전체의 형광 시간 경과 영상

본 형광 타임랩스 현미경 관찰 프로토콜의 전반적인 목표는 포자 형성 사상균인 Streptomyces venezuelae의 발달 및 세포 분화의 기초가 되는 생물학적 세포 과정을 연구하는 방법을 제공하는 것입니다. 설명된 방법은 역동적인 단백질 국소화, 극성 성장 및 포자 형성 격벽 생성을 포함하여 Streptomyces 생애 주기의 핵심이 되는 세포 생물학적 과정을 연구할 수 있는 우수한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 Streptomyces venezuelae가 액체 상태에서 포자를 형성한다는 것이며, 이를 통해 미세유체 장치에서 세포를 배양하고 전체 생애 주기를 현미경으로 모니터링할 수 있습니다.

이 방법은 다중 중심 균사체가 포자 사슬로 분화하는 과정을 살아있는 세포 영상화(live cell imaging)를 통해 관찰할 수 있게 함으로써, Streptomyces venezuelae가 해당 속의 새로운 발달 시스템으로서 가진 막대한 잠재력을 보여줍니다. 우선, 보충된 성장 배지 30 milliliters에 영상화할 S.venezuela 균주의 포자 10 microliters를 접종하십시오. 세포의 일관된 성장과 포자 형성을 위해, 충분한 통기가 가능하도록 배플 플라스크(baffled flask) 또는 스프링이 포함된 플라스크를 사용하십시오.

세포를 30°C, 250 RPM 조건에서 35~40시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 액상 탑재 위상차 현미경을 통해 균사 조각과 포자를 확인할 수 있어야 합니다. 배양액 1 mL를 탁상 원심분리기에서 400 ×g로 1분간 원심분리하여 균사와 큰 세포 조각들을 펠렛화합니다.

그 다음 포자 현탁액이 포함된 상청액 약 300 microliters를 새로운 1.5 millimeter 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 둡니다. 남은 배양액은 다음 단계에서 사용할 수 있도록 보관합니다. 이어서 보충된 성장 배지에서 포자를 1:20으로 희석하고, 필요한 시점까지 희석된 포자를 얼음 위에 보관합니다.

남은 배양액을 50-milliliter 비커에 붓고, 주사기로 10-milliliter를 취한 뒤 멸균된 22-micrometer 주사기 필터를 사용하여 남은 배양액을 여과 멸균합니다. 이는 포자와 균사 파편이 제거된 보충 성분이 포함된 소모 배지를 얻기 위함입니다. 유사한 성장 조건의 추가 실험이 예정되어 있다면, 여과된 보충 성분 포함 소모 배지를 4-degrees-celsius에서 며칠 동안 보관하십시오.

각 미세유체 플레이트는 최대 4개의 독립적인 실험에 사용할 수 있습니다. 사용하지 않는 유동 챔버의 오염을 방지하기 위해, 실험을 준비할 때 멸균 용액과 멸균 작업 환경을 사용하십시오. 먼저 미세유체 플레이트에서 운송 용액을 제거하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 멸균된 보충 성장 배지로 웰을 헹굽니다. 헹굼이 끝나면 1번 웰의 입구에 보충 성장 배지 300 µL를 넣고, 2번에서 6번 웰까지는 사용한 보충 성장 배지 300 µL를 넣습니다. 다음으로 희석된 포자 40 µL를 A레인의 8번 웰에 로딩하고, 제조사의 지침에 따라 플레이트에 매니폴드를 밀봉합니다.

미세유체 제어 소프트웨어를 실행하고 적절한 플레이트 유형을 선택합니다. 유로와 배양 챔버를 프라이밍하기 위해, 1번부터 5번까지의 유입 웰에서 배지가 웰당 2분 동안 6 psi의 압력으로 흐르도록 유량 프로그램을 설정합니다. 그 후, 보충된 성장 배지가 1번 유입 웰로 6시간 동안 6 psi의 압력으로 흐르도록 설정합니다.

이를 통해 발아와 영양 성장이 이루어지게 합니다. 6시간 후에 프로그램이 보충제가 첨가된 사용 완료 성장 배지로 전환되어, 실험의 남은 기간 동안 6 psi의 압력으로 2번부터 5번 웰까지 흐르도록 설정하십시오. 환경 챔버를 미리 30 °C로 예열해 두십시오.

그런 다음 현미경과 현미경 제어 소프트웨어를 켭니다. 고개구수 오일 침강 대물렌즈를 장착하고, 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지와 황색 형광 및 적색 형광 단백질 융합 이미지를 획득하는 데 적절한 필터와 다이어프램 미러가 설정되어 있는지 확인합니다. 대물렌즈와 미세유체 플레이트의 이미징 윈도우 바닥면에 침강유 한 방울을 떨어뜨립니다.

밀봉된 미세유체 장치를 도립 현미경의 스테이지 위에 조심스럽게 장착하고 고정합니다. 내장된 위치 마커를 사용하여 미세유체 배양 챔버의 이미징 창의 초점을 맞춥니다. A라고 표시된 첫 번째 흐름 챔버의 가장 왼쪽 부분에 초점을 맞춘 다음, 트랩 높이가 7 micrometers인 트랩 크기 5 위치로 스테이지를 이동합니다.

미세유체 소프트웨어에서 시스템 설정 시, 8번 입구 웰로부터 4 psi의 압력으로 15초 동안 세포를 로드하도록 설정합니다. 프로세스가 실행되면 스테이지를 이미징 창 너머로 이동시켜 배양 챔버 내의 세포 밀도를 확인합니다. 포자가 포집되지 않은 경우, 세포 로딩 단계를 반복하거나, 이미징 창당 1~10개의 포자라는 원하는 세포 밀도가 달성될 때까지 로딩 압력 및/또는 시간을 늘립니다.

배양 챔버에 과부하가 걸리지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 제어 소프트웨어에서 이전에 준비한 유량 프로그램을 시작하고, 이미지 획득을 시작하기 전 현미경 스테이지에서 미세유체 플레이트가 1시간 동안 열 평형 상태에 도달하도록 하십시오. 현미경 제어 소프트웨어에서, 먼저 이미지 파일의 자동 저장을 위한 디렉토리를 지정한 후, 시간에 따라 여러 스테이지 위치에서 여러 이미지를 촬영하도록 다차원 획득 설정을 구성하십시오.

다음으로, 조명 설정으로 이동하여 각 특정 컨스트럭트에 대해 미리 결정된 최적의 조명 설정을 입력합니다. 그런 다음 24시간 동안 40분마다 이미지를 획득하도록 타임 시리즈를 설정합니다. 스테이지 위치를 결정하고 오토포커스를 설정하기 위해, 배양 챔버를 스캔하고 관심 있는 각 이미징 위치에 대한 스테이지 위치를 저장합니다.

광퇴색 및 광독성을 최소화할 수 있도록 단일 스테이지 위치 간의 간격을 충분히 띄워 설정하십시오. 선택한 스테이지 위치의 Z 좌표가 확인되면 하드웨어 오토포커스를 활성화하십시오. 그 다음 현미경 제어 소프트웨어에서 타임랩스 실험을 시작하십시오.

24~30시간 후, 또는 관심 영역의 균사가 포자로 분화되었을 때 이미지 획득을 중단하십시오. 그런 다음 소프트웨어에서 흐름 프로그램을 중지하고 미세유체 장치를 분해하십시오. 입구 웰, 폐액 웰 및 세포 로딩 웰에서 남아 있는 배지를 모두 제거하여 사용한 미세유체 플레이트를 단기 보관용으로 준비하십시오.

그런 다음 A레인의 사용한 웰과 사용하지 않은 레인의 웰을 멸균 PBS로 채웁니다. 마지막으로, 플레이트가 마르는 것을 방지하기 위해 파라필름으로 밀봉합니다. 그리고 플레이트를 4°C에서 보관합니다.

S.venezuela 생애 주기 전체의 성공적인 살아있는 세포 이미징을 통해 발아, 영양 성장 및 포자 형성이라는 주요 발달 단계를 포함한 연속적인 시계열 데이터를 얻을 수 있습니다. 발아 또는 영양 성장 단계 동안, DivIVA-mCherry는 성장하는 균사 끝부분에만 선택적으로 축적되거나 새로 형성되는 균사 분지점을 표시합니다. 이와 대조적으로, FtsZ-YPet은 성장하는 균사체 내에서 불규칙한 간격으로 단일 고리 모양 구조를 형성합니다.

이러한 구조들은 비구성적 영양격벽(nonconstructive vegetative cross walls) 합성을 위한 지지체 역할을 하여 서로 연결된 균사 구획의 형성을 유도합니다. 포자를 형성하는 균사에서 FtsZ-YPet의 국소화 패턴은 급격하게 변화합니다. 먼저, 나선형의 FtsZ-YPet 필라멘트들이 균사를 따라 굴러가며 이동하고, 이후 거의 동시에 일어나는 급격한 사건을 통해 이러한 나선들이 일정한 간격의 FtsZ-YPet 링 형태의 사다리 구조로 통합됩니다.

마지막으로, 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지에서 포자 형성 격벽이 식별 가능해지며, 최종적으로 새로운 포자가 방출됩니다. 이 기술은 Streptomyces의 전체 생애 주기에 대한 살아있는 세포 이미징을 수행할 수 있는 강력한 프로토콜을 제공합니다. 이 미세유체 시스템은 사용법이 간편합니다.

이 실험 구성은 실험적 유연성을 제공하며 장기간의 모니터링을 가능하게 합니다. 또한, 변화하는 배양 조건에 반응하는 특정 발달 사건을 조사하거나, 형광 염료를 사용하여 펩티도글리칸 합성을 모니터링하거나 염색체 조직을 시각화하는 연구를 시작하기에 매우 적합한 기초를 제공합니다.