Name: 인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 인플루엔자 A 바이러스 Hemagglutinin의 수용체 결합력과 특이도를 평가하는 소형화 글리칸 마이크로어레이 분석법을. 이 기법은 단일 실험에서 특이도와 상대 결합력을 동시에 측정하여 백신 개발 연구의 효율성을 높입니다.

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이 작품은 스크립스 마이크로 어레이 핵심 시설 및 질병 통제 예방 센터 (JCP)로부터 계약에 의해 부분적으로 지원되었다. RPdV는 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)에서 루비콘과 VENI 부여받는 것입니다. NIGMS 부여 GM62116 (JCP)에 의해 투자 컨소시엄은 기능 글리코 믹스에 대한 (http://www.functionalglycomics.org/) 본 연구에 사용 된 여러 글리 칸을 제공했다. 이는 스크립스 연구소에서 발행 29,113입니다.

주 : 달리 지시되지 않는 한 모든 단계가 실온에서 수행된다. 1. 배열 건설 <ol><li> 글리 칸 준비 및 플레이트 설치 <ol><li> 인쇄 버퍼의 재고를 준비합니다. 우선 인산 나트륨을 150 mM의 스톡 용액을 500 mL로 만든다. 또한, 인산이 수소 나트륨 용액을 150 mM의 스톡 용액을 50 mL로 만든다. 플라스크에서, pH가 8.5에 도달 할 때까지 서서히 용액으로 염기성 인산 나트륨 용액을 적정 교반 막대 및 pH 미터를 사용하여 자기. 0.005 %의 트윈 20을 추가합니다. </li><li> 글리 칸 샘플을 준비합니다. PAA에게 복합 글리 칸, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) 및 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (그림 1A 희석 )) 100 ㎍로 희석되어야한다 / step1.1.1. 가의 글리 칸에서 버퍼를 인쇄에서 ml의diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - 단계 1.1.1에서 인쇄 버퍼 100μM에 (CH 2) 3 NH 2)). 마지막으로, 그리드 마커 / 방문 등으로 사용, 아민 기능화 염료를 준비합니다. 염료 마커 명소 1 μM에 인쇄됩니다. 참고 : Atto488-NHS 염료는 우리의 인쇄에 사용됩니다. 그러나, 상기 슬라이드 스캐너에 의해 판독 가능한 임의의 아민 - 작용 염료는이 목적에 적합하다. </li><li> 전사 인쇄에 사용되는 로봇 384- 웰 마이크로 타이 터 플레이트의 각 당쇄 시료 10 μL. 밀폐 된 튜브에서 -20 ° C에서 인쇄 완충 용액에 보관하지 않는 글리 칸. Tansfer 판면에​​ 염료 마커의 10 μL. </li></ol></li><li> 인쇄 참고 : 모든 인트ps의 관심은 만지거나 장갑 수행해야합니다 슬라이드를 이동하는 것이다. <ol><li> 레이아웃의 올바른 구성에 따라 프린트 헤드에 Arrayer에 핀을 배치합니다. 이 레이아웃의 모든 샘플과 배열을 인쇄 한 핀을 사용합니다. 동일한 샘플의 관광 명소가 서로 옆에 정확히 인쇄되지되도록, 각 측면에 하나의 기능을 건너 뛰는 (기능은 특정 화합물의 단일 지점으로 정의된다), 여섯 블록에 글리 칸을 인쇄합니다. 주 : 최종 사용자가 설정을 결정해야한다. </li><li> 가방, 오픈 상자에서 슬라이드를 제거하고 각 슬라이드에 초 고순도 질소 가스를 불어 그 표면에있을 수있는 먼지 입자 또는 플라스틱의 작은 조각을 제거합니다. Arrayer에 무대 위로 슬라이드 원하는 번호, 코팅면을 놓습니다. </li><li> 프로그램은 Arrayer에이 인쇄 핀의 선단에 과잉의 액체를 제거하고, 폴리 -L- 라이신 코팅 된 슬라이드 상에 &quot;프리 반점&quot;3을 사용하여 소스 플레이트 구경 당 27 점의 파라미터를 사용하여 <ol><li> MPU (메인 전원 장치) 및 기후 제어 장치의 전원을 켭니다. 컴퓨터에서 열려 기와 분석 소프트웨어. </li><li> 인쇄를 선택 레이아웃입니다. 1 싱글 핀 - 옵션 → 핀 도구 배열 1 × 1 인쇄 도구를 인쇄에 사용되는 선택합니다. 대상 탭 → 도구 배열 정의 → 인쇄 패턴을 선택하고 (지점 - 대 - 지점 거리), 행과 샘플을 수용 할 수있는 열 수를 인쇄 할 피치를 추가하고이 배열 8에 대한 샘플의 인쇄 패턴 ( × 8 인쇄 패턴은 7 총 샘플 340 μm의 피치)에 사용된다. </li><li> 대상 → 슬라이드 레이아웃을 선택하고 48 웰 (4 × 12) 슬라이드 템플릿에 각 복제 배열의 인쇄 할 수 있도록 블록에 블록 거리를 프로그램. 소스를 선택하고 (6 샘플 우물과 1 염료 마커 잘 수용하기 위해 사용되는이 인쇄 7 소스 픽업 용) (1 핀을 사용하는 경우 각 샘플에 대해 1) 소스 픽업의 수를 추가 할 수 있습니다. 참고 : GREEN을 설정해야 소스 대화가 수 있음을 보여소스 방문 인쇄 패턴으로 인쇄 할 수있는 샘플은 일치한다. </li><li> 대상 → 어댑터 플레이트를 선택하고 레이아웃을 밀어 슬라이드 수를 조정 (5 슬라이드 1 미리 안보 슬라이드이 인쇄를 위해 한 번에 인쇄됩니다). </li><li> 사전 스포팅 슬라이드 (BLUE)와 &quot;진짜&quot;슬라이드의 위치에주의를 기울이고, 트레이를 활성화하고 트레이에 슬라이드의 수를 추가 할 수 T1 버튼을 클릭하여 트레이를 놓습니다. </li><li> 진공을 차단하고 진공을 활성화하기 위해 OK를 클릭하여 남아있는 모든 진공 포트에 일반 유리 슬라이드를 놓습니다. 모든 슬라이드가 위치에 고정되어 있는지 확인하고 홈 위치로 트레이를 반환 확인을 클릭합니다. </li><li> 판 홀더에 인쇄판을로드하고 랙이 자리에 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다. GO를 클릭하고 인쇄 과정을 진행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 어레이 당 6 점의 복제의 나머지 24 점 (4 배열 / 소스 방문)을 인쇄합니다. </li><li> 384 웰 플레이트를로드프린터로 인쇄를 시작합니다. (55)와 65 % 사이에 인쇄 전반에 걸쳐, 인쇄하는 동안, 상대 습도를 유지한다. 프린터는 5 슬라이드를 인쇄 한 후 정지합니다. 주 :이 분석에서 마이크로 어레이는 특정 8 × 8의 패턴으로 인쇄되지만, 다른 마이크로 어레이 인쇄 로봇이 원하는 배치를 달성하기 위해 장치 특정 프로그래밍을 필요로한다. 그것은 자신의 기기의 사양 주어진 최적 패턴을 결정하기 위해 최종 사용자에게 달려있다. </li></ol></li><li> 가습 / 움직이지 참고 : 슬라이드 인쇄가 완료되면, 그들은 임시 고정 단계라고도 가습을받을. 후 인쇄를 가습하는 재 습윤 반점을하고 완전한 차단을 보장함으로써 샘플 첨부 파일을 균일화하는 데 도움이됩니다. <ol><li> 바로 30 분 동안 인쇄 한 후 100 %의 습도 챔버에 슬라이드를 넣는다. 슬라이드를 큰 유리 접시의 바닥에 평평 매우 젖은 종이 타월을 배치 배치하여 챔버를 구축일부 이러한 테스트 튜브 랙, 인쇄면을 위로 같은 랙의 종류 및 수분의 함정에 플라스틱 포장으로 밀봉합니다. </li><li> 번호는 탈수 상자에 알코올 / 용제에 강한 마킹 펜 저장소와 슬라이드. 밤새 건조하는. </li></ol></li><li> 번호, 차단 및 저장 <ol><li> 50 mM의 붕산 버퍼의 50 mM 에탄올 아민 - 블로킹 버퍼를 준비합니다. 첫째, 자기 교반 막대를 함유하는 플라스크에 50 mM의 최종 농도로 DDH 2 O에 붕산을 녹인다. 모든 고체가 용해 될 때까지 교반 접시에 적극적으로 솔루션을 저어. 지속적으로 교반하면서, 목적하는 50 mM의 농도에 도달하는 16.54 M 스톡 용액으로부터 에탄올 적당량을 추가한다. 9.2의 최종 pH를 조정 진한 수산화 나트륨을 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 블로킹 완충액에 인쇄 된 슬라이드를 담근다. </li><li> 1 시간 이후, 블로킹 완충액 중 과량의 흔적을 제거하기 DDH 2 O에 슬라이드를 헹군다.적절한 폐기 용기에 버퍼를 차단 폐기 할 것. </li><li> 유리 염색 홀더에 슬라이드를 전송하고 건조 스핀. 5 분 동안 10 XG의 속도로 요동 판 홀더를 구비 한 원심 분리기에 배치하여 드라이 어레이. </li><li> 슬라이드가 건조되면, 그들은 즉시 배양하거나 저장할 수 있습니다. 보관 조건은 밀봉 된 비닐 봉지에 -20 ° C이다. </li></ol></li></ol> 2. 분석 글리 칸 결합 단백질 <ol><li> 배열이 맞는 하이브리드 될 수있는 가습 실을 준비합니다. 간단한 챔버는 적신 종이 타월 및 슬라이드 휴식 할 때 랙과 바닥에 적층 파이렉스 접시로 구성되어 있습니다. </li><li> 바이오틴 렉틴을 사용하여 SNA (삼부 카 파괴 해의 응집소) 및 버퍼를 프로빙 10 μg의 스트렙 타비 딘 - 555 염료 / ㎖ + 2 μg의 / ㎖에서 ECA (하는 Erythrina cristagalli 응집소), (PBS + 0.01 % 트윈 20). HA (이 예에서는 A / 베트남 / 1203년부터 1204년까지 H5N1과 A / KY가 / 07 H1N1), 사용앞서 설명한 바와 같이 34 μg의 20의 출발 농도는 ㎖, 미리 복합화 /. 마우스-α-연쇄상 구균 : 간단하게하는 HA 할 버퍼를 차단에서 염소-α-마우스 Alexa647 혼합물 (PBS + 3 % BSA + 0.01 % 트윈 20), 4시 : 2 : 1 몰비. 주 : 배열 렉틴과 프로브되어 글리 칸이 고정 및 검출 (그림 1B)되어 있는지 확인합니다. </li><li> 384 웰 플레이트에 20 μL의 당쇄 결합 단백질 항체 혼합 용액을 옮기고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 버퍼의 10 μL로 샘플의 10 μl를 혼합하여, 자신의 적절한 버퍼, 8 배에, 1 : 직렬 렉틴과 HA 샘플 1을 희석. </li><li> 피펫 8 마이크로 웰 표면에 시료 μL, 90 분간 가습 밀봉 (100 % RH) 실에서 배양한다. </li><li> 탈 H 2 O의 가장자리를 잡고 PBS의 혼합물 0.05 % 트윈 그들에게 네 번 찍기로 한 번에 슬라이드를 하나씩 씻어 PBS에서 다음 네 번, 그리고 마지막으로 네 번 사용블로킹 단계에 기재된 방법과 동일한 건조 프로토콜은 10 x g에서 5 분 동안 원심 분리기에 배열 건조 스핀. </li></ol> 3. 스캔 및 데이터 분석 주 : 글리 칸 마이크로 어레이는 마이크로 어레이 스캐너 제조업체에 따라 다른 설정으로 스캔 할 수 있습니다. 레이저 출력 해상도를 변화시킴으로써, 장비가 그 동적 범위 (도 1C) 내의 가능한 많은 신호에 의한 이미지를 생성 할 수있다. <ol><li> 형광 슬라이드 스캐너를 사용하여 즉시 당쇄 결합 단백질과 배양 한 후 배열을 검사합니다. 슬라이드가 제대로 스캔 기기에 삽입되어 있는지 확인하기 위해주의하십시오. <ol><li> 열기 검색 소프트웨어. 프로그램을 열려면 시작을 클릭합니다. 스캐너 탐색 패널 메뉴에서 [스캐너 → 연결 또는 녹색 버튼 : 스캐너에 연결합니다. </li><li> 스캐너의 열기 오토로더 문입니다. 특정 순서로 자동 로더의 슬롯에 슬라이드를 놓습니다. 닫기 자동 로더 문입니다. CL자동으로 도구 탐색 패널에서 ICK &quot;읽기 로더는&quot;스캐너에서 슬라이드를 감지합니다. </li><li> 설정 스캔 매개 변수 : 실험 (예를 들어 635 레이저 파워 높은 검출 이득 50 %)에 적합한 스캐너 → 검색 매개 변수를 설정합니다. 스캔 슬라이드 : 스캐너 → 스캔. 스캔 이미지와 이름 개별 검사를 저장할 폴더를 생성하여 경로를 선택합니다. 실제 검색이 사전 작업을 수행합니다. 각 개별 슬라이드에 대해 반복합니다. 스캔을 시작하려면 확인을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드를 악기를 설정하고 스캔하는 스캐너 소프트웨어를 사용합니다. 설정 스캐너 반복적 25 %, 50 % 및 75 %의 게인 설정을 증가 낮은 레이저 파워 (5 MW)로 스캔한다. 참고 : 설정을 테스트하고 최적화 있지만, 각 검색이 가능 photobleaching에에 의한 염료의 형광 출력을 낮출 수 염두에 두어야 할 수 있습니다. <ol><li> 오픈 데이터 수집 및 MAPIX 소프트웨어와 같은 분석 소프트웨어. 프로그램을 열려면 시작을 클릭합니다. 오픈 스캔 이미지 : 오픈 메신저 → 파일나이. 열기 GAL 파일 : → 오픈 그리드를 분석하고 적절한 GAL 파일을 선택합니다. </li><li> 블록 모드를 입력 : 이미지 → 블록 모드를 그리드를 이동합니다. 슬라이드에 적절한 위치에 그리드를 설정하는 그리드 마커를 사용합니다. 인쇄 된 배열에 맞게 필요에 따라 개별 블록을 조정합니다. </li><li> 스팟 모드를 입력 : 이미지를 스팟 모드 → 위치 및 블록 내 각 지점의 크기를 조정합니다. 일단 모든 블록과 장소를 조정하고 장소에서 측정 신호 강도에 의해 → 광도 계산을 분석합니다. 출력 파일을 저장합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드 스캔을 완료 한 후, 이미지 (- G 그림 1D)를 설치 이미지 처리 프로그램으로 신호를 결합에 대해 분석한다. 이미지 분석을 위해, 스캔 된 TIFF 이미지를 통해 GAL (배열 목록) 파일을로드합니다. 참고 : GAL 파일이 자리 레이아웃 패턴과 각 지점 위치의 신원 모두 포함되어 있습니다. 배열에 대한 GAL 파일 이러다 있습니다상기 샘플의 정체성과 384 잘 소스 판에서의 위치를​​ 포함하는 탭으로 구분 된 텍스트 파일을 사용하여 프린터 소프트웨어 어갈. </li><li> 제대로 GAL 그리드를 배치 할 마이크로 어레이에 인쇄 된 격자 마커 / 방문 등을 사용합니다. 개별 반점이 개별적으로 이동 될 필요가있다, 그러나 잘 인쇄 어레이는 일반적으로 그리드 내의 블록을 용이하게 배치 할 수있게된다. 그리드 배치에 따라, 소프트웨어에 의해 스폿 강도를 수집하고 탭으로 구분 된 텍스트 파일 (.txt)로 저장. <ol><li> 스프레드 시트 프로그램을 이용하여, 스캐너의 출력 파일을 연다. 폴더 위치에서 해당 매크로 파일을 엽니 다. 보기 → 매크로 → RunMacro을 클릭합니다. 참고 : 미리 작성된 원시 출력 데이터를 복사 불필요한 행과 열을 제거, 샘플로 데이터를 정렬, 평균, 평균 신호 마이너스 배경 값을 계산하고 각각에 대한 그래프를 포함하는 스프레드 시트 워크 시트에 결과 값을 플롯합니다 여섯 SAMP의레 배열에서 테스트. </li></ol></li></ol>

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IAV 수용체 특이성을 평가하는 것은 조류 바이러스의 대유행 가능성을 분석하는 중요한 단계이다. 바이러스에 의해 시알 산 인식은 같은 셀에 결합 및 해제로 여러 생물학적 성질에 연결되어 있습니다. 조류 바이러스가 결합 α2-6 달성하고 종 장벽이 대유행 대비를 가능하게 교차하는 지식은 아미노산 돌연변이가 필요합니다. 여러 분석은 수용체 특이성을 결정하기 위해 사용된다; 그러나, 모든 반대로 만 측정 결합력이 아닌 특이 포함한 결점들을 갖는다. 여기에서 우리는 더 복잡한 글리 칸의 PAA 연결된 단말기 조각을 사용하여 널리 사용 및 인정 ELISA를 기반​​으로 새로운 소형 도구를 설명합니다. 4 잘 정의 된 렉틴, 공장의 2 인플루엔자의 2 바이러스 원점을 사용하여, 우리는 우리가 특이 상대 결합력을 유지하는 것으로 나타났다. 우리는 화학 biolog의 감소량을 계산하면글리 칸 어레이 칩 상에 ELISA를 소...

야생 물새 IAV위한 자연 저장고 있지만 IAV 가금류 인간을 포함한 포유 동물에 종 장벽을 통과 할 수있다. 인간 바이러스 α2-6 결합 시알 산 (사람 형 수용체)에 결합하는 반면 조류 IAVs은 α2-3 결합 시알 산 (조류 형 수용체)를 인식한다. 효율적으로 복제 및 조류 IAV 인간 형 수용체 1에 결합 할 필요가 인간 사이에 전송 할 수 있습니다. IAVs는 자신의 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 아제 (NA) 엔벨로프 당 단백질의 항원 성을 특징 혈청에 따라 구분된다. NA는 바이러스 라이프 사이클 및 절단 시알 산 (2)의 타단 수용체 - 파괴 효소 인 반면, HA는, 시알 산에 결합한다. H1N1, H2N2 및 H3N2을 포함한 모든 인간 감염 바이러스는 조류 기원 3 있습니다. 인간의 크로스 오버에 여러 조류 수십 년의 마지막 두 이상 H5N1, H7N7 및 H7N9으로 발생되는 가장 잘 알려진; 하우버전이 다른 아형보다 산발적으로 인간을 감염 한 (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. 다행스럽게도, 이러한 바이러스 중 어느 것도 완전한 인간 형 α2-6 결합 시알 산 수용체 5-8에 적응할 수 없었을 것 같다. 조류 또는 기타 동물 매개 바이러스의 적응은 인간의 건강에 치명적인 영향을 미칠 수있는 인간의 호스트에 복제 및 전송을 수용합니다. 따라서,이 바이러스는 새로운 인플루엔자 바이러스의 전세계 감시 도움이 될 것입니다 인간 형 수용체에 결합하는 발전 방법에 대한 사전 지식. 수용체 환경 설정의 결정은 처음으로 서로 다른 종의 적혈구를 사용하여 밝혀와 독감 연구자 9-12 중 선호 분석 유지했다. 조류 바이러스가 α2-3 시알 산 및 시알 산을 연결 α2-6 인간의 바이러스를 인식 데모는 원래 효소 리​​를 각각 포함하도록 설계 적혈구의 혈구 응집을 사용하여 분석에 근거했다13, 14을 nkages. 판독은 혈구 응집, 바이러스 학자 표준 분석되지만, 기본 글리 칸 구조는 단지 단말기 결합을 정의하지 않는다. 또한, 셀을 재 sialylate하는 데 사용 sialyltransferases의 제한된 유용성이 15-18 분석법의 사용을 제한하고있다. 이어서, 수용체 - 결합 선호도를 결정하는 다른 방법이 플레이트 - 기반 분석법 (19, 20)의 폴리 아크릴 아미드 (PAA) 또는 폴리 글루탐산 (PGA) 구조로 연결된 시알 릴화 된 글리 칸 구조를 사용하여 도입되었다. 여러 변형은, 견고하고 신뢰할 민감 형 ELISA 분석 결과 21-23, 각각의 마이크로 타이 터 플레이트로 글리 칸 또는 바이러스를 도포 가능하다. 대안 적으로, 비오틴 연결 글리 칸은 PAA / PGA를 대체하고 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 플레이트 2,24에 접합 될 수있다. 일부 특정 혈청이 요구 될 수 있지만, ELISA를가 PAA에 연결 표준 및 여러 글리 칸 쉽게되어 있습니다 commerciallY와 비 시판 (기능 글리코 믹스를위한 컨소시엄 (http://www.functionalglycomics.org)). 글리 칸 마이크로 어레이 기술은 여러 다른 글리 칸이 발견 될 때, 수용체 특이성을 결정하는 매우 중요한 도구로 등장, 서로 다른 구조의 다양한 결합하면 하나의 분석 25-29에서 평가 될 수있다. 이러한 구조 IAV의 결합은 IAV 우선적 30-33을 인식 글리 칸 구조의 더 나은 이해를 제공한다. 당쇄 마이크로 어레이는 결합 분석을 수행하기위한 샘플 량을 소량 만 필요로 스폿 (2 NL) 당 당쇄 분의 양을 사용한다. 그러나, 이러한 배열은 일반적으로 글리 칸 수용체의 특이성을 평가하는 데에만 사용됩니다. 여러 농도 범위에서 여러 바이러스 또는 헤 마글 루티 닌 단백질의 분석이 요구되기 때문에 슬라이드의 개수를 금지 할 수있다. 또한, 지금까지 상대적인 결합력 분석은 당쇄 AR을 이용하여 개발되지 않았다선 기술. 비교 당쇄 마이크로 어레이 기술 및 ELISA 기반 분석법에서 PAA 연결된 글리 칸의 감도에 의해 제공되는 낮은 샘플 조건을 결합하기 위해 유사하거나 더 나은 해상도 높은 처리량 분석을 허용하는 멀티 - 웰 당쇄 어레이를 개발하기 위해 노력 기존의 ELISA 기반 분석한다. 동시에, 우리는 소비 생물학적 및 기자 화학 물질의 양을 최소화하고 싶었다. 궁극적 인 결과는 구체적 IAV 특이성을 모니터링하기 위해 개발 된 소형 결합력 분석이고, 다른 글리 칸 결합 단백질을 평가하기 위해 동일하게 적용 가능하다. 테프론 마스크 48 마이크로 웰에 분리 된 유리 슬라이드를 사용하여, 글리 칸은 6 개 웰 당 6 회 반복에서 발견된다. 마이크로 어레이 플랫폼 수용체에서 동일한 경향 여러 장점 매크로 ELISA 포맷에서 본 바인딩 제공한다. 이러한 여러 행의 코팅에 비해 최소한의 샘플을 사용하여 (I)의 화합물을 6 회 반복 인쇄를 포함 I물론 당 100 μl를 사용하여 NA 판; (II) 여러 다른 화합물은 컨트롤을 포함하는 단일 아니라, 동시에 분석; (III) 배양 볼륨과의 대규모 감소; (IV), 형광 판독을 사용하여 더 큰 다이나믹 레인지. 하나의 슬라이드는 18 배, 96 웰 플레이트에 상응하는 것으로 계산 될 수있다. 다음 프로토콜, 제조 및 분석의 실험실 할 수와 함께 마이크로 어레이이 소형화 ELISA 형식을 제조 할 수 있어야한다 발견했다.

<table><tbody><tr><td>넥스테리온&reg; 슬라이드 H MPX-48&nbsp;</td><td>Schott</td><td>1091525</td><td>Microwell 슬라이드</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td>는 <td>단종</td>된 <td>컨포칼 마이크로어레이 스캐너</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL 스캐너/Mapix 소프트웨어</td><td>Innopsys-confocal</td><td></td> <td>마이크로어레이 스캐너</td></tr><tr><td>MicroGrid II&nbsp;</td><td>Digilab-microaray</td><td></td> <td>프린터</td></tr><tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&nbsp;</td><td>식물 렉틴</td></tr><tr><td>ECA</td><td>벡터 연구소</td><td>B-1145&nbsp;</td><td>식물 렉틴</td></tr><tr><td>항-연쇄상구균 항체</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&nbsp;</td><td>HA 바인딩을 위한 Anitbody</td></tr><tr><td>안티-마우스 Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody for HA 바인딩</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&nbsp;</td><td>세정제</td></tr><tr><td>di-basic 소듐 포스페이</td>트 <td>시그마</td><td>255793</td><td>인쇄 버퍼 구성</td></tr><tr><td>요소 모노-베이직 소듐 포스페이</td>트 <td>시그마</td><td>229903&nbsp;</td><td>인쇄 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>폴리-l-라이신 용액</td><td>Sigma</td><td>P8920&nbsp;</td><td>Pre-spotting Slide 구성 요소</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마</td><td>221465</td><td>사전 스포팅 슬라이드 구성 요소</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마</td><td>493546</td><td>사전 스포팅 슬라이드 구성 요소</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>코닝</td><td>46-013-CM</td><td>배양/세척 버퍼</td></tr><tr><td>SMP4B 핀</td><td>Telechem</td><td>SMP4B</td><td>인쇄 핀</td></tr><tr><td>압축 질소(5등급)</td><td>프렉스에어</td><td>UN1066</td><td>일반 먼지 제거/건조 도구</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>슬라이드 차단 시약</td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>슬라이드 차단 시약</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>Gridmarker on array</td></tr><tr><td>PAA-LNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>PA368</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>PAA-3SLNLN</td><td>컨소시엄 기능성 글리코믹스</td><td>PA362</td><td>점박이 글라이칸</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>컨소시엄 기능성 글리코믹스</td><td>PA343</td><td>점박이 글라이칸</td></tr><tr><td>LNLN</td><td>컨소시엄 기능성 글리코믹스</td><td>Te98</td><td>점박이 글라이칸</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>컨소시엄 기능성 글리코믹스</td><td>Te175</td><td></td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>컨소시엄 기능성 글리코믹스</td><td>Te176</td><td>점박이 글라이칸</td></tr><tr><td>384웰 마이크로타이터 플레이트</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>인쇄판</td></tr><tr><td>VWR 랩 마커</td><td>VWR</td><td>52877-150</td><td>슬라이드 번호 매기기</td></tr><tr><td>Wheaton 슬라이드 염색 접시</td><td>Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>차단 및 건조</td></tr></tbody></table>

인플루엔자 바이러스 hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

작용 성 수용체는 세포 내로 진입하는로서 인플루엔자 바이러스 (IAV) hemagglutinins는 세포 표면의 시알 산을 인식한다. 야생 물새는 IAV의 자연 저수지하지만, IAV는 가금류, 돼지, 말과 인간 종의 장벽을 통과 할 수 있습니다. 조류 바이러스가 사람 바이러스는 우선적 α2-6 결합 (인간 형 수용체)와 시알 산을 인식하는 반면 α2-3 결합 (조류 형 수용체)에 의해 끝에서 두 번째 갈락토스에 첨부 된 시알 산을 인식한다. 조류 바이러스가 인간 형 수용체에 적응하는 경우 모니터하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수있다. 합성 sialosides의 다양한 라이브러리와 글리 칸 마이크로 어레이는 점점 수용체 특이성을 평가하는 데 사용됩니다. 그러나,이 기술은 avidities 측정에 사용되지 않는다. 결합력의 측정은 통상적으로, 종래의 폴리 프로필렌 96 웰 플레이트에 흡착 글리 칸으로 희석 한 바이러스 헤 마글 루티 닌 또는 결합을 평가함으로써 달성된다. α이 분석에서, 글리 칸2-3 또는 α2-6 시알 산은 비오틴에 결합 스트렙 타비 딘 판에 흡착 또는 직접 플라스틱에 흡착 폴리 아크릴 아미드 (PAA)에 연결되어있다. 우리는 크게 직접 마이크로 웰 유리 슬라이드에 PAA 링크 sialosides과 비 PAA 연결된 대응을 인쇄하여이 분석을 소형화했다. 하나의 슬라이드에 48 배열이 셋업은, 6 글리 칸은이 비 시알 릴화 통제를 포함한 6 개의 글리 칸을 심문, 8 희석에 결합 단백질의 동시 분석 할 수 있습니다. 이는 기존의 플레이트 분석에서 18 배 96 웰 플레이트에 해당합니다. 글리 칸 배열 형식은 화합물 및 생물학적 제제의 소비를 감소함으로써 효율성을 크게 향상시킨다.

인쇄, 스캔 및 데이터 분석 적절한 인쇄를 보장하기 위해, 상기 슬라이드 각 어레이를 묘사 테플론 마스크 내에서 발견 된 격자의 정확한 정렬을하는 것이 중요하다. 인해 테프론 코팅의 성질, 인쇄 도중, 스폿은 MPX 슬라이드에 육안으로 볼 수 없다. 주의를 폴리 -L- 라이신 코팅 된 슬라이드에 프리 반점의 외관 후 지불된다. 직접 인쇄 후, 각 슬라이드 인해 그 자리에서 건조 버퍼의 염을 볼 수 있습니다 각각의 발견 화합물의 존재를 눈으로 확인해야합니다. 배열은 테프론 테두리와 발견 기능의 정확한 수 내 관광 명소의 올바른 정렬을 위해 검사된다. 슬라이드 사진 표백을 피하기 위해 높은 스캔 전원 이하의 반복 과정에서 스캔 HIG의 비교를 허용하고그녀...

인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

이 소형화된 글리칸 어레이의 전반적인 목표는 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌의 특이성과 결합력(avidity)을 분석하는 것입니다. 이 분석법은 인플루엔자 A 바이러스의 수용체 결합 및 결합력에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 글리칸 어레이 및 플레이트 기반 분석법으로는 보통 달성하기 어려운 특이성과 상대적 결합력을 단일 분석 내에서 동시에 확인할 수 있다는 점입니다.이 프로토콜은 글라이칸 샘플의 준비부터 시작합니다. 글라이칸을 위한 기본 용액은 스톡 프린팅 버퍼이며, 제조 시 pH 8.5가 되도록 천천히 적정하고 계면활성제를 첨가해야 합니다. 준비된 프린팅 버퍼를 사용하여 PAA-접합 글라이칸을 100 µg/mL로 희석하십시오.그 다음, 일가 글리칸을 프린팅 완충액에서 100 µM로 희석합니다. 마지막으로, 아민 기능화 염료의 작동 스톡을 1 µM로 제조합니다. 이제 각 글리칸 샘플 10 µL를 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 분주합니다.이는 5개의 슬라이드를 프린팅하기에 충분한 용량의 용액입니다. 또한, 10 µL의 염료 마커를 프린팅 플레이트의 한 웰에 옮기십시오. 레이아웃에 따라 어레이어 핀과 프린팅 헤드의 위치를 먼저 잡고 어레이 프린팅을 준비하십시오.이 경우, 하나의 핀으로 모든 샘플을 프린팅할 수 있습니다. 글리칸 어레이는 모든 면이 빈 공간으로 둘러싸인 6개 단위의 블록으로 프린팅됩니다. 슬라이드를 다룰 때는 장갑을 착용하십시오.슬라이드를 포장지에서 꺼내고 초고순도 질소 가스를 사용하여 표면의 이물질을 불어내어 제거합니다. 그런 다음, 코팅된 면이 위로 오도록 슬라이드를 어레이어 스테이지 위에 배치합니다. 이어서 어레이어를 프로그래밍합니다.이 경우, 소스 플레이트의 방문당 27개의 스팟을 프로그래밍하십시오. poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드의 비어레이 영역에 배치된 3개의 프리 스팟(pre spot)은 핀 끝의 과잉 액체를 제거하는 데 사용됩니다. 핀 방문당 나머지 24개의 스팟은 4개의 반복 어레이에 6개의 스팟을 배치하는 데 사용됩니다.자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공되어 있습니다. 이제 멀티웰 플레이트를 프린터에 로드하고 어레이 프린팅을 시작하십시오. 프린팅하는 동안 습도가 55에서 65% 사이로 유지되는지 확인하십시오. poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드의 프리 스팟(pre spot) 외관에 주의를 기울이십시오.프린팅 후, 각 슬라이드를 육안으로 검사하십시오. 테플론 경계 내의 스폿이 정확하게 정렬되었는지 확인하는 것이 매우 중요하며, 스폿팅된 피처의 수가 정확한지 확인하십시오. 도트의 부착을 균질하게 만들기 위해, 프린팅 직후 슬라이드의 프린팅된 면이 위로 향하게 하여 100% 습도 챔버에 넣으십시오.젖은 종이 타월을 사용하여 용기와 임시 랙의 안쪽을 덮습니다. 챔버를 플라스틱으로 감싸 수분을 가둡니다. 30분 후, 슬라이드를 꺼냅니다.그 다음, 용제 내성 마커로 슬라이드에 번호를 매기고 데시케이터에 넣어 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날, 강하게 교반하여 신선한 블로킹 버퍼 스톡을 준비하십시오. 농축 수산화나트륨을 사용하여 pH를 9.2로 조정하십시오.그런 다음, 슬라이드를 버퍼에서 1시간 동안 배양합니다. 블로킹 성분을 제거하기 위해 슬라이드를 2차 증류수로 헹굽니다. 이어서 슬라이드를 유리 염색 홀더로 옮기고, 홀더를 스윙 플레이트 홀더에 장착하여 10 G에서 5분 동안 회전시켜 슬라이드를 건조합니다.건조 후, 필요한 경우 슬라이드를 밀봉된 플라스틱 백에 넣어 -20 °C에서 보관하십시오. 준비 단계로, 이전과 동일하게 습윤 챔버를 다시 만듭니다. 고정된 글리칸을 검출하기 위해, 프로빙 버퍼로 SNA 및 ECA 비오틴화 렉틴을 10 µg/mL 농도로 준비하고, 각 희석액에 2 µg/mL의 streptavidin 555를 첨가하십시오.헤마글루티닌으로 염색하려면, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 4:2:1 몰비로 블로킹 버퍼 내의 사전 복합체 항체 20 µg/mL 용액을 만듭니다. 준비된 용액 20 µL를 384-웰 플레이트의 웰에 옮깁니다. 다음으로, 렉틴과 헤마글루티닌을 해당 버퍼에서 1:1로 연속 희석합니다.각 웰에 샘플 10 µL와 버퍼 10 µL를 채워 8단계 희석액을 만듭니다. 그다음, 플레이트를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 이제 각 희석액 8 µL를 프린트된 슬라이드의 48개 마이크로웰 중 하나에 추가합니다.그런 다음, 준비된 슬라이드를 가습 챔버에서 90분 동안 배양합니다. 90분이 지나면 슬라이드의 가장자리를 잡은 상태로 세척합니다. PBS-T에 4회 담근 후, PBS에 4회 담그고, 마지막으로 탈이온수에 4회 담급니다. 이제 이전과 동일하게 슬라이드를 회전 건조합니다.원심 건조 후 즉시 슬라이드를 스캔하십시오. 슬라이드를 스캐너에 올바른 방향으로 주의 깊게 장착해야 합니다. 5 mW의 낮은 레이저 출력으로 슬라이드를 반복적으로 스캔하며, 게인을 25%에서 75%까지 점진적으로 높이십시오. 스캔 설정을 최적화하는 동안 반복적인 스캔으로 인해 형광 물질이 퇴색될 수 있음을 유의하십시오.관련 소프트웨어를 사용하여 저장된 이미지에서 결합 신호를 분석합니다. 스포팅 패턴이 포함된 어레이 리스트를 불러올 수 있습니다. 이를 스캔 이미지 위에 겹쳐서 그리드 마커의 위치를 파악하는 데 활용하십시오.그다음, 소프트웨어를 사용하여 스팟 강도를 분석하고 결과를 탭으로 구분된 텍스트 파일로 저장하여 스프레드시트나 다른 통계 패키지로 내보냅니다. 배경값을 뺀 평균 신호 강도를 계산하여 데이터를 분석합니다. 각 샘플에 대해 6개의 반복 스팟 중 가장 높은 신호와 가장 낮은 신호를 제외한 4개 스팟의 평균값을 구합니다.그 다음, 8가지 단백질 농도에 따른 평균 신호 값에서 배경값을 뺀 값으로 선 그래프를 작성합니다. 비선형 회귀 분석을 통해 결과 선을 부드럽게 보정합니다. PAA 어레이는 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌의 수용체 결합 특이성을 평가하는 데 사용되었습니다.어레이에는 동일한 마이크로웰 내에 비시알릴화 대조군이 포함되었습니다. 프린팅된 화합물에 대해 알려진 특이성을 가진 식물 렉틴을 양성 대조군으로 사용하였습니다. ECA 렉틴은 N-아세틸글루코사민에 베타 1-4 결합된 말단 갈락토스에 결합하였으며, 말단 갈락토스가 시알산으로 캡핑된 경우에는 동일한 화합물에 결합하지 않았습니다.α 2-6 결합 시알산을 테스트하기 위해 SNA 렉틴을 사용하였습니다. 예상대로 SNA는 α 2-6 결합 시알산에만 결합하였으나, PAA 결합 dye lacNAc 반복 구조와 비 PAA 결합 dye lacNAc 반복 구조에 대한 친화력에서 뚜렷한 차이를 보였습니다. 다음으로, α 2-3 결합 시알산만을 인식하는 Vietnam/1203/04 바이러스 유래 H5 헤마글루티닌을 테스트하였습니다.H5 헤마글루티닌의 결합 프로파일은 PAA 결합 구조에 대해 더 높은 친화력을 보이며 예상된 특이성을 나타냈습니다. 마지막으로, 인간 계절성 H1N1 균주 유래 H1 헤마글루티닌을 테스트하였습니다. 예상대로, 이 헤마글루티닌은 alpha 2-6 결합 시알산 함유 구조에만 결합하였습니다.이 기술을 숙달하면 단일 분석 내에서 인플루엔자 바이러스의 결합 특이성과 상대적 결합력을 밝혀낼 수 있습니다. 이 기술은 인플루엔자 결합 분석의 효율성을 크게 향상시킬 뿐만 아니라 귀중한 생물학적 제제의 소모를 줄여줄 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

간단한 슬롯 얼룩 방법은 생물 정보학 분석을 통해 확인된 그들의 가장 보존 시퀀스를 대상으로 보편적인 항체를 사용하여 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 부량 위해 개발되었습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 모든 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 양적 결정에 유용한 대안을 제공할 수 있습니다.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 비디오에서는 인플루엔자 바이러스 균주의 항원 아형이 인쇄된 마이크로어레이 슬라이드를 사용하여 여러 인간 혈청 샘플에서 항체 동형을 검출하는 프로세스를 보여줍니다.

바이러스 항원에 대한 혈청 내 항체 동형을 검출하기 위한 바이러스 항원 마이크로어레이 분석

이 비디오는 특정 항원에 대한 혈청 항체를 검출하기 위한 혈응집 억제 분석을 보여줍니다. 테스트 웰에서의 적혈구 응집 억제 및 대조군 웰에서의 적혈구 응집의 확인은 뚜렷한 시각적 패턴을 통해 달성됩니다. 이 분석은 면역 반응, 백신 효과를 평가하고 바이러스학 및 면역학에서 바이러스 감염을 연구하는 데 중요한 역할을 합니다.

표적 항원에 대한 혈청 항체를 검출하기 위한 Hemagglutination Inhibition Assay

이 비디오는 인플루엔자 바이러스 A와 B를 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다. 이 분석은 인플루엔자 특이적 프라이머를 사용한 니킹 엔도뉴클레아제 증폭과 분자 비콘 프로브를 사용한 표적 검출을 사용합니다.

인플루엔자 A 및 B 바이러스를 정량화하기 위한 분자 기반 분석

이 동영상은 혈청 샘플에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하는 분석을 보여줍니다. NA에 대한 항체를 포함하는 혈청 샘플을 페투인(fetuin)으로 코팅된 마이크로웰 플레이트에 첨가합니다. 바이러스를 추가하면 항체가 바이러스 NA가 fetuin을 쪼개고 갈락토오스 부분을 노출시키는 것을 방지합니다. 그런 다음 과산화효소(peroxidase-conjugated lectin)가 첨가되어 노출된 갈락토스에 결합합니다. NA 억제 항체 역가는 비색 테스트를 사용하여 측정되며, 여기서 과산화효소 기질은 고정된 렉틴 접합 과산화효소에 의해 절단되어 색상을 생성합니다.

인플루엔자 뉴라미니다아제 억제 항체 역가를 측정하기 위한 분석

혈청에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하기 위한 효소 결합 렉틴 분석법(ELLA)을 설명합니다. 이 분석은 땅콩 응집소를 사용하여 NA가 fetuin으로 코팅된 96웰 플레이트에서 시알산을 제거할 때 접근할 수 있는 갈락토오스 잔류물을 정량화합니다.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

제시 프로토콜 인플루엔자 백신 받는 사람 혈 청 샘플에서 인플루엔자-특정 항 체 titers 척도를 hemagglutination 억제 시험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 첫 번째 분석 결과 hemagglutination에 의해 최적의 바이러스 성 항 원 농도를 결정합니다. 두 번째 분석 결과 hemagglutination 저해 하 여 인플루엔자-특정 항 체 titers 단정.

인플루엔자-특정 항 체 Titers 계량에 최적화 된 Hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과

항 체에 의해 그 대상 인플루엔자 바이러스 조류 Fc 중재 effector 기능 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 Fc 중재 면역 유도의 단일 클론 항 체 또는 polyclonal 세라 다른 바이러스 표면 glycoproteins를 대상으로 능력을 평가 하기 위해 적응 수 있습니다.

독감 조류 특정 항 체에 의해 유도 된 Fc 중재 Effector 기능을 평가 하는 방법

우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

배우세요 인플루엔자 A 바이러스 Hemagglutinin의 수용체 결합력과 특이도를 평가하는 소형화 글리칸 마이크로어레이 분석법을. 이 기법은 단일 실험에서 특이도와 상대 결합력을 동시에 측정하여 백신 개발 연구의 효율성을 높입니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

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