Name: 마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 배우세요 마우스 귀 피부 모낭에서 기계적 자극에 반응하는 감각 신경 말단의 전기생리학적 기록 방법을. 실시간 세포 영상과 전기생리학 기록을 결합하여 기계수용성 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 G.S.B. 및 R.W.B.에 대한 영국 의학 연구 위원회 프로젝트 보조금 G0601253에서 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

마우스 사후 조직 수확은 윤리적 인 방법을 승인 사용해야합니다. 영국에서는 자궁 경부 탈구는 성인 마우스 (영국 동물의 상장 일정 1 방법 (과학적 절차) 법, 1986 년 유럽 지침 63분의 2,010 / EU)에 대한 정부 승인 방법이다. 이 법안은 검토하고 다음 프로토콜에 사용 된 모든 절차를 승인 한 동물 복지와 윤리 심의위원회에 의해 애버딘 대학에서 로컬로 적용됩니다. 참고 :이 방법은 은행 등에보고 된 연구에 사용되었다 (7). 전기 생리학 1. 준비 귀 <ol><li> 박리 전에, 이러한 Liley의 (1956) 등의 표준 생리 식염수를 준비하고, 90 % O 2 / 5 % CO 2로 포화. 의 NaHCO3 (12)의 KCl (4), KH 2 PO 4 (1), 염화나트륨 (138.8)의 MgCl 2 (1), CaCl2를 (2) 포도당 : Liley의 식염수 (MM)이 구성되는(11). </li><li> 인도적 귀 근처의 두개골에 손상을주지 않고 성인 마우스를 안락사. 여기에서 우리는 C57 / Bl6J 및 MF1 마우스를 사용하지만 표준 실험실 마우스 변형을 사용할 수있다. 이상적으로는, 전기 기록 큰 쥐 라벨링 덜 안정로서 스티 릴 색소 표지와 결합 될 경우 &lt;25g있는 마우스를 사용하여 종종 제한 접하는 영역에서 발견된다. </li><li> 큰 가위 또는 뼈 가위로 머리를 제거합니다. </li><li> 스테레오 해부 현미경의 무대에서 (50cm 일반적으로 편리) 넓은 바닥 해부 접시에 가스실 Liley의에서 머리 지느러미 측면을 놓습니다. 정기적으로 (~ 10 분) 수문 또는 가스실 식염수 머리를 잠수함. </li><li> 조심스럽게 절개와 외부 청각 (外耳道) (EAM)의 연골을 노출, springbow 위 및 3 집게로 외부 귀 (귓바퀴)의베이스에 피부를 구분합니다. 그들은 F 등장으로 삼차의 가지 (하악 부문, MDV)과 큰 귀의 신경을 식별롬 연골베이스를 통해 하악 관절 및 프로젝트의 홈에서 두개골은 각각 오목 (전방)과 볼록 (후방) 귓바퀴 피부의 측면을 신경을 분포시키다합니다. </li><li> 두개골 근처 식별 곳 턱과 유양 돌기 프로세스 사이의 홈에있는 두 개의 신경 분기 종료합니다. 부드럽게 떨어져 두개골의 날개를 잡아 당겨 자신의 길이를 극대화하고 가능한 두개골에 가까운 신경을 잘라. </li><li> 분할 신경의 말초 그루터기 않도록주의를 복용하고 제거 귀 기지에서 조밀 한 털 가죽의 양을 최소화 springbow 가위로 머리에서 날개를 제거합니다. </li><li> 유연한 실리콘 고무 (PDMS) 가스실 Liley의 유체로 채워진; 라이닝 접시에 날개를 전송할 수 있습니다. 그 좁은 (전방 가장) 지점을 분할하여 EAM을 엽니 다. 신중하게 ~ 6-8 규칙적으로 이격 아주 좋은 (~ 0.2 mm 직경) 곤충 핀 가장자리에 날개, 전방 피부 (오목)에 PDMS에 이르기까지 측과 핀을 평평하게. </li><li> 렘완전히 날개의 후방 측면의 피부를 비켜 부분적으로 앞쪽에 피부가 그대로 남아 보장, # 3 포셉과 무딘 절개에 의한 날개 연골을 제거합니다. </li><li> 미세 곤충 핀의 포인트로 부드럽게 피부와 EAM의 연골 사이에 후방 등장 MDV의 가지 (보통 2) 확장, # 3 집게로 파악. 자신의 컷 끝이 아닌 신경 줄기 자신을 인접한 결합 조직을 찌르는, 최고의 가능한 곤충 핀에 PDMS 이러한 핀. </li><li> 조심스럽게 당겨 초과 또는 절단 손상을 방지, 주변 주변의 결합 조직의 대부분을 제거합니다. </li></ol> 2. 전기 생리 녹화 설정 <ol><li> 에 (기록 1-2 흡입 전극 근처의 귀 바닥에있는 청소 신경을 배치 (~ 귀 당 6-8) 가장자리 주위에 미세 곤충 핀 기록 챔버의 PDMS 늘어선베이스에 날개 피부를 고정 신경)과 구약을그녀 무관심 전극 (차동 증폭기 중립 신호를 제공하도록,도 7 참조). </li><li> 기록 전극 용 신중 개구 두 신경의 결합 두께에 대한 개구부의 내경과 일치하므로 가능한 한 가능한 한 큰 길이뿐만 잘 맞. </li><li> 실리콘 고무 튜브와 타 단부에 부착 된 2 mL의 주사기로부터 부드럽게 흡인 전극에 신경을 그린다. 신경이 똑바로하지 접히거나 두 배로 있는지 확인. </li><li> 단단히 신경 주위 개구부를 밀봉하는 마개를 형성하기 위해 결합 조직 또는 지방 조직을 그리 강한 흡입하여 높은 전기 저항 / 임피던스 착용감을 개발한다. </li><li> (이 모세관 작용에 의해 채워질 수 있습니다) 필요한 경우 흡입에 의해 식염수 다른 (무관심) 전극을 입력합니다. </li><li> 식염수와 신경 연락을 기록 전극의 내부 구멍에 동일한 기록 와이어 (실버 또는 백금)를 배치(녹음) 또는 전극의 축소, 화재 연마 엔드 (무관심). 각 전극은 두 개의 코어 차폐 케이블의 다른 코어에 개별적으로 납땜된다. 욕으로 욕조 (접지) 전극은 (Ag / AgCl을 펠렛)을 배치하고, 기록 전극에 연결된 두 심선의 화면에 접지. </li><li> 오실로스코프 화면에 차동 증폭기, 필터 (대역 통과 0.2-2 kHz에서) 볼의 개별 채널로 두 전극에서 전기적 활성도를 공급. 채널 A (기록)을 확인하고 채널 B는 (무관심) 전기 노이즈 수준은 비슷. 이 단계는 두 전극이 균형 전에 채널 A의 정상 자발적인 활동 전위를 볼 수 없을 수있다. </li><li> 기록 (채널 A) 또는 중립 (채널 B) 전극의 임피던스를 증가시켜 전극의 배경 잡음의 차이를 해소. 두 전극에 더 유륜 (지방) 결합 조직을 흡입하여이 작업을 수행, 및 /또는 50 mL의 주사기에 큰 흡인력을인가. <ol><li> 이런 식으로 &#39;균형&#39;하면, (AB) 기록을 차동과 날개의 여백에 머리카락을 쓰다듬어 자발적인 행동 추적에서 전위 (APS) 또는 때를 찾기 위해 다시 전환. 일반적으로 단단한 (높은 저항) 시일 두에서보다 동일한 임피던스 - 활동이 (스파이크)이 표시되어 있지 않으면, 기록 전극의 신경 꽉 끼 우고 무관심 전극의 유륜 결합 조직을 재 점검 전극수록. 신호 : 잡음 비율 : 연습으로, 이것은 좋은 품질 (1&gt; 2)을 달성 할 것이다. </li></ol></li><li> 컴퓨터에서 실행되는 실험실 인터페이스 및 전기 생리학 소프트웨어를 통해 electroneurogram을 기록합니다. 스파이크의 오디오 출력은 매우 유용하고, 오디오 증폭기 및 관련된 오디오 스피커를 통해 neurogram를 공급함으로써 달성 될 수있다. 단지 화이트 N의 부재에 의해 식별 된 기준 잡음 (위가되도록 임계 값을 조정OISE) &#39;쉿&#39;. </li><li> 진피와 모공의 기반을 노출 ~ 5mm × 5 mm의 창을 열고, 조심스럽게, 약물 또는 피침 형 말단에 형광 스티 릴 염료 액세스를 높이 날개 마진 근처의 하위 피부 지방 층을 벗겨하려면 (그림 1A, B ). </li><li> (해당되는 경우, 단지 생성 된 윈도우의 수준에서) 나란히 놓이는 피부 층 사이에 명확한 식염수 채워진 간격을두고, 최고의 마진에 지방이 해제 된 귀 피부의 ~ 1mm의 배를 다시 핀. 부드럽게 스트로크 피부를 건드리지 않고, 핀 또는 접지 된 미세 집게로 접힌 가장자리를 따라 돌출 머리카락, 오디오 출력에서​​ 오실로스코프와 특징에 최대 AP 출력의 영역 &#39;클릭&#39;과 &#39;팝&#39;을 찾습니다. </li></ol> 3. 녹화 자극-유발 활동 전위 <ol><li> 기계적 자극 프로브를 위치 - cerami에 부착 된 화재 연마 10cm 붕 규산염 미세 유리C의 압전 액츄에이터 - 그래서 운동은 피부 배와 평행하다. 그것은 머리가 아니라 피부에 닿을 수 있도록, 배 팁을 피부에서 약 0.5 mm를 놓습니다. 천천히 머리카락을 편향 관찰 /를 급상승을 듣고 수동 프로브 팁을 이동하여 효과적인 자극을 확인합니다. </li><li> (변위에게 200 ~ 500 μm의 프로브., 5 Hz의 정현파에 매 10 초를 예를 들어 3 초) 1-3 머리카락의 기계적 자극을 구동하는 소프트웨어를 사용하여 신경의 자극-유발 반응을 기록한다. </li><li> 10 초 간격으로 여러 개의 동일한 기계적 자극 열차를 제공합니다. 다음 실험 프로토콜 (10 초 30 초에서 예를 들어 드롭 반복 속도)에 따라 자극의 빈도를 줄일 수, 반복성에 대한 프로브 위치를 최적화합니다. </li><li> 고주파 노이즈 진폭과 최대의 AP ~ 25 %의 2 배 ~로 설정하는 간단한 임계 값을 사용하여 AP-같은 활동 등을 구별하기 위해 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 임계 값으로 교차하는 AP를 계산생성 된 액세스 포인트의 주파수 특성을 정량화하는 &#39;이벤트&#39;. </li></ol> N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (디 부틸) 스티 릴) 피리 디늄 브로마이드 라벨과 결합 4. 녹화 자극-유발 발사 <ol><li> 자극 유발 심성 점화 말단 표지에 스티 릴 색소의 영향을 조사하기 위해, 입욕 용액 선택의 스티 릴 색소의 적절한 농도를 추가 전기 기록을 계속. </li><li> 필요한 노출 시간 (일반적으로 적어도 30 분) 후, 모낭을 볼 준비를 준비한다. 고정 핀을 제거하여 피변 전개 및 단말 표시를 나타 내기 위해 클리어 피부 영역을 노출. </li><li> 식염수 3 완전 변경, 염료 무료 식염수로 외부 염료를 씻어. </li><li> 가장 영구적 인 염료 오염 노출 / 외부 막으로부터 침출 할 수 있도록 10 ~ 15 분 동안 가스실 염료 무료 식염수의 최종 변화에 품어. </li><li> 금속 이온 봉쇄 제 (sulfobutylated 베타 - 사이클로 덱스트린, 1 ㎜, 5 분) 식염수와 세포막에 남아있는 비 내면화 염료를 제거합니다. </li><li> 수직 표면 형광 현미경의 스테이지에 기록 챔버로 이동하고, 스테이지 / 슬라이드 이동기구와, 챔버와 결합. </li><li> 스티 릴 염료 여기 광으로 적합한 제조 방법을 밝히는. 뿌리 라벨 (그림 1)을 관찰하기 위해 10X 또는 25X 형광 현미경 목표를 사용합니다. </li></ol>

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여기서는 빠르게 절개 할 수있는 비교적 간단한 제제를 개발 낮은 모발 밀도 모낭 소수의 비교적 선택적 기계적 자극을 허용한다. 그것은 기계적 자극 모낭, 정의 된 전기 생리 반응으로, 즉 영상 여포를 시각화 응용 프로그램을 염색 할 수있는 응답을 포함하여 전기 생리 레코딩 및 라이브 셀 형광 이미징을위한 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 우리가하지 않은 반면,이 시스템은 하나의 단위 (하나의 감각 축삭) 기록에 대한 감각 신경을 하위 분할 및 감각 터미널 끝나는 형태를 시각화 대상 GFP 표현을 사용하여 쉽게 의무 보인다. 우리는 내재화를 형광 막 스티 pridinium 염료 (7)의 방출 특성을 조사하기 위해 귀 피부 제제를 사용하고, 기술은 원래 국소 vesic을 연구 개발시냅스 터미널 8 르 막 재활용. 시냅스에서, 영상도 쉽게 식별 단말기 8,9의 응답을 동시에 전기 생리 녹화와 결합된다. 우리가 먼저 염료는 mechanosensory 엔딩 (10)에 의해 내면화 된 기록이 초기 연구했다. 문화 및 달팽이관의 유모 세포의 감각 뉴런를 들어, 스티 릴 피리 디늄 염료에 의한 표시의 대부분은 다음 11, 12를 차단하려면 mechanosensory 채널을 통과하는 염료를 포함하는 것으로 보인다. 염료는 세포 내 세포막을 라벨,이 라벨은 되돌릴 수 없습니다. 그러나, 유모 세포에 기계적으로 13,14 자극되지 않은 완전히 차별화 된 차 감각 신경 근육 스핀들 (15)의 IA 엔딩으로 현장에서 단말기, 여기에 7 피침 엔딩에,에 스티 릴 염료 라벨은 막 세포 내 이입을 반영하는 것으로 보인다 라벨은 가역적이며, mechanosensory 입술을 차단하지 않기 때문에7,15,16을 ponses. 이 엔딩에 채널을 투과하여 일부 염료 국제화가 완전히 배제 할 수는 없지만, 현장에서 차별화 된 터미널에서 라벨의 대다수는 재활용 소포와 국제화에 의해이라고 염료 배양 동안 계속 발사와 라벨의 가역성에서 분명하다 막. 따라서, 이러한 간단한 방법은 용이하게 생체 조직에서 mechanosensory 단말의 다양한 기능의 조합 전기적 및 광학적 모니터링을 위해 사용된다. 가장 실용적인 기술과 마찬가지로, 재현성 반복과 연습이 필요합니다. 요점 일부 가치가 특별한주의를 설명한다. 해부 기록 세션을 통해, 제조가 계속 완전히 95 % O 2 / 5 % CO 2로 포화 식염수로 관류하도록하여 조직 생존 및 생존을 극대화. 어, 모공이 과정에서 변위되지 않는 머리를 확인무형 문화 유산은 감각 엔딩 발사를 자극 할 것이다. 어느 제제로부터 떨어진 미세 튜브와 기관 욕 통해 연속 층류 관류 시스템 또는 신중 버블 가스를 사용하거나 신중 항상 식염수 표면 아래 제조 유지 솔루션마다 20-30 분 리프레시. 흡입 기록 전극은 일반적으로 세포 내 기록에 사용되는 날카로운 전극 붕규산 피펫을 수정함으로써 제조된다. 첫째, 신중하게 분젠 버너 화염에 아주 짧은 (&lt;1 초) 노출에 의해 신경 및 화재 - 폴란드어에 맞게 적절한 내부 직경을주는 #로 3 집게를 날카로운 팁을 끊다 (2.4 및 2.5 참조). 기록 좋은 신호대 잡음비를 얻기 위해서는, 이들 두 전극의 온 저항 (내성)을 최대화하고 균등 쌍방 것이 필수적이다. 상기 두 전극에 다음에 주목하여이 작업을 수행합니다. 기록 전극의 경우, 내부 직경은 신경을위한 꼭 맞는 및 NE의 최대 길이를 확보RVE는 기록 전극로 흡입된다. 효과적으로 전극의 끝 부분을 밀봉하는 신경 주위의 결합 조직을 사용하려고합니다. 대안 적으로 또는 부가 적으로, 신경 옆에서 지방 조직의 적절한 크기, 테이퍼 부분의 좁은 끝을 그린다. 이어서, 튜브에 부착 된 50 mL의 주사기와 ~ 1 분 동안 강력한 흡입을인가함으로써 전극 팁 플러그. 잘 밀봉 된 팁의 경우, 강한 흡입을 적용하는 것은 단순히 플러그의 효율성을 강화하고 더 많은 액체 또는 신경에​​ 그릴 수 없습니다. 신경 손상을 방지하기 위해, 그러나, 결합 조직이 주변의 재료와 EAM 연골에 압축에서 신경 쿠션되어 있는지 확인합니다. 무관심 전극 최대한 가깝게 기록 전극의 저항 / 임피던스를 모방한다. 이 심하게 불 연마 실제로 실링없이 가능한 한 작은 구멍에 팁의 도움된다. 상기 저항이 필요한 경우, adipo와 무관 전극의 단부를 연결SE 결합 조직, 기록 전극 전술 한 바와 같이. electroceramic는 공간적 시간적, 기계적인 변위를 통해 정교한 제어 할 수 있습니다. 높은 온도는 그들을 파괴, 너무 뜨거워 솔더를 사용하지 않는 - 그러나, 전기 연결을주의하십시오. 금속로드 에폭시 접착제를 사용하거나 공급 업체에서 권장하는 전문가 푸시 맞는 소켓을 사용합니다. 이 모두를 단단히 잡고 전기 연결을 설정합니다. 표준 에폭시 수지와의 electroceramic에 유리 자극 프로브를 연결합니다. 불 닦으 표준 10cm의 끝이 조직 손상의 위험을 최소화하기 위해 전기 생리 학적 기록 패치 나 날카로운 전극 제조에 사용되는 1.5 mm 직경의 보로 실리케이트 유리 모세관 튜브를 X. 단일 모낭의 자극이 필요한 경우, 화재 - 폴란드어 팁은 하나의 머리에 맞게, 그리고 개방 조리개 내부에 하나의 머리를 가진 프로브를 배치합니다. 이것은 하나의 머리 위에 정교한 제어 할 수 있습니다. 스티 DY에 대한전자 표시는, 그것이 어린 동물 조직에서 일반적으로 더 균일하다. 그것은 왜 완전히 명확하지 않다, 그러나 이것은 가능성이 젊은 조직에서 적은 기계적 외상 및보다 효과적인 깊은 조직 제거를 반영한​​다. 모낭의 기초 위에 놓인 거품 층 닮은 발포 폴리스티렌 제거에 철저해야합니다. 이것은 신경 얼기 층과 연관된 피침 단말기 위험을 제거하지만, 너무 격렬 피하기. 거의 또는 전혀 전기 모낭의 움직임에 응답하고, 스티 릴 염료 프로그램이있는 경우 (오렌지색 / 노란색) 대신 피침 말단보다 모발의베이스의 구별자가 형광과, (황색 / 백색) 피지선의 주된 표시 리드 오버 열정적 인 여유는 기본 조직을 손상했다. 마지막으로, 이미징 전에 염료 킬레이트 제를 사용하는 것은 매우 최종 이미지의 이미지 콘트라스트과 품질을 향상시킵니다. 이 기술은 추가 연구의 범위에서 유용 할 수있다. 이 공동자민련 후보 채널에 대한 선택적 약물 리간드와 준비를 배양하거나 유전자 삭제 등의 채널을 마우스 선을 선별하여, 스트레치 유발 반응에 대한 책임이있는 mechanosensory 채널 (들)에 대한 심사, 예를 들어, 등이 있습니다. 후자 인해 Npy2r 링크 GFP 발현 17 예, 마우스 라인에서 유전자 조작에 터미널 형태의 변경의 형광 평가와 결합 될 수있다. 마지막 예는 SLV 매출의 조절의 효과를 검사하여 이러한 피침 터미널에서 시냅스 같은 소포의 역할 (SLV는) 7을 조사 할 수있다 (칼슘, 마그네슘을, latrotoxin, 글루타메이트 수용체 리간드) 스트레치 유발 반응과 스티 릴 염료 흡수에 /해제. 따라서,이 새로운 기술은 mechansensory 신경 과학 연구의 잠재적 흥미로운 도로의 범위를 엽니 다.

감각 축삭의 피침 형 단자는 포유 동물의 모낭은 머리카락 샤프트 상피 주위 벼랑을 형성 지배하는. 그 목적은 서라운드 모발의 기계적 변위를 검출하는 것이다. 그들은 빠른 속도로 천천히 주로 머리의 움직임에 반응하여 활동의 짧은 버스트를 생성 엔딩 적응의 혼합이다. 이동도 계속 변위의 존재 멈출 때 활동 매우 빨리 중단. 여기에서 우리는 구조의 상관 관계 연구를위한이 쥐의 날개 모델의 개발을 설명하고 피침 형 단말기에서 작동합니다. 귓바퀴는이 엔딩 연구를위한 많은 유리한 기능을 가지고 있습니다. 첫째, 날개는 모공과 터미널에 대한 접근을 방해하는 사이에 피부 기본적으로 두 개의 층이 조금 다른 조직으로, 백투백 나란히 놓이는이다. 피부 때문에 힘든 결합 조직의 최소한의 금액에 매우 얇고 쉽게 해부하다. 신경 분포가 쉽게 접근하고 식별 할 수 있습니다. 머리 follicl 동안ES는 상대적으로 드문 드문 기계적으로 모공의 개인 또는 소규모 그룹의 자극을 용이하게 분산되어 존재한다. 얇은 기본 피부 층은 약리학 적 약물 및 염료와 신경 단자에 좋은 접근성을 제공합니다. 이것은 형광 현미경을 이용하여 촬영 연구에 특히 적합한다. 이미징은 어느 생활 터미널에서, 또는 고정 및 추가 조직 학적 처리 후이 될 수 있습니다. mechanosensory 뉴런의 반응은 모낭은 전통적으로 고립 된 피부 준비 3,4에, 조금 적게, 1, 2 코털 (vibrissae) 설치류에서 공부 한 지배하는. 다음은 모발 주변의 신경 말단에서 mechanosensory 생리학의 일반 원칙에 대해 우리가 많이 가르쳤다. vibrissal 준비는 단일 모낭의 움직임을 통해 정교한 제어 할 수 있습니다. 그러나 vibrissal 같이 복잡성으로 인해 출력을 해독하기가 어려울 수있다여포는 해부학 적으로 별개의 mechanosensory 결말 (5)의 적어도 8 가지 유형을 포함하고 특정 전기 생리 반응에 이러한 형태 학적 유형의 일치는 여전히 논쟁의 문제이다. 마우스 피부 / 복재 신경 제제는 주로 터치 통증 반응을 조사하기 위해 면도 한 상태에서 사용된다. 이러한 준비 모낭의 신경 분포는 덜 복잡하지만 모낭의 밀도, 플러스 등의 근접 6 세 가지 뿌리 유형 (가드, 송곳 / auchene 및 지그재그 머리카락)의 존재는, 특정 응답을 공부 의미 단일 모낭이나 결말의 하나의 유형은 다시 도전하고있다. 또한,이 제제는 복잡한 해부을 포함한다. 마지막 vibrissal 및 기타 피부 제제 모두에서, 제제는 아직 살아있는 생체 상태 관련된 결말을 시각화하기 어렵다. 따라서, 조직 절편은 GFP 발현 마우스 라인도 필요합니다. 교류 직류vely, 이러한 면역에 대한 고정 및 / 또는 항체 배양 등의 추가 면역 학적 / 조직 학적 처리가 필요합니다. 따라서 우리는 날개 준비를 개발하고 모낭의 구 심성의 제한된 인구에서 전기 녹음을 만들기 위해 그것을 사용하고 막 사이클링 스티 릴 피리 디늄 염료의 흡수에 의해 입증이 피침 엔딩에서 발생 보여왔다. 마지막으로, 염료는 mechanotransduction 채널을 차단하지 나타내는 기계적 감성을 방해하지 않는 것으로 나타났다. 간단한 자극 프로토콜 분석의 결과가 도시되어있다.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>유연하고 불활성이며 반투명한 고체 실리콘 폴리머.</td></tr><tr><td>No. 3 Dumont 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz 곤충 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>최소한의 손상으로 귓바퀴 준비물을 PDMS에 단단히 부착하는 매우 미세한 핀.</td></tr><tr><td>AC 차동 프리앰프</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL104A</td><td>들어오는 구심성 전기신경도의 크기를 증폭합니다. 차동 기록은 외부 전기 잡음과 베이스라인 드리프트를 최소화합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>High/Low-pass Filter</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>신호 컨디셔닝은 외부 전기 노이즈를 줄여 최상의 신호 대 잡음비를 보장합니다.</td></tr><tr><td>스파이크 트리거</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL201</td><td>이벤트 검출기 임계값을 설정하고 오실로스코프에 표시합니다. 이는 활동전위 검출 효능을 보여줍니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>오디오 증폭기 및 스피커</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S</td><td>현미경의 기계적 자극 준비를 조정하는 동안 감각 종말의 전기 발사 존재 여부에 대한 유용한 오디오 모니터링&nbsp;</td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Digitimer</td><td>PM3380A</td><td>우리는 이 구형 모델을 사용하지만 모든 표준 오실로스코프로 충분합니다.</td></tr><tr><td>Piezo electroceramic&nbsp; wafer</td><td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td><td>PZT507</td><td>전기생리학/컴퓨터 인터페이스</td></tr><tr><td>Piezo electroceramic&nbsp; 전원 공급 장치</td><td>가정용</td><td></td><td>0-200 V DC 출력으로 세라믹 웨이퍼 변위를 구동하며, 녹음/자극 소프트웨어 및 컴퓨터 인터페이스를 통한 출력의 가변 전자 제어를 제공합니다. 우리는 Spike2 소프트웨어와 1401micro 컴퓨터 인터페이스를 사용합니다.</td></tr><tr><td>전기생리학 소프트웨어</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>전기생리학 기록, 자극 및 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>실험실 인터페이스</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>1401 마이크로</td><td>전기생리학 인터페이스, 증폭기/필터와 컴퓨터 사이. 그것은 electroneurogram을 입력하고 또한 electroceramic 운동을 구동합니다.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>세포막의 외부 소엽으로 가역적으로 분할되는 형광막 프로브. 주로 소포막 내포/외포작용(vesicle membrane endo-/exocytosis)을 모니터링하기 위해 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>노출된 멤브레인에서 FM1-43(및 기타 스티릴 피리디늄 염료)을 킬레이트화하여 배경 표지/형광을 낮춤으로써 내재화된 염료를 더 명확하게 볼 수 있도록 하는 술폰화 b-사이클로덱스트린 유도체</td></tr>.<tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>흑백, 냉각 CCD 카메라 - 기본 모델</td></tr><tr><td>Volocity 3D 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>이미지 캡처 및 분석 소프트웨어.</td></tr></tbody></table>

마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

신규 해부 및 녹화 기술은 마우스 날개에 머리카락의 기계적인 변위에 의해 유발 모니터링 구 심성 발사에 대해 설명한다. 이 기술은 매우 경제적이고 용이 가장 흔히 전기 생리학 실험실에서 발견 또는 쉽게 구입할 재료로 수행된다. 해부는 독점 소프트웨어에 의해 제어되는 일반 electroceramic 웨이퍼에서 제공하는 기계적인 변위, 간단하고 빠르다. 동일한 소프트웨어는 또한 기록하고 electroneurogram 출력을 분석한다. 유발 된 신경 활동의 기록은, 화재 연마 표준 유리 미소 전극에 접속 된 상용 차동 증폭기 통해서이다. 유용한 정보는 제조, 자극과 기록 품질을 최적화하기위한 촬영 조건의 품질을 개선하기 위해 주어진다. 시스템은 물론 모낭의 방어벽 엔딩 피침 단자의 전기 생리 학적 및 광학적 특성을 분석에 적합자신의 약리 및 / 또는 유전자 조작의 결과. 스티 릴 피리 디늄 중요한 염료 기계적 자극 및 라벨과 전기적으로 기록을 조합의 예를 설명한다.

서브 피하 지방 조직은 모낭을 노출하기 위해 제거와 전기 생리 학적 기록 장치는,도 1a에 도시된다. 이 노출 된 부분의 일부는도 1b에 시야 조명의 높은 배율에서 도시된다. 이 지역에서 다시 자체에 날개 마진을 접는 것은 표피 표면을 노출합니다. 이는도 1C 색소 노출 다시 펼친 위치에 여유를 반환 한 후, 여포 자극 것을 보여준다 무딘 프로브 (도시하지 않음). 기계적 자극에 대한 이상적인 상황에서 수평으로 돌출 스크롤의 가장자리에 머리카락을 위치 결정 이 위치에서 스티 릴 피리 디늄 염료로 표지되었다. 제제는 일반적으로 Electroneurograms 심지어 가장 큰 크기의 AP를 포함하는 유리 섬유 프로브의 이동을 강요의 부재 (도 2a에 계속 AP 활성을 보여 <str옹&gt; I-III). 활동은 매우 평평 자극의 기간 사이의 간격에 대한 자기 상관으로, 어떤 구조 나 등장의 조짐을 보이고 없으며, 약 10 ~ 20 충동 / ​​초 ( &#39;스파이크&#39;추적)의 비율로 발생합니다. 5 Hz의 동안, 모간 100 μm의 기계적 자극, 전체 출력은 통상적으로 20 내지 50 자극 / 초 또는 정현파주기 당 4-10으로 상승한다. 사이클 히스토그램의 건설은 다음의 답변 ( &#39;위상 잠금&#39;소위) 강한 유입을 보여준다 (그림 2Bi-III)). 응답이 잠겨있는 파형의 위상이 운동하는 시점에서 즉, 자신의 위치에 진동 프로브 그것을 접촉 머리를 좌우하지만 이것은 아주 반복합니다. 간단한 임계 값 검출 (A에서 neurogram 트레이스를 가로 지르는 수평 라인은 (ⅰ-III))이 분석에 사용되었다. 그러나, 기록 소프트웨어 기능은 종종보다 복잡한 방식으로 사용될 수있다스파이크의 크기와 모양의 특징을 구별. 이 후, 의사 - 단일 단위 기록 분석이 수행 될 수 있도록 이러한 특성에 의해 특정 심성 섬유의 응답을 분리 할 수​​있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> 그림 1 :. 전기 생리 녹화 배치 및 N- (3-triethylammoniumpropyl는) -4- (4- (디 부틸) 스티 릴) 헤어 난포 수입 성의 피침 엔딩의 피리 디늄 브로마이드 라벨링은 (A) 날개 준비가 날개를 나타내는 전기 생리학 실험 설정 배향 신경의 위치에, 기록 전극과 지방 조직의 제거 후 모낭 신경 분포의 노출 영역. (B) 여러 모낭은 진피 아래 위에있는 지방 조직의 허가 지역의 명 시야 조명에서 볼 수 있습니다. 어두운는 일반적으로 bilobed, 모양은 피지선 있습니다. ( <st룽&gt; C) 스티 릴 염료 N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (디 부틸) 스티 릴) 피리 디늄 브로마이드 및 표면 형광 현미경에 의한 기계적 자극 후 군데로 표시된 두 개의 피침 엔딩을 보여주는 B의 박스 영역)의 확대보기 . 7에서 허가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> 그림 2 : 마우스 피나에서 녹음 (A) 자극 - 유발 활동. 표준 Liley의 생리 식염수에 귓바퀴에서 연속 neurograms에서 활동의 3 가지 실험에서 촬영 (AI-III) 예. 각 레코드는 5 초 부분 콘텐츠로의 정현파 변위 3 초 기간을 포함 녹화 시작 후 약 5 분을 도시머리 샤프트​​의 몰 수. 기계적 자극은 보통 1-2 시간 동안 지속 연속 녹화 전반에 걸쳐 매 30 초 반복 하였다. 커스텀 스크립트 파일은 수평 커서 (스파이크)에 의해 설정된 임계 값뿐만 아니라, 각각의 정현파주기 (기간)의 개시를 넘어 개별 이벤트를 표시. (AIV) 정현파 변위의 명령 신호. 의 (B) 분석 급상승 활동을 자극은-유발. 3 ° 쓰레기통에 (BI-III) 사이클 히스토그램 유리 프로브 헤어 샤프트의 5 Hz의 정현파 변위에 의한 기계적 자극에 대한 추정 피침 엔딩의 응답을 보여, (인공 지능 - ⅲ) 각각 neurogram 샘플로 구성. 기계적 프로브의 시작 위치에 대한 상대적인 위치에 따라,주기의 다른 단계에서 표시된 위상 잠금 참고. (BIV) 표준화 프로브 변위 정현파; 실제 크기는 약 100이었다1;. m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

쥐, 귀, 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말끝의 피침형 말단의 기계적 자극으로 인한 구심성 방전을 기록하는 간단하고 새로운 기술이 제시됩니다.

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 접근이 매우 어렵고 기계적 자극에 민감한 신경세포 말단에서 살아있는 세포 이미징과 전기생리학적 기록을 결합하는 빠르고 간단한 방법을 제시하는 것입니다. 이 방법은 기계적 감각 수용의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 완전히 분화된 말단의 in situ 상태에서 시냅스 유사 소포의 역할이나 후보 기계적 변환 채널의 약리학적 특성 등을 연구할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 매우 간단하면서도 생리학적 조사를 위해 완전히 분화된 신경 말단에 시각적으로 접근할 수 있다는 점입니다. 비록 이 방법은 모낭 구심성 신경에 초점을 맞추고 있지만, 근방추, 메르켈 감각 말단 및 압수용체와 같은 다른 낮은 역치의 기계적 감각 시스템에 대한 통찰력도 제공할 수 있습니다. 이 기술의 함의는 비정상적인 혈압 조절 치료를 포함하여 기계적 센서를 조절하기 위한 새로운 약물 표적 개발로 확장됩니다.성체 초기 단계의 마우스를 안락사시킨 후, 입체 해부 현미경 하에서 가스가 충전된 Liley 용액이 담긴 50 centimeter 너비의 바닥 접시에 머리를 등 쪽이 위로 향하게 놓습니다. 약 10분마다 가스 silane으로 해부 부위를 충분히 헹굽니다. 이제 스프링 가위와 3번 핀셋을 사용하여 귓바퀴 기저부의 피부를 조심스럽게 절개하고 분리합니다.외이도의 신경 분포와 연골을 노출시킵니다. 하악관절 틈새에서 두개골로부터 나오는 삼차신경 하악분지와 대이개신경의 분지들을 확인합니다. 이 두 신경 분지들은 연골을 통과하여 귓바퀴 피부의 오목한 면과 볼록한 면에 분포합니다.그 다음, 하악골과 유양돌기 사이의 홈에서 삼차신경 분지들이 나오는 지점을 확인합니다. 귓바퀴를 두개골에서 조심스럽게 당겨 해당 부위의 길이를 노출시킵니다. 이렇게 노출되면, 두개골에 최대한 가깝게 신경을 절단합니다.다음으로, 스프링 가위(spring bow scissors)를 사용하여 머리에서 귓바퀴(pinna)를 제거합니다. 절단된 신경의 원위부 그루터기가 잘리지 않도록 주의하고, 빽빽한 털의 양을 최소화하십시오. 제거한 귓바퀴를 가스 처리된 Liley's solution이 채워진 실리콘 고무 라이닝 접시에 옮깁니다.이제 외이도를 가장 좁은 지점에서 절개하여 개방합니다. 그런 다음 귓바퀴를 오목한 면이 아래로 향하게 하여 편평하게 펴고, 가장자리를 따라 일정한 간격으로 매우 가는 곤충 핀을 사용하여 고정합니다. 다음으로, 가위를 이용한 둔성 박리를 통해 귓바퀴와 하부 연골에서 노출된 배측 피부를 완전히 제거합니다.이 단계에서 전면 피부가 손상되지 않도록 주의하십시오. 그다음 포셉을 사용하여 가는 곤충 핀을 잡고, 피부와 외이도 연골 사이의 후방으로 나오는 하악분지의 절단된 분지들을 조심스럽게 확장합니다. 이 신경 분지들을 가능한 가장 가는 핀으로 플레이트에 고정하십시오.신경 덩어리 자체가 아니라, 절단된 끝단에 인접한 결합 조직을 찔러 고정합니다. 신경 분지 주변의 주변 결합 조직 대부분을 제거하여 조직 준비를 완료하되, 과도하게 당기거나 절단하여 신경이 손상되지 않도록 주의하십시오. 모낭 기계수용성 종말을 생체 염색약이나 약물로 처리하려면, 귓바퀴 가장자리를 따라 5 mm 범위의 피부하 지방층에 있는 거품 모양의 섬유탄성 연골을 조심스럽게 벗겨냅니다.따라서 사각형 창을 열어 진피와 모낭 기저부를 노출시킵니다. 어린 생쥐를 사용하면 앞쪽 피부층과 뒤쪽 피부층 사이의 유착을 최소화하고 하부 연골 제거의 어려움을 줄일 수 있습니다. 이 두 가지 요소 모두 성공적인 염색 결과를 얻을 가능성을 높여줍니다.준비된 시료를 기록 챔버의 실리콘 라이닝 바닥으로 옮기는 것으로 시작합니다. 미세 곤충 핀을 사용하여 귀의 가장자리를 고정하고, 귀 기저부의 깨끗한 신경을 두 개의 흡입 전극 근처에 배치합니다. 하나는 기록용 전극이며, 다른 하나는 무차별 전극으로 차동 증폭기에 중성 신호를 제공하는 역할을 합니다.기록 전극의 경우, 개구부의 구경과 내부 직경을 기록 대상으로 선택한 신경의 두께에 세심하게 맞추십시오. 일단 조정이 완료되면, 일반적으로 일련의 실험 과정 동안 이 설정은 일정하게 유지됩니다. 적절한 길이의 신경이 내부에 꼭 맞게 들어가야 합니다.신경을 전극 내부로 끌어당기기 위해, 실리콘 튜브로 연결된 2 mL 주사기를 사용하여 부드럽게 흡입하십시오. 기록 전극 내에서 흡입하는 동안 미세 곤충 핀을 이용해 신경을 조심스럽게 뺐다가 다시 삽입함으로써, 신경이 꺾이거나 겹치지 않고 곧게 펴졌는지 확인하십시오. 이제 전극 입구에 수밀 씰(water tight seal)을 형성하기 위해 주변의 결합 조직이나 부드럽고 유연한 지방 조직을 일부 함께 흡입하십시오.고품질의 차등 기록을 위해서는 전극 간의 균형 잡힌 임피던스를 형성하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 신경 주위에 고저항의 수밀 씰을 형성하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 자발적인 모세관 현상으로 채워지지 않은 경우 흡입을 통해 무관극에 식염수를 채웁니다.그다음, 동일한 은 기록 와이어를 기록 전극과 무관 전극의 내부 보어에 배치합니다. 와이어의 반대쪽 끝은 2코어 차폐 케이블의 서로 다른 코어에 연결되어야 합니다. 기록 전극의 와이어가 밀봉을 손상시키지 않으면서 식염수와 접촉하고 신경 가까이에 위치하도록 확인하십시오.와이어를 무차별 전극(indifferent electrode)의 끝부분에 넣습니다. 다음으로, 은-염화은 펠렛 형태의 접지 전극을 수조에 넣습니다. 이 전극을 기록 전극에 연결된 2심 케이블의 쉴드(screen)에 연결합니다.오실로스코프로 각각의 신호를 확인하여 두 채널의 전기적 노이즈 수준이 유사한지 점검하십시오. 두 전극의 균형이 맞지 않으면 기록 전극에서 발생하는 자발적 활동 전위가 보이지 않을 수 있습니다. 배경 노이즈의 차이를 보정하려면, 지방 결합 조직을 전극 안으로 더 흡입하여 한쪽 채널의 임피던스를 높이십시오.전극의 배경 신호가 균형을 이루면, 차동 기록(differential recording) 모드로 전환하여 자발적인 활동 전위를 관찰하거나, 화염 연마된 유리 막대로 귓바퀴 가장자리의 털을 자극하여 활동 전위를 유도합니다. 그다음, 컴퓨터 인터페이스를 통해 전기신경도(electroneurogram)를 기록합니다. 그리고 신경도를 음향 시스템에 연결하여 기저 소음보다 약간 높은 수준에서 스파이크 소리가 들리도록 합니다.이 청각 피드백 릴레이는 실험을 수행할 때 매우 유용합니다. 다음으로, 털을 수동으로 자극하여 제거된 영역 근처 모낭의 신경 지배가 온전한지 확인하십시오. 이제 지방이 제거된 창의 높이에서 귀 피부 가장자리를 1~2mm 정도 접어 아래에 있는 털을 노출시키십시오.마주 보는 피부층 사이에 식염수가 채워진 간격을 둡니다. 주의 깊게 청취하면서, 접힌 가장자리를 따라 돌출된 털을 유리 막대로 부드럽게 쓰다듬습니다. 이때 피부에 닿지 않도록 주의하십시오.필요에 따라 오실로스코프를 확인하여 출력을 평가하십시오. 자극 유발 활동 전위를 제어하여 기록하려면, 세라믹 피에조 전기 액추에이터에 부착된 10cm 길이의 화염 연마된 붕규산 유리 미세전극 기계적 프로브를 사용하십시오. 프로브를 피부 접힘선과 평행하게 이동하며 피부가 아닌 털에 닿도록 배치하십시오.피부 표면에서 약 0.5~1mm 위에 배치하십시오. 그런 다음, 프로브가 움직일 때 오디오 출력이 나오는지 확인하여 자극 여부를 수동으로 검증하십시오. 이제 좁은 영역의 모발에 기계적 자극을 가할 수 있도록 소프트웨어를 설정하십시오.예를 들어, 10초 간격으로 5 Hz 정현파의 3초 시뮬레이션을 프로그래밍합니다. 이를 위해서는 200에서 2,000 µm 사이의 프로브 변위가 필요합니다. 그다음, 반복적인 자동 자극을 사용하여 신경에서 기록된 반응의 일관성을 확인하십시오.재현 가능한 결과를 얻을 수 있어야 합니다. 결과가 일관되게 나타나면, 반복률을 30초마다 한 번으로 낮추십시오. 자세한 지침은 텍스트 프로토콜에 제공되어 있습니다.기계적 감각 채널의 특성을 조사하고 모낭 주변의 기계적 감각 말단을 표지하기 위해, 용액에 10 µM의 FM1-43을 첨가하고 60분 동안 둡니다. 이때 진동 프로브로 털에 대한 자극을 계속 가합니다. 이 염료는 배양된 상태의 후보 트랜스듀서 채널과 감각 뉴런, 그리고 와우 유모 세포를 차단합니다.하지만, 이는 성숙한 모낭 구심성 신경의 in situ 발화를 차단하지는 않습니다. 신경 말단의 표지 결과, 염료가 말단에 도달했음에도 불구하고 염료 노출 내내 기계적 자극에 계속해서 반응하는 것이 확인되었습니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 기록한 전기신경도(electroneurograms)에서는 수동 자극이 없는 상태에서도 일반적으로 지속적인 활동전위 활성이 나타났으며, 여기에는 가장 큰 크기의 활동전위가 포함되었습니다.자발적 활성은 초당 약 10-20 spikes로 나타났으며, 특정 구조나 강직성 징후는 보이지 않았습니다. 자극 기간 사이의 간격에 대한 자기상관은 항상 상당히 평탄하게 나타났습니다. 모간(hair shafts)에 5 Hz, 500 micron의 기계적 자극을 주는 동안 전체 출력은 일반적으로 초당 약 50 spikes까지 상승했습니다.사이클 히스토그램을 작성한 결과, 하나의 사인파 사이클당 4개에서 10개의 스파이크가 발생하는 강력한 동조 반응이 나타났습니다. 이는 상당히 재현 가능했으나, 반응이 고정되는 파형의 위상은 진동 프로브가 털의 어느 지점에 접촉했는지와 그 지점에서의 이동 방향에 따라 달라졌습니다. 이후 모낭 피침형 신경 말단(lanceolate nerve ending) 채널의 약리학적 특성을 탐구하였습니다.배양된 감각 뉴런이나 ex vivo 상태의 와우 유모 세포에 있는 일부 기계적 감각 채널을 차단할 수 있는 FM1-43에 노출되었을 때도 해당 채널들은 계속해서 반응하였습니다. 이 기술을 숙달하면 전기신경도(electroneurograms) 기록 시작 전까지의 과정을 60분에서 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 전극에서 높은 전기 저항 접촉을 형성하는 것이 중요하며, 모낭 시각화를 병행하는 경우에는 염료 침투력과 광학적 선명도를 높이기 위해 작은 크기의 마우스를 사용하는 것이 좋습니다.우리는 이 방법의 아이디어를 가까운 동료이자 현재 은퇴하신 Clarke Slater 교수와 그의 석사 과정 학생인 Nakul Kain이 원래 개발한 것에서 응용하였습니다. 당시 우리는 그들에게 근방추의 기계적 감각 수용에서 시냅스 유사 소포(synaptic-like vesicles)의 가능한 역할과, FM1-43을 이용해 이를 시각화할 수 있는 더 나은 방법의 필요성에 대해 언급했습니다. 약리학 및 생체 염색법과 같은 방법들을 이 절차에 따라 수행함으로써, 어떤 것이 실제 조직 내(in situ)의 기계적 변환 채널 및 분화된 말단인지, 그리고 기계적 자극이 시냅스 유사 소포의 재순환을 조절함으로써 염료의 흡수와 방출을 변조할 수 있는지와 같은 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. FM1-43은 독성 평가가 이루어지지 않았으므로 유해 물질로 취급해야 함을 잊지 마십시오.

combined-recording-mechanically-stimulated-afferent-output-nerve

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles(쥐 모낭에서 기계적으로 자극된 구심성 출력과 신경 말단 라벨링의 결합 기록)

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