혈장 및 밀도 구배층을 제거하고 과립구 적혈구 상에 염화나트륨 함량 PBS 25ml와 덱스트린 25ml를 추가합니다.
반전으로 튜브를 10번 혼합합니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 세포를 가라앉힙니다. 평형이 끝나면 상부 적혈구의 불량한 호중구층을 멸균된 50ml 튜브로 옮기고 세포를 스핀다운합니다.
5ml의 PBS로 입천장을 재현하고 45ml의 적혈구 용해 완충액으로 적혈구를 용해합니다. 실온에서 어둠 속에서 15분 동안 휴식을 취한 후 세포를 다시 회전시키고 PBS 50ml로 입천장을 씻습니다. 세척이 끝나면 완전한 RPMI 배지에 세포를 다시 현탁시키고 생존 가능한 호중구의 수를 계산합니다.
두 그룹의 세포를 RPMI 농도 50마이크로리터당 300, 000 세포로 희석하고 적절한 수의 5밀리리터 팩스 튜브로 샘플을 나눕니다. 원심분리 후, FBS가 보충된 50마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 분리된 세포 하위 집합의 순도를 측정하려면 APC에 접합된 항 인간 CD19 항체가 있는 원발성 백혈병 세포의 분취량을 표시하고 정제된 호중구의 분량(aliquant)을 섭씨 4도의 어둠 속에서 30분 동안 표에 나열된 대로 항 인간 항체 혼합물로 표시합니다.
배양이 끝나면 PBS가 보충된 FBS 500마이크로리터로 세포를 세척하고 신선한 FBS PBS 200마이크로리터에 입천장을 재현탁합니다. 그런 다음 유세포 분석으로 세포 집단의 순도를 분석하고 샘플의 색상 보정에 주의를 기울입니다. autologist 호중구를 가진 1 차적인 백혈병 세포를 co-culture하기 위하여는, 완전한 RPMI 매체에 있는 24개의 웰 판에 있는 백혈병 세포의 밀리리터 당 200, 000개의 세포를 보십시오.
세포를 조심스럽게 섞으십시오. 그런 다음 Brutton의 Tyrosine Kinase Inhibitor로 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 처리하고 CO2를 5%씩 투여합니다. 다음 날, 5밀리리터 플라스틱 팩스 튜브에 있는 세포의 일부분을 수집합니다.
그런 다음 세포를 회전시키고 펠릿을 FBS PBS 1밀리리터로 세척합니다. 두 번째 원심분리 후, 제조업체의 지침에 따라 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 아닐넥신 5 세포와 프로피듐 요오드화물에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 그림과 같은 게이팅 전략을 사용하여 유세포 분석으로 호중구와 1차 백혈병 세포를 분석합니다.
3D 공동 배양을 설정하려면 50, 000 RL 림프종 b-세포를 단독으로 추가하거나 멸균 15 millil 튜브에 HL60 분화된 세포와 혼합합니다. 샘플을 스핀다운하고 개구부가 2-3mm로 절단된 1mm 피펫 팁을 사용하여 300마이크로리터의 기저 멤브레인 매트릭스에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 24웰 플레이트의 각 웰에 있는 300마이크로리터의 세포를 섭씨 37도와 5% CO2에서 30분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 각 웰에 1ml의 완전한 RPMI 배지를 추가하고 2일마다 배지를 교체하여 3D 배양물을 다시 7일 동안 인큐베이터에 반환합니다. 5일째에는 10나노몰의 인크리스틴을 배양물에 첨가합니다. 일주일 배양 후 배지를 흡인하고 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 각 웰을 두 번 세척합니다.
그런 다음 EDTA가 포함된 얼음처럼 차가운 PBS 3ml를 각 웰에 추가하고 200마이크로리터 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어 젤을 분리합니다. 접시를 얼음 위에서 30분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 세포 현탁액을 개별 멸균 15ml 튜브로 옮겨 얼음 위에서 30분 더 부드럽게 흔듭니다.
균질한 세포 현탁액의 출현을 확인합니다. 그런 다음 세포를 스핀다운한 다음 PBS 세척을 수행하고 FBS를 사용하여 펠릿을 새 PBS에 재현탁합니다. 마지막으로, 방금 설명한 대로 적절한 항체와 생존도 염료로 세포를 라벨링하고 그림에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 유세포 분석으로 RL 및 HL60 분화된 세포를 분석합니다.
유세포 분석으로 분리된 세포 집단의 모든 이벤트를 분석하면 이 분리 방법이 1차 백혈병 세포 집단을 발현하는 매우 순수한 단일 피크 CD19를 생성한다는 것을 보여줍니다. 그리고 90% 이상의 순수 호중구 집단이 백혈구 공통 항원 CD45와 성숙한 호중구에 의해 발현되는 CD15 및 CD16 항원에 대해 양성입니다. 호중구 공동 배양에서 원발성 백혈병 세포에 대한 보행은 호중구가 일차 백혈병 세포만 배양한 경우보다 훨씬 더 많은 수의 생존 가능한 원발성 백혈병세포로 티로신 억제제 이브루티닙에 대한 세포 생존에 보호 효과를 발휘한다는 것을 보여줍니다.
분화된 HL60 세포는 호중구보다 3D 배양에서 더 안정적입니다. 과립구 발달 유도 후, 이 세포는 미분화 HL60 세포보다 작으며 더 높은 수준의 CD11B 및 CD38을 발현합니다. 분화된 HL60 세포는 또한 다엽 핵을 나타냅니다.
이 세포는 단독으로 배양된 빈크로스틴 처리 림프종 세포에 비해 빈크로스틴 처리 후 3개의 D co 배양에서 생존 가능한 RL 세포의 수가 현저히 높아 RL 세포에 대한 보호 효과를 나타냅니다. 일단 숙달되면 밀도 구배 원심분리 방법을 90분 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이러한 기술은 암 생물학 분야의 연구자들이 전임상 모델 및 환자 샘플에서 종양 악성 종양에 대한 다양한 백혈구의 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 단핵세포와 호중구를 빠르고 안정적으로 분리하는 방법, 항암제에 대한 종양세포 반응 매개에 대한 호중구의 영향을 분석, 3D co 배양을 설정하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.
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이 기사는 밀도 구배 분리를 사용하여 인간 혈액에서 호중구를 분리하고, 호중구 경로를 따라 HL60 세포를 분화시키는 방법을 설명합니다. 이 연구는 림프종 세포의 항 림프종 제제에 대한 민감성에서 호중구의 역할을 조사하는 것을 목적으로 합니다.
Understanding neutrophil-mediated modulation of lymphoma cell sensitivity to therapeutic agents addresses a critical gap in tumor microenvironment research. This method enables rapid isolation of functional neutrophils from patient samples, supporting mechanistic de-risking in immuno-oncology target validation. The approach provides predictive confidence for evaluating how innate immune cells influence therapeutic response in preclinical models.
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by enabling immune-contextualized drug sensitivity testing.