인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

이 소형화된 글리칸 어레이의 전반적인 목표는 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌의 특이성과 결합력(avidity)을 분석하는 것입니다. 이 분석법은 인플루엔자 A 바이러스의 수용체 결합 및 결합력에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 글리칸 어레이 및 플레이트 기반 분석법으로는 보통 달성하기 어려운 특이성과 상대적 결합력을 단일 분석 내에서 동시에 확인할 수 있다는 점입니다.

이 프로토콜은 글라이칸 샘플의 준비부터 시작합니다. 글라이칸을 위한 기본 용액은 스톡 프린팅 버퍼이며, 제조 시 pH 8.5가 되도록 천천히 적정하고 계면활성제를 첨가해야 합니다. 준비된 프린팅 버퍼를 사용하여 PAA-접합 글라이칸을 100 µg/mL로 희석하십시오.

그 다음, 일가 글리칸을 프린팅 완충액에서 100 µM로 희석합니다. 마지막으로, 아민 기능화 염료의 작동 스톡을 1 µM로 제조합니다. 이제 각 글리칸 샘플 10 µL를 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 분주합니다.

이는 5개의 슬라이드를 프린팅하기에 충분한 용량의 용액입니다. 또한, 10 µL의 염료 마커를 프린팅 플레이트의 한 웰에 옮기십시오. 레이아웃에 따라 어레이어 핀과 프린팅 헤드의 위치를 먼저 잡고 어레이 프린팅을 준비하십시오.

이 경우, 하나의 핀으로 모든 샘플을 프린팅할 수 있습니다. 글리칸 어레이는 모든 면이 빈 공간으로 둘러싸인 6개 단위의 블록으로 프린팅됩니다. 슬라이드를 다룰 때는 장갑을 착용하십시오.

슬라이드를 포장지에서 꺼내고 초고순도 질소 가스를 사용하여 표면의 이물질을 불어내어 제거합니다. 그런 다음, 코팅된 면이 위로 오도록 슬라이드를 어레이어 스테이지 위에 배치합니다. 이어서 어레이어를 프로그래밍합니다.

이 경우, 소스 플레이트의 방문당 27개의 스팟을 프로그래밍하십시오. poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드의 비어레이 영역에 배치된 3개의 프리 스팟(pre spot)은 핀 끝의 과잉 액체를 제거하는 데 사용됩니다. 핀 방문당 나머지 24개의 스팟은 4개의 반복 어레이에 6개의 스팟을 배치하는 데 사용됩니다.

자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공되어 있습니다. 이제 멀티웰 플레이트를 프린터에 로드하고 어레이 프린팅을 시작하십시오. 프린팅하는 동안 습도가 55에서 65% 사이로 유지되는지 확인하십시오. poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드의 프리 스팟(pre spot) 외관에 주의를 기울이십시오.

프린팅 후, 각 슬라이드를 육안으로 검사하십시오. 테플론 경계 내의 스폿이 정확하게 정렬되었는지 확인하는 것이 매우 중요하며, 스폿팅된 피처의 수가 정확한지 확인하십시오. 도트의 부착을 균질하게 만들기 위해, 프린팅 직후 슬라이드의 프린팅된 면이 위로 향하게 하여 100% 습도 챔버에 넣으십시오.

젖은 종이 타월을 사용하여 용기와 임시 랙의 안쪽을 덮습니다. 챔버를 플라스틱으로 감싸 수분을 가둡니다. 30분 후, 슬라이드를 꺼냅니다.

그 다음, 용제 내성 마커로 슬라이드에 번호를 매기고 데시케이터에 넣어 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날, 강하게 교반하여 신선한 블로킹 버퍼 스톡을 준비하십시오. 농축 수산화나트륨을 사용하여 pH를 9.2로 조정하십시오.

그런 다음, 슬라이드를 버퍼에서 1시간 동안 배양합니다. 블로킹 성분을 제거하기 위해 슬라이드를 2차 증류수로 헹굽니다. 이어서 슬라이드를 유리 염색 홀더로 옮기고, 홀더를 스윙 플레이트 홀더에 장착하여 10 G에서 5분 동안 회전시켜 슬라이드를 건조합니다.

건조 후, 필요한 경우 슬라이드를 밀봉된 플라스틱 백에 넣어 -20 °C에서 보관하십시오. 준비 단계로, 이전과 동일하게 습윤 챔버를 다시 만듭니다. 고정된 글리칸을 검출하기 위해, 프로빙 버퍼로 SNA 및 ECA 비오틴화 렉틴을 10 µg/mL 농도로 준비하고, 각 희석액에 2 µg/mL의 streptavidin 555를 첨가하십시오.

헤마글루티닌으로 염색하려면, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 4:2:1 몰비로 블로킹 버퍼 내의 사전 복합체 항체 20 µg/mL 용액을 만듭니다. 준비된 용액 20 µL를 384-웰 플레이트의 웰에 옮깁니다. 다음으로, 렉틴과 헤마글루티닌을 해당 버퍼에서 1:1로 연속 희석합니다.

각 웰에 샘플 10 µL와 버퍼 10 µL를 채워 8단계 희석액을 만듭니다. 그다음, 플레이트를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 이제 각 희석액 8 µL를 프린트된 슬라이드의 48개 마이크로웰 중 하나에 추가합니다.

그런 다음, 준비된 슬라이드를 가습 챔버에서 90분 동안 배양합니다. 90분이 지나면 슬라이드의 가장자리를 잡은 상태로 세척합니다. PBS-T에 4회 담근 후, PBS에 4회 담그고, 마지막으로 탈이온수에 4회 담급니다. 이제 이전과 동일하게 슬라이드를 회전 건조합니다.

원심 건조 후 즉시 슬라이드를 스캔하십시오. 슬라이드를 스캐너에 올바른 방향으로 주의 깊게 장착해야 합니다. 5 mW의 낮은 레이저 출력으로 슬라이드를 반복적으로 스캔하며, 게인을 25%에서 75%까지 점진적으로 높이십시오. 스캔 설정을 최적화하는 동안 반복적인 스캔으로 인해 형광 물질이 퇴색될 수 있음을 유의하십시오.

관련 소프트웨어를 사용하여 저장된 이미지에서 결합 신호를 분석합니다. 스포팅 패턴이 포함된 어레이 리스트를 불러올 수 있습니다. 이를 스캔 이미지 위에 겹쳐서 그리드 마커의 위치를 파악하는 데 활용하십시오.

그다음, 소프트웨어를 사용하여 스팟 강도를 분석하고 결과를 탭으로 구분된 텍스트 파일로 저장하여 스프레드시트나 다른 통계 패키지로 내보냅니다. 배경값을 뺀 평균 신호 강도를 계산하여 데이터를 분석합니다. 각 샘플에 대해 6개의 반복 스팟 중 가장 높은 신호와 가장 낮은 신호를 제외한 4개 스팟의 평균값을 구합니다.

그 다음, 8가지 단백질 농도에 따른 평균 신호 값에서 배경값을 뺀 값으로 선 그래프를 작성합니다. 비선형 회귀 분석을 통해 결과 선을 부드럽게 보정합니다. PAA 어레이는 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌의 수용체 결합 특이성을 평가하는 데 사용되었습니다.

어레이에는 동일한 마이크로웰 내에 비시알릴화 대조군이 포함되었습니다. 프린팅된 화합물에 대해 알려진 특이성을 가진 식물 렉틴을 양성 대조군으로 사용하였습니다. ECA 렉틴은 N-아세틸글루코사민에 베타 1-4 결합된 말단 갈락토스에 결합하였으며, 말단 갈락토스가 시알산으로 캡핑된 경우에는 동일한 화합물에 결합하지 않았습니다.

α 2-6 결합 시알산을 테스트하기 위해 SNA 렉틴을 사용하였습니다. 예상대로 SNA는 α 2-6 결합 시알산에만 결합하였으나, PAA 결합 dye lacNAc 반복 구조와 비 PAA 결합 dye lacNAc 반복 구조에 대한 친화력에서 뚜렷한 차이를 보였습니다. 다음으로, α 2-3 결합 시알산만을 인식하는 Vietnam/1203/04 바이러스 유래 H5 헤마글루티닌을 테스트하였습니다.

H5 헤마글루티닌의 결합 프로파일은 PAA 결합 구조에 대해 더 높은 친화력을 보이며 예상된 특이성을 나타냈습니다. 마지막으로, 인간 계절성 H1N1 균주 유래 H1 헤마글루티닌을 테스트하였습니다. 예상대로, 이 헤마글루티닌은 alpha 2-6 결합 시알산 함유 구조에만 결합하였습니다.

이 기술을 숙달하면 단일 분석 내에서 인플루엔자 바이러스의 결합 특이성과 상대적 결합력을 밝혀낼 수 있습니다. 이 기술은 인플루엔자 결합 분석의 효율성을 크게 향상시킬 뿐만 아니라 귀중한 생물학적 제제의 소모를 줄여줄 것입니다.