Name: 전체의 형광 시간 경과 영상 S. venezuelae 수명주기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 학습하세요 형광 시간 경과 현미경법을 이용하여 Streptomyces venezuelae의 전체 수명주기를 실시간 관찰하는 방법을. 미세유체 장치를 활용한 이 기술은 세포 분화와 포자 형성 과정을 연구하는 데 탁월한 플랫폼을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자는 현미경에 대한 기술적 지원을 해준 Grant Calder에게, 프로토콜에 대한 의견을 제공해 준 Matt Bush에게, 그리고 Zeiss 광시야 현미경을 구입해 준 John Innes Centre에 감사를 표합니다. 이 연구는 BBSRC 보조금 BB/I002197/1 (M.J.B에게), BBSRC Institute Strategic Programme 보조금 BB/J004561/1 (John Innes Centre에), 스웨덴 연구 위원회 보조금 621-2010-4463 (K.F.에게), Leopoldina Postdoctoral Fellowship (S.S.에게)의 지원을 받았습니다.

신선한 S. 1. 분리 venezuelae 포자와 소비 문화 매체의 준비 <ol><li> divIVA-mcherry의 P의 ftsZ - 변형 SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (P의 divIVA 10 μl의 포자로, 60 μL R2 미량 원소 용액 (TE)로 보충 된 30 ml의 말토오스 - 효모 추출물 - 맥아 추출물을 접종 (MYM) 매체, -ftsZ-ypet)]. 일관된 성장과 세포의 포자를 들어, 당황 플라스크 또는 충분한 통기 수 있도록 스프링이 들어있는 플라스크를 사용합니다. </li><li> 30 ° C에서 35 ~ 40 시간, 250 rpm으로 문화에 대한 세포. </li><li> 액체 장착 된 위상차 현미경으로 세포를 검사합니다. 이 시점에서 균사 조각과 포자 볼 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기는 1 분 400 XG에 테이블 탑 원심 분리기 1 ml의 세포는 균사체 큰 세포 조각을 펠렛합니다. </li><li> 약 300 ㎕의 상층 액을 공동으로 이동새로운 1.5 ML 튜브에 포자 현탁액을 ntaining과 얼음에 보관하십시오. 단계 1.7에 대한 나머지 배지를 유지합니다. </li><li> 포자에게 MYM-TE에서 1시 20분 희석 (최종 농도 : 0.5 × 10 7 포자 / ㎖) 및 필요할 때까지 얼음에 보관 (단계 2.3 참조). 주 : 스트렙토에서 포자를 트리거 정확한 조건은 포자 배양에서 알 수없는 세포 외 신호에 포함 소비 MYM-TE 매체를 이용하여 이해되지 않지만, 포자 형성을 자극한다. </li><li> 포자와 균사 조각 무료 MYM-TE 지출을 구하는 나머지 배지 10 ㎖를 필터 - 소독. 멸균 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 전송 멸균 15 ML 튜브에 MYM-TE를 보냈다. </li><li> 유사한 성장 조건을 사용하여 추가 실험을 수행 할 경우 39 ° C에서 몇 일 동안 제조 소요 MYM-TE 유지. </li></ol> 미세 유체 장치 2. 준비 참고 : 각 미세 유체 괞 찮아테가 수행하는 네 개의 독립적 인 실험까지 할 수 있습니다. 실험을 설정할 때 사용되지 않는 흐​​름 챔버의 오염을 방지하기 위해 멸균 솔루션과 근로 조건을 사용합니다. <ol><li> 미세 유체 플레이트에서 운송 솔루션을 제거하고 멸균 MYM-TE로 우물을 씻어. </li><li> 300 ㎕의 MYM-TE는 6 우물 2에 잘 1 300 μl를 보냈다 MYM-TE 입구에 추가. </li><li> 부하 40 μL는 레인 &quot;A&quot;의 셀 로딩 잘 8 단계 1.6에서 포자를 희석에 따른 플레이트에 매니 폴드 지침을 제조 밀봉. </li><li> , 미세 유체 제어 소프트웨어를 실행 적절한 플레이트 유형을 선택하고 잘 당 2 분 6 psi에서 5 입구 우물에서 흐르는 매체에 의해 1 주요 유동 채널과 문화 챔버로 흐름 프로그램을 설정합니다. </li><li> 발아 및 식물 세포의 성장을 허용하기 위해 6 시간 동안 흡입 웰 1 MYM-TE 흐르는 : 미세 유체 제어 소프트웨어, 실험 유량 프로토콜을 생성한다. 스위치다음 실험의 나머지 기간 동안 잘 2~5에서 소비 MYM-TE의 관류에 관한 것이다. 실험 과정 동안 (약 9 μL 매체 / 시간에 상응 함) 6 psi에서 유동 압력을 일정하게 유지한다. 단계 3.5 이후 흐름 프로그램을 시작합니다. </li></ol> 현미경 및 시간 경과 프로토콜의 3. 최대 주 :이 방법은 sCMOS 카메라, 메탈 할라이드 램프, 하드웨어 자동 초점, 96 웰 플레이트 단계 홀더 환경 챔버를 구비 한 완전 자동화 된 동력 위드 도립 현미경상에서 구현되었다. <ol><li> 실험 시작 후 오토 포커스 문제를 방지하기 위해서 사전에 30 ° C의 환경 챔버를 미리 가온. 필요한 시간은 사용 환경 챔버, 현미경 및 가열 시스템에 의존한다. 실험 전에 시스템을 밤을 가열하기 시작합니다. </li><li> 현미경 및 현미경 자동화 및 제어 softwa를 켭니다레. 이러한 100X, 1.46 NA 오일 DIC 목표로 최적의 신호 수집 및 공간 해상도에 대한 높은 개구 수 (NA) 오일 침지 목표를 사용합니다. 노란색 형광과 빨간색 형광 단백질 융합의 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지와 이미지를 수집하기 위해 적절한 필터 및 이색 거울을 선택합니다. </li><li> 목적에 침지 기름 방울을 놓고 이미지 획득 동안 셀 초점을 개선하는 미세 플레이트 촬상 창 아래쪽에 침지 유체를 추가한다. 조심스럽게 거꾸로 현미경의 스테이지로 밀봉 된 미세 유체 소자 (단계 2.5)를 탑재합니다. 판 안전하게 무대 홀더에 넣고 실험의 과정을 통해 이동하지 않는 것을 확인합니다. </li><li> 방향에 대한 매립 위치 마커를 사용하여 초점 미세 배양 챔버의 촬상 창을 가지고. 제 1 유동 챔버의 왼쪽 부분에 초점에 해당하는 트랩 크기 5 ( &quot;A&quot;를 표시)0.7 ㎛의 트랩 높이입니다. </li><li> 마이크로 유체 소프트웨어, 입구도 8에서로드 셀 15 초 4 PSI에. 촬상 창에 걸쳐 스테이지를 이동하여 배양 챔버에서 세포 밀도를 확인한다. 포자가 트랩되지 않은 경우, 셀 로딩 단계를 반복 또는 다른 원하는 세포 밀도 (2048 X 2048 픽셀 촬상 창 당 1-10 포자)에 도달 할 때까지 하중 압력 및 / 또는 시간을 증가시킨다. 문화 챔버를 과부하하지 마십시오. 우리는 일반적으로 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 이미징을위한 트랩 크기 5를 사용하지만, 우리는 4와 3 셀로드 프로세스를 최적화 추가 제안에 대한 공급 업체의 설명서를 참조하십시오 크기 트랩 좋은 결과를 얻었다 :합니다. </li><li> 단계 250에서 제어 흐름 소프트웨어 프로그램을 시작하고 미세 플레이트 화상 취득을 시작하기 전에 현미경 단계에서 1 시간 동안 평형을 가열 할 수있다. </li><li> 현미경 제어 소프트웨어에서 뮤를 취할 다차원 인수를 설정시간이 지남에 따라 여러 단계의 위치에서 ltiple 이미지 : <ol><li> 자동 저장의 경우 : 이미지 파일의 자동 저장을위한 디렉토리를 지정합니다. </li><li> 조명 설정에 대해서는 사전에 각 특정 구조에 대한 최적의 조명 설정을 결정합니다. DIC 150 밀리 초, YFP 250 밀리 초, RFP 100 밀리 : 설명 실험을 위해, 다음과 같은 노출 시간을 사용합니다. </li><li> 시계열 들어 : 시퀀스에서 원하는 시점에서 영상을 획득하는 시계열을 설정. S.의 수명을 이미징 venezuelae는 24 시간 동안 40 분의 시간 간격을 선택합니다. </li><li> 스테이지 위치 및 자동 초점 : 관심있는 각각의 결상 위치의 단계 및 저장 단계의 위치를​​ 이동하여 배양 챔버를 검사한다. 단일 단계의 위치가 충분히 떨어져 광표백과 phototoxicity.Typically (12)의 위치까지 사용할 최소화하기 위치되어 있는지 확인합니다. 각 시점에 대한 실행 자동 초점 루틴은 느린 초점 드리프트를 보정합니다. 만약 현미경 제어 소프트웨어에서 사용할&quot;하드웨어 자동 초점으로 지역의 표면 업데이트&quot;로 설정 자동 초점 전략. 선택한 스테이지 위치의 Z 좌표가 확인되면, 하드웨어 자동 초점을 활성화합니다. </li></ol></li><li> 현미경 제어 소프트웨어의 시간 경과 실험을 시작합니다. </li><li> 모든 단계의 위치가 나중에 지점에서 초점이 아직도 있는지 확인합니다. 자동 초점을 사용할 때 몇 시간에 걸쳐 실행 시간 경과 실험을 위해, 우리는 때때로 심지어 무대 드리프트를 관찰합니다. 스테이지 위치가 재 집중해야하는 경우, 적절한 시점에서 실험을 중지 포커스 조정 정의 묘화 시간 간격 (단계 3.7.3) 내에 실험을 재시작. 시계열을 연결하는 방법에 대한 단계 4.3를 참조하십시오. </li><li> 24-30 시간 후 이미지 수집을 중지 또는 관심의 영역에서 균사가 포자로 분화 한 경우 (DIC 이미지 시리즈 참조). 소프트웨어 흐름 프로그램을 중지하고 미세 유체 장치를 분해. </li><li> 단기 석재 중고 미세 유체 플레이트를 준비합니다격노. MYM-TE 나머지 제거하고 6도 1에서 MYM-TE를 보냈다 빈 폐기물도 7 및 멸균 조건에서 세포로드 웰 (8), 다시 채우기에 레인 &quot;A&quot;의 우물과 사용하지 않은 차선의 우물 ( &quot;B&quot;를 사용 멸균 인산 완충 식염수와 함께 접시에 &quot;D&quot;) (PBS). 4 ° C에서 출력 및 저장 건조되는 것을 방지하기 위해 파라 필름과 판을 밀봉합니다. </li></ol> 피지 소프트웨어를 사용하여 시간 경과 영화의 4 세대 참고 : 우리는 다른 상용 및 무료 소프트웨어 패키지가 ZenBlue, MetaMorph로부터, ICY, ImagePro 또는 ImageJ에 포함 시간 경과 현미경 이미지를 처리​​ 할 수​​ 있음을 유의하십시오. 여기에서 우리는 오픈 소스 영상 처리 ImageJ에 기반으로 프로그램 및있는 이미 유용한 사전 설치된 플러그인을 제공합니다이다 피지에 초점을 맞 춥니 다. <ol><li> 피지가 설치되어있는 컴퓨터로 시간 경과 실험에서 전송 영상 데이터입니다. </li><li> 프로그램을 실행 및 사용하여 이미지 파일을 가져옵니다# 34; 파일&gt; 가져 오기&gt; 바이오 형식 &quot;. 또는에서 단순히 피지로 이미지 파일을 드래그하여&quot;바이오 형식 가져 오기 옵션 각 조명 채널에 대한 별도의 이미지 스택을 얻기 위해 분할 채널 &quot;&quot;확인란을 선택 &quot;(DIC , RFP, YFP). </li><li> 옵션 : (DIC, RFP, YFP 각 채널에 의한 재 초점 (단계 3.9)에 이미지 수집에서의 휴식으로 인한 별도의 시계열을 병합 각각의 이미지 스택을 열고 실행 &quot;이미지&gt; 스택&gt; 도구&gt; 연결하여&quot;하려면 ). </li><li> 화상 스택 스크롤하여 저속 데이터의 품질을 평가한다. 시간이 지남에 초점에 머물렀다 균사, 쇼 균사 생장을 찾아 결국 포자 (DIC 스택)을 형성한다. 각각 식물 또는 sporogenic 균사 (YFP 스택)에 하나의 고리 또는 여러 사다리 형 구조를 형성 균사 끝을 DivIVA-mCherry (RFP 스택)과 FtsZ-YPet의 예상 세포 내 현지화를 검사합니다. </li><li> 다운 스트림 플라스틱 가공에 대한 관심의 영역을 분리이미지의 NG. 시간 경과 현미경은 종종 피지에 의해 처리 속도가 느려질 수 있습니다 큰 파일을 생성합니다. 이는 따라서 식별하고 ROI (region of interest)를 분리하고 화상 스택의 작은 버전이 상기 화상 처리 단계를 수행 할 것을 권장한다. <ol><li> 메뉴의 &quot;사각형 선택&quot;툴을 선택하고 현상 균사가 이미지 시리즈에 걸쳐 ROI 둘러싸인되는 방식으로 DIC 화상 스택 직사각형 ROI를 그린다. </li><li> &quot;Ctrl 키&quot;+ &quot;시프트&quot;+ &quot;D&quot;와 ROI 스택 중복. </li><li> YFP 이미지 스택의 이름 표시 줄을 클릭하고 &quot;편집&gt; 선택&gt; 선택 복원&quot;YFP 스택의 동일한 배치하기 위해서만 스택 원래 DIC부터 사각형 선택을 복원하고 &quot;Ctrl 키&quot;로 ROI를 복제하기 위해 메뉴에서 + &quot;시프트&quot;+ &quot;D&quot;. </li><li> RFP 스택에 대해이 과정을 반복합니다. </li></ol></li><li> 세 개의 이미지가 t 스택의 이미지를 맞 춥니 다오 시간이 지남에 xy 평면에서 무대 드리프트를 제거합니다. DIC 스택의 마지막 프레임에 스크롤 메뉴에서 &quot;플러그인&gt; 등록&gt; StackReg&gt; Ri​​gedBody&quot;를 선택합니다. RFP와 YFP 이미지 스택에 대해이 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 단계 4.5.1-4.5.3를 반복하여 투자 수익 (ROI)을 잘라. </li><li> 옵션 : &quot;&gt; 프로세스 대비 강화&quot; &quot;밝기 및 대비 도구를 조정&quot;( &quot;Ctrl 키&quot;+ &quot;시프트&quot;+ &quot;C&quot;) 또는 선택 각 이미지 스택 수동으로 밝기와 대비를 조정 메뉴에서하고 &quot;표준화&quot;를 적용 스택의 모든 이미지에 대한 명령. 이 후자의 명령 하류 화상 해석에 영향을 미칠 수 있으므로, 화소 값을 변경하고 것을 주목해야한다. </li><li> 옵션 : 가로 또는 세로로 &quot;이미지&gt; 스택&gt; 도구&gt; 겸용&quot;플러그인을 사용하여 (RGB 파일 형식으로 변환 4.11 참조) 개별 스택을 결합합니다. </li><li> (한 번 스탬퍼 ( &quot;&gt;&gt; 스케일 바 도구 분석&quot;) 규모 바 추가# 34; 이미지&gt; 스택&gt; 시간 스탬퍼 &quot;). </li><li> &quot;티파니&quot;형식의 이미지 시퀀스로 수정 된 이미지 스택을 저장합니다. 동영상을 제작하려면, &quot;아비&quot;로 저장합니다. 또한, &quot;바이오 형식&gt; 바이오 포맷 수출 &#39;플러그인하고&quot;.MOV &quot;파일 형식을 선택을 사용하여 QuickTime 포맷 수출 이미지 시리즈. </li><li> 하나의 프레임에서 사진을 얻으려면 + &quot;D&quot;관심있는 프레임을 선택하고 이미지 &quot;Ctrl 키&quot;+ &quot;시프트&quot;중복. &quot;이미지&gt; 유형&gt; RGB 색상 또는 8 비트&quot;의 결과 이​​미지에 &quot;RGB&quot;또는 &quot;8 비트&quot;의 유형을 변경하고 &quot;티파니&quot;로 이미지를 저장합니다. 참고 : 피지 추가로 더 주석을 기능이나 처리 시간 경과 시리즈의 번호를 제공합니다. 자세한 내용은 (http://fiji.sc/Fiji) 피지 온라인 지원으로 이동합니다. </li></ol>

<ol><li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li>
<li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.%3A+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li>
<li>McCormick, J. R., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li>
<li>Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li>
<li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ser%2FThr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li>
<li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li>
<li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li>
<li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li>
<li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li>
<li>Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li>
<li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423(2012).</li>
<li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li>
<li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li>
<li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+control+of+cell+division%3A+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li>
<li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li>
<li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma%28BldN%29+and+a+cognate+anti-sigma+factor%2C+RsbN%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li>
<li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554(2014).</li>
<li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+aerial+growth%2C+cell+division%2C+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li>
<li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li>
<li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299(2015).</li>
<li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li>
<li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li>
<li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078(2013).</li>
<li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li>
<li>Flärdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li>
<li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+%28TopA%29+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 수명주기의 시간 경과 현미경은 과거에 기술적으로 도전하고있다. 여기에서는 (도 2)를 시각화하고 개발 과정을 통해 진행을 추적 할 수 있도록 셀 극성 마커 DivIVA 및 세포 분열 단백질 FtsZ에 형광 단백질 융합체를 사용하여 전체 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징을 수행하기 위해 강력한 프로토콜을 제시한다. 이 방법의 핵심은 S.의 재배입니다 (MYM-TE을 보냈다) 소비 매체와 일정한 매체 관류 정상적인 성장 매체 (MYM-TE)의 교환을 할 수있는 미세 유체 장치에 venezuelae. 배양 조건의 변화는 영양이 풍부한 매체의 지속적인 공급이 식물 growt을 자극하는 반면, 포자 형성을 촉진하기 때문에 폐 배지에서 어떤 아직 알 수없는 세포 외 신호로 우물 (예 : 쿼럼 센싱 신호)로 영양 하향 변속 설명 프로토콜 중요하다거의 모든 포자 형성 시간 (데이터는 보이지 않음). 따라서,이 마이크로 유체 시스템의 세포를 배양하는 실험 더 유연성을 제공하며, 배양 조건의 변화에​​ 따라 변화 세균 성장​​을 장기간 모니터링을 허용하므로, 아가 로스에 세포를 배양 우수하다. 미세 플레이트를 하나의 사용을 위해 설계되지만 단지 이후 실험에 이용 될 수있는 셀을 접종하지 않은 채널을 흐른다. 우리는 긴 시간을 위하여 개방 된 판에 매니 폴드를 밀봉 문제를 경험으로 우리는 주일 이내에 미세 유체 플레이트의 모든 채널을 사용하는 것이 좋습니다. 실험 설정하면, 우리는 생식 관 (데이터 미도시) 출현 전에 냉동 글리세롤 스톡으로부터 유도 포자는 적어도 6 시간 필요한 반면, 새로 제조 된 포자가 유동 챔버로 로딩되는 두 시간 내에 발아하였습니다. 발아의 이러한 지연은 실험의 길이 연장을 방해 할장비의 가용성 및 실험 조건. 이 세균 튜브 개발 및 생장에 충분한 영양분을 제공하기 위해 적어도 3 시간 동안 MYM-TE의 재관류로 실험​​을 시작하는 것이 중요하다. 실험은 식물의 성장을 연구 설계된다면 MYM-TE와 관류 초기 3 시간 이상 확장 할 수있다. 포자 출발 물질 선호를 제공하는 반면, 짧은 균사 단편은 미세 플레이트에 장착 될 수있다. 그러나, 전단 균사체를 이용하여 적재 효율이 낮은 중요하다 종종 비 포자 돌연변이를 검사 할 때 제한을 제시 할 수있다 여러로드 실행이 필요합니다. 에 관계없이 사용 접종의 종류, 미디어의 확산을 방해하고 이미지 분석을 복잡하게 할 수 급속한 인구 과잉으로 이어질 것입니다이 같은 포자 또는 균사 조각과 문화 실에 과부하를하지 않는 것이 중요합니다. 이 기자 단백질의 구조를 계획하는 것이 중요합니다 carefu에서야 베드로 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)에서 형광 시간 경과 영상에 사용. 표적 단백질과 형광 리포터 및 N- 또는 C- 말단 융합체의 선택 사이의 링커의 길이는 매우 중요 할 수있다. 또한, 촬상 주파수 및 노출 시간을 포함하여 최적의 실험 조건은, 각각의 형광 표지 된 단백질을 미리 결정되어야한다. S.을 낮은 수준으로 발현되는 형광 표지 된 단백질을 이미징 할 때 문제가 될 수 있습니다 녹색 / 노란색 채널 venezuelae 균사 전시 자동 형광. 또한,이 발아 및 식물 성장의 초기 단계에서, S. 동안 주목해야한다 venezuelae 짧은 파장 광 (예 CFP로 융합 단백질을 사용하는 경우)에 특히 민감하다. 박테리아의 라이브 세포 이미징을위한 이미징 기술 및 형광 리포터 시스템의 연속 발전에도 불구하고, 소프트웨어 패키지의 대부분 (예 MicrobeTracker, Schnitzelc데이터 세트의 이러한 종류의 후속 처리를위한 자동 학습 학생, CellProfiler)는 다세포 라이프 스타일 27-29으로 사상균 유래의 영상 분석을 지원하지 않는다. 따라서, 스트렙토 다른 사상균로부터 촬상 데이터의 정량적 고 처리량 분석에 적합한 알고리즘을 개발하는 것이 필요하다. 요약하면, 여기에 설명 된 작업은 S.의 엄청난 잠재력을 보여줍니다 때문에 액체에 sporulate 할 수있는 능력의 속을위한 새로운 모델 개발 시스템으로 venezuelae. 미세 유체 배양 장치는 경험이없는 사용자도 사용하기 간단합니다. 그것은 동적 단백질 지역화, 편광 성장, 그리고 unigenomic 포자의 체인에 다세포 균사의 형태 분화를 포함하여 스트렙토 마이 라이프 사이클에 중앙 세포 생물학적 과정을 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 또한이 실험 유를 설정P은 또한 펩티도 글리 칸 합성 또는 프로피 듐 요오다 이드 및 4를 모니터링하는 형광 D 아미노 산 &#39;6 diamidino -2- 페닐 인돌 등의 배양 조건을 교대 필요한 개발 이벤트 또는 형광 염료의 사용을 조사 유혹 시작점을 제공 (DAPI)는 염색체 조직 (30, 31)를 시각화합니다.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes는 휴면, unigenomic 포자 1-3 다세포, 영양 청소 균사체에서 형태 적 분화를 포함하는 복합 개발 사이클을 특징으로 토양에 서식하는 박테리아입니다. 양호한 성장 조건 하에서 전형적인 스트렙토 포자는 하나 또는 두 개의 배아 튜브 (도 1)를 돌출시켜 발아하기 시작한다. 이 튜브는 팁 확장에 의해 신장과 식물 균사체로 알려진 분기 균사 네트워크로 성장. 폴라 성장과 균사 분기는 필수 단백질 DivIVA로 이동합니다. 이 꼬인 코일 단백질은 세포질 큰 복합체의 일부가 연장되는 선단 4-7에서 새로운 세포 외피 재의 삽입 중요 polarisome를 불린다. 식물 성장 동안, 균사 필라멘트 소위 크로스 벽 (8)의 형성에 의해 간헐적으로 구획화된다. 다시 이러한 가교 벽 형성<html> 첩 FtsZ, 대부분의 세균 9 세포 분열에 필수적인 튜 불린과 같은 세포 골격 단백질. 스트렙토 그러나 이러한 식물 간 벽 수축 및 세포 - 세포 분리를 유도하지 않고 따라서 균사 덩어리 상호 접속 포체 구획 네트워크로서 유지된다. 잘 이해되지 않는 영양소 제한 및 다른 신호에 응답하여, 전문 공중 균사는 식물 균사체에서 이탈 공기 3로 성장한다. 이러한 구조의 발기가 긴 멀티 게놈 공중 균사가 동일한 크기의 unigenomic prespore 구획 수십으로 나누어 그 동안 개발의 생식 단계를 시작합니다. 이 거대한 세포 분열 이벤트는 하나의 sporogenic 균사의 2,10 내에서 여러 FtsZ 반지의 동기 수축에 의해 구동된다. 형태 학적 분화는 휴면, 두꺼운 벽, 착색 포자의 방출에 의해 완성된다. t &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> 그림 1. 고체 배지에 스트렙토 라이프 사이클 이것은 S. 고전 연구에 기초하여 라이프 사이클 모델 한천 플레이트에 성장 coelicolor. 포자의 세포 발달 균사 분지 네트워크를 형성하도록 팁 확장 성장 하나 또는 두 생식 관의 형성으로 시작된다. 폴라 성장과 식물 균사의 분기는 DivIVA (빨간색)으로 이동합니다. 식물 교차 벽의 형성은 FtsZ (녹색)가 필요합니다. 영양 제한 및 다른 신호에 응답하여, 공중 균사가 건립된다. 공중 성장의 체포 단단히 상자 같은 prespore 구획에 sporogenic 균사를 구획 포자의 격막을 야기 할 FtsZ 링, 사다리의 조립과 조정됩니다. 이 구획은 두꺼운 포자 벽을 조립하고 결국 relea 있습니다성숙 색소 포자를 나오지. 스트렙토 라이프 사이클의 키 이벤트가 잘 발달 1,3- 특징으로한다. 그러나 아직 어떤 부족한 단백질 현지화 역학, 염색체의 움직임과 발달 제어 세포 분열로 차별화를 뒷받침 세포 내 프로세스에 대한 통찰력을 제공하기 위해 형광 시간 경과 현미경을 사용하는 세포 생물학적 연구이다. 스트렙토 개발의 라이브 세포 이미징 때문에 라이프 사이클의 복잡성과 유기체의 생리 학적 특성에 도전하고있다. 식물 성장 이전 연구 및 포자의 격막의 초기 단계에서는 산소 투과성 촬상 챔버 또는 현미경 단계 11-15에서 스트렙토 coelicolor의 아가 성장을 지원 채용했다. 이러한 방법은 그러나, 여러 가지 요인에 의해 제한된다. 일부 시스템은 세포 성장의 단기 촬상 허용세포 전에 D 형광 단백질은 산소 공급 부족으로 고생하거나 인해 균사 개발의 3 차원 패턴에 초점면에서 성장한다. 장기 이미징 세포 대체 성장 또는 응력 조건에 노출하고, 아가로 오스 패드의 매체로부터 배경 형광이 심각 강한 형광을 모니터링하는 능력을 제한 할 수 없기 때문에 아가 패드 한계 실험 유연성에 세포를 배양하는 것이 가능하다 경우 신호. 여기에서 우리는 우수한 정밀도와 감도 완전한 스트렙토 마이 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명합니다. 위드 형광 현미경 (도 2)에 접속 된 마이크로 유체 장치 스트렙토을 성장시킴으로써, 우리는 지금까지 30 시간의 기간 동안 발아, 식물의 성장과 포자의 격막을 모니터링 할 수있다. 이것은 크게 새로운 모델 생물의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 사용에 의해 촉진된다 </EM&gt; venezuelae 그것은 침수 문화에 거의 완성 단계에 sporulates하여 클래식 모델 종 S.의 한계를 극복 할 수 있기 때문에 고체 배지 16 ~ 20에만 sporulates coelicolor. 식물의 성장과 포자 형성을 시각화하기 위해, 우리는 공동 명시 형광 셀 극성 마커 DivIVA와 키 세포 분열 단백질 FtsZ 버전의 태그. 우리는 성공적 마이코 박테리아, 대장균, 코리 네 박테 리움 글루 타미 쿰, 고초균, 효모 및 21-25에 이용 된 상업적으로 이용 가능한 미세 유동 장치를 이용하고있다. 시스템은 단일 초점 평면 셀 트랩 상이한 저장조로부터 배지 연속 관류의 제어를 허용한다. 상세한 프로토콜에서는 S. 노출이 기능을 활용할 포자 형성을 촉진하는 영양 하향 변속에 식물 균사체를 venezuelae. 프로토콜 드스크라이브 전체 스트렙토 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징을위한,하지만, 특정 발달 단계가 특히 관심이 있다면 다른 미디어 환경이나 현미경 설정이 선택 될 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> 그림 2 : 회로도 실험적인 작업 흐름을 묘사. 프로토콜에서 설명하는 세 가지 주요 단계가 표시됩니다. 첫째, 포자 및 소비 매체는 고정 상 문화에서 제조된다. 둘째, 새로운 포자 마이크로 유체 시스템 및 S.로로드 venezuelae는 발달주기가 최적 성장 온도를 유지하기 위해 배양 챔버 전자동 도립 현미경을 사용하여 전체에 결상된다. 셋째, 얻어진 시간 경과 시리즈 분석 및 오픈 소스 소프트웨어 피지를 사용하여 처리됩니다.

<table><tbody><tr><td>B04A 박테리아 세포용 CellAsic ONIX 플레이트</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>미세유체 배양 플레이트</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX 미세유체 관류 시스템 및 ONIX FG(버전 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>최신 ONIX 버전(2015년 7월) 및 프로그램 사용 방법에 대한 지침은</td></tr><tr><td>http://www.merckmillipore.com Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td>에서 확인할 수 있습니다<td>.431007-9902-000</td><td>완전 자동화 및 전동 반전 광시야 현미경</td></tr><tr><td>인큐베이터 XL multi S1 온도 모듈 S1 및 가열 장치 XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>현미경을 둘러싼 환경 챔버</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>FL 필터 세트 46 HE YFP 시프트 프리</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>형광 필터 세트, 여기 500/25 nm, 방출 535/30 nm</td></tr><tr><td>FL 필터 세트 63 HE RFP 시프트 프리</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>형광 필터 세트, 여기 572/25 nm, 방출 629/30 nm</td></tr><tr><td>멀티웰용 마운팅 프레임 K-M 플레이트</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>미세유체 플레이트용 스테이지 홀더</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>현미경 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>ZEN 모듈 타임랩스</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>타임랩스 현미경 실험을 설정하기 위한 소프트웨어 모듈</td></tr><tr><td>ZEN 모듈 타일/위치</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>특정 스테이지 위치를 저장하는 소프트웨어 모듈 (엑스지)</td></tr><tr><td>피지</td><td>오픈 소스 소프트웨어 패키지</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td>시간 촬영 영화 생성</td></tr><tr><td>Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 4 g Maltose 4 g Yeast extract 10 g Malt extract 50 % 수돗물과 50 % 역삼투수를 사용하여 1 L H2O를 추가하고 100 당 200 ml의 R2 미량 원소 용액을 보충합니다. 고압멸균</td><td></td><td></td> 후 ml <td>배양에 사용되는 포자 형성 배지 S. venezuelae SV60</td></tr><tr><td>R2 미량 원소 용액(TE) 8 mg ZnCl2 40 mg FeCl3-6H2O 2 mg CuCl2-2H2O 2 mg MnCl2-4H2O 2 mg Na2B4O7-10H2O 2 mg ( NH4)6Mo7O24-4H2O 200ml H2O 오토클레이브를 추가하고 4 oC</td><td></td><td></td>에 저장 <td>0.002 볼륨 추가 MYM</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>단기 보관을 위해 플레이트를 준비하기 위해 B04A 플레이트에서 사용하지 않는 레인의 입구 웰을 다시 채우는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>0.22 & 마이크로; m 주사기 필터</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>사용한 MYM-TE</td></tr><tr><td>SV60</td><td>John Innes Centre 균주 수집</td><td></td><td>S. venezuelae divIVA-mcherry 및 ftsZ-ypet</td></tr></tbody></table>

전체의 형광 시간 경과 영상<em&gt; s. venezuelae</em미세 유체 장치를 사용&gt; 수명주기

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

단일 세포 수준에서 생물학적 과정에 대한 라이브 셀 이미징은 박테리아 세포의 세포 내 조직에 대한 현재 이해에 중요한 역할을 했습니다. 그러나 포자성 사상균인 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 발달을 뒷받침하는 세포 생물학적 과정을 연구하기 위한 타임 랩스 현미경의 적용은 기술적인 어려움으로 인해 방해를 받았습니다. 
여기에서 우리는 도립 형광 광시야 현미경에 연결된 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 새로운 모델 종인 Streptomyces venezuelae를 성장시켜 이러한 한계를 극복하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 고전적인 모델 종인 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)와 달리 S. venezuelae는 액체에서 포자화하여 미세유체 성장실을 적용하여 장기간에 걸쳐 S. venezuelae의 세포 발달 및 분화를 배양하고 현미경으로 모니터링할 수 있습니다. 형태학적 변화를 모니터링하는 것 외에도 형광 표지된 표적 단백질의 시공간 분포를 타임 랩스 현미경으로 시각화할 수도 있습니다. 더욱, microfluidic 플랫폼은 microfluidic 약실에 있는 S. venezuelae의 포자 형성을 자극하기 위하여 상세한 의정서에서 이용되는 배양 매체를 교환할 수 있는 실험적인 융통성을 제안합니다. 전체 베네수엘라 생애주기의 이미지는 특정 간격으로 획득되고 오픈 소스 소프트웨어 피지에서 처리되어 기록된 시계열의 동영상을 제작합니다.

전체 S.의 성공적인 라이브 세포 이미징 venezuelae 라이프 사이클 발아, 식물의 성장과 포자 형성 (도 3, 영화 1)의 주요 발달 단계를 포함하는 연속 시계열을 산출한다. 수명주기를 통해 진행의 시각화는 더 DivIVA-mCherry 및 FtsZ-YPet의 별개의 세포 내 지역화에 의해 강화된다. 발아 및 식물 성장하는 동안, DivIVA-mCherry 독점적으로 성장 균사 조언, 새로 분기점을 (그림 4A)을 형성 마크에 축적한다. 이러한 결과는 DivIVA 12,26의 이전에보고 된 세포 내 위치와 일치한다. 반대로 FtsZ-YPet은 균사 성장 (도 4b)에 불규칙한 간격으로 단일 고리 형 구조를 형성한다. 이러한 구조는 interconn의 형성으로 이어지는 비 협착 식물 간 벽의 합성 지지체를 제공반사된다 균사 구획 8. sporogenic 균사로 균사 성장의 세포 분화가 극성 DivIVA-mCherry의 초점의 실종에 의해 표시되고, 극성 성장의 체포와 FtsZ-YPet 형광의 동반 증가 (그림 4C). 균사를 포자에서 FtsZ - YPet의 현지화 패턴이 크게 변화; 제 1 나선형 FtsZ-YPet 필라멘트는 균사 함께 공중제비 다음, 갑자기, 거의 동기 이벤트에서,이 나선 정기적 간격 FtsZ-YPet 반지의 사다리로 합체. 여기에 설명 된 실험 조건 하에서, 이들 고르게 분포 FtsZ-YPet 사다리 약 2 시간 동안 유지. 마지막으로, 포자의 격막은 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 (그림 4D) 결국 새로운 포자가 출시에 식별됩니다. 로 제공 피지 소프트웨어를 사용하여 화상 처리를 설명 후속 프로토콜<html> TEP 단계별 획득 시간 경과 시리즈 (동영상 1)에서 게시를 위해 동영상을 제작하는 방법을 설명합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> 그림 3 : S.의 대표 시간 경과 형광 현미경 시리즈에서 스냅 샷 이미지 venezuelae 생산 형광 표지 FtsZ (녹색) 및 DivIVA (적색) 병합 된 이미지의 선택된 프레임이 보이고있는 바와 같다 (상단 패널 : RFP-YFP-DIC, 하단 패널 : DIC). 발아, 식물의 성장과 포자를 포함하여 스트렙토 마이 세스 라이프 사이클을 시각화. 이미지가 영화 1 시간에서 찍은이 시간에 : 분. 스케일 바 = 5 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> D / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4 : 스트렙토 마이 라이프 사이클의 성공적인 시간 경과 시리즈의 대표 결과 DivIVA-mCherry의 (A) 버전.. RFP 및 DIC 채널의 병합 된 이미지와 함께 영화 1에서 두 개의 연속적인 시간 지점의 스냅 샷을 보이고있는 바와 같다. DivIVA-mCherry 새로운 균사 분기 사이트 (채워진 화살표 머리)를 표시하고 극성 성장 (오픈 화살표 머리)를 지시하는 균사의 끝에 지역화. 스케일 바 = 10 식물 성장 (화살표 머리) 동안 μm의 (B) FtsZ-YPet 현지화. FtsZ-YPet은 (DIC, 낮은 패널)을 수축하지 않는 하나의 고리 형 구조 (상판)를 형성한다. 포자의 격막시 (C) FtsZ-YPet (녹색) 지역화. (: 분 시간) DivIVA-mCherry의 초점은 아래에 묘사 된 경과 시간, 빨간색으로 표시됩니다. 스케일 바 : 5 μm의. (C)에서 포자의 균사의 DIC 이미지를 대응 (D) 양식을 보여주는결국 포자의 체인 (오른쪽 이미지)로 성숙 볼 수 포자 격막 (왼쪽 이미지)와 prespore 구획의 ATION. 시간은 시간에 : 분. 스케일 바 = 5 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1 프레임" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> 영화 1 : 라이프 사이클 venezuelae 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)의 시간 경과 형광 현미경 시리즈 영화가 병합 된 RFP-YFP 이미지 (왼쪽)와 해당 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 (오른쪽)으로 구성되어 있습니다.. DivIVA-mCherry 녹색에서 빨간색과 FtsZ - YPet에 표시됩니다. 단일 프레임 사이의 시간 간격은 40 분이다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">생을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>의 영화.

스트렙토마이세스는 세포의 생물학적 수단으로 연구하기 실험적으로 어려운 복잡한 생명 주기를 특징으로 합니다. 여기에서는 미세유체 장치에서 스트렙토마이세스 베네수엘라(Streptomyces venezuelae)를 성장시켜 전체 수명 주기의 형광 저속 현미경을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

전체의 형광 시간 경과 영상<em&gt; S. venezuelae</em미세 유체 장치를 사용&gt; 수명주기

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

본 형광 타임랩스 현미경 관찰 프로토콜의 전반적인 목표는 포자 형성 사상균인 Streptomyces venezuelae의 발달 및 세포 분화의 기초가 되는 생물학적 세포 과정을 연구하는 방법을 제공하는 것입니다. 설명된 방법은 역동적인 단백질 국소화, 극성 성장 및 포자 형성 격벽 생성을 포함하여 Streptomyces 생애 주기의 핵심이 되는 세포 생물학적 과정을 연구할 수 있는 우수한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 Streptomyces venezuelae가 액체 상태에서 포자를 형성한다는 것이며, 이를 통해 미세유체 장치에서 세포를 배양하고 전체 생애 주기를 현미경으로 모니터링할 수 있습니다.이 방법은 다중 중심 균사체가 포자 사슬로 분화하는 과정을 살아있는 세포 영상화(live cell imaging)를 통해 관찰할 수 있게 함으로써, Streptomyces venezuelae가 해당 속의 새로운 발달 시스템으로서 가진 막대한 잠재력을 보여줍니다. 우선, 보충된 성장 배지 30 milliliters에 영상화할 S.venezuela 균주의 포자 10 microliters를 접종하십시오. 세포의 일관된 성장과 포자 형성을 위해, 충분한 통기가 가능하도록 배플 플라스크(baffled flask) 또는 스프링이 포함된 플라스크를 사용하십시오.세포를 30°C, 250 RPM 조건에서 35~40시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 액상 탑재 위상차 현미경을 통해 균사 조각과 포자를 확인할 수 있어야 합니다. 배양액 1 mL를 탁상 원심분리기에서 400 ×g로 1분간 원심분리하여 균사와 큰 세포 조각들을 펠렛화합니다.그 다음 포자 현탁액이 포함된 상청액 약 300 microliters를 새로운 1.5 millimeter 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 둡니다. 남은 배양액은 다음 단계에서 사용할 수 있도록 보관합니다. 이어서 보충된 성장 배지에서 포자를 1:20으로 희석하고, 필요한 시점까지 희석된 포자를 얼음 위에 보관합니다.남은 배양액을 50-milliliter 비커에 붓고, 주사기로 10-milliliter를 취한 뒤 멸균된 22-micrometer 주사기 필터를 사용하여 남은 배양액을 여과 멸균합니다. 이는 포자와 균사 파편이 제거된 보충 성분이 포함된 소모 배지를 얻기 위함입니다. 유사한 성장 조건의 추가 실험이 예정되어 있다면, 여과된 보충 성분 포함 소모 배지를 4-degrees-celsius에서 며칠 동안 보관하십시오.각 미세유체 플레이트는 최대 4개의 독립적인 실험에 사용할 수 있습니다. 사용하지 않는 유동 챔버의 오염을 방지하기 위해, 실험을 준비할 때 멸균 용액과 멸균 작업 환경을 사용하십시오. 먼저 미세유체 플레이트에서 운송 용액을 제거하는 것으로 시작합니다.그런 다음 멸균된 보충 성장 배지로 웰을 헹굽니다. 헹굼이 끝나면 1번 웰의 입구에 보충 성장 배지 300 µL를 넣고, 2번에서 6번 웰까지는 사용한 보충 성장 배지 300 µL를 넣습니다. 다음으로 희석된 포자 40 µL를 A레인의 8번 웰에 로딩하고, 제조사의 지침에 따라 플레이트에 매니폴드를 밀봉합니다.미세유체 제어 소프트웨어를 실행하고 적절한 플레이트 유형을 선택합니다. 유로와 배양 챔버를 프라이밍하기 위해, 1번부터 5번까지의 유입 웰에서 배지가 웰당 2분 동안 6 psi의 압력으로 흐르도록 유량 프로그램을 설정합니다. 그 후, 보충된 성장 배지가 1번 유입 웰로 6시간 동안 6 psi의 압력으로 흐르도록 설정합니다.이를 통해 발아와 영양 성장이 이루어지게 합니다. 6시간 후에 프로그램이 보충제가 첨가된 사용 완료 성장 배지로 전환되어, 실험의 남은 기간 동안 6 psi의 압력으로 2번부터 5번 웰까지 흐르도록 설정하십시오. 환경 챔버를 미리 30 °C로 예열해 두십시오.그런 다음 현미경과 현미경 제어 소프트웨어를 켭니다. 고개구수 오일 침강 대물렌즈를 장착하고, 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지와 황색 형광 및 적색 형광 단백질 융합 이미지를 획득하는 데 적절한 필터와 다이어프램 미러가 설정되어 있는지 확인합니다. 대물렌즈와 미세유체 플레이트의 이미징 윈도우 바닥면에 침강유 한 방울을 떨어뜨립니다.밀봉된 미세유체 장치를 도립 현미경의 스테이지 위에 조심스럽게 장착하고 고정합니다. 내장된 위치 마커를 사용하여 미세유체 배양 챔버의 이미징 창의 초점을 맞춥니다. A라고 표시된 첫 번째 흐름 챔버의 가장 왼쪽 부분에 초점을 맞춘 다음, 트랩 높이가 7 micrometers인 트랩 크기 5 위치로 스테이지를 이동합니다.미세유체 소프트웨어에서 시스템 설정 시, 8번 입구 웰로부터 4 psi의 압력으로 15초 동안 세포를 로드하도록 설정합니다. 프로세스가 실행되면 스테이지를 이미징 창 너머로 이동시켜 배양 챔버 내의 세포 밀도를 확인합니다. 포자가 포집되지 않은 경우, 세포 로딩 단계를 반복하거나, 이미징 창당 1~10개의 포자라는 원하는 세포 밀도가 달성될 때까지 로딩 압력 및/또는 시간을 늘립니다.배양 챔버에 과부하가 걸리지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 제어 소프트웨어에서 이전에 준비한 유량 프로그램을 시작하고, 이미지 획득을 시작하기 전 현미경 스테이지에서 미세유체 플레이트가 1시간 동안 열 평형 상태에 도달하도록 하십시오. 현미경 제어 소프트웨어에서, 먼저 이미지 파일의 자동 저장을 위한 디렉토리를 지정한 후, 시간에 따라 여러 스테이지 위치에서 여러 이미지를 촬영하도록 다차원 획득 설정을 구성하십시오.다음으로, 조명 설정으로 이동하여 각 특정 컨스트럭트에 대해 미리 결정된 최적의 조명 설정을 입력합니다. 그런 다음 24시간 동안 40분마다 이미지를 획득하도록 타임 시리즈를 설정합니다. 스테이지 위치를 결정하고 오토포커스를 설정하기 위해, 배양 챔버를 스캔하고 관심 있는 각 이미징 위치에 대한 스테이지 위치를 저장합니다.광퇴색 및 광독성을 최소화할 수 있도록 단일 스테이지 위치 간의 간격을 충분히 띄워 설정하십시오. 선택한 스테이지 위치의 Z 좌표가 확인되면 하드웨어 오토포커스를 활성화하십시오. 그 다음 현미경 제어 소프트웨어에서 타임랩스 실험을 시작하십시오.24~30시간 후, 또는 관심 영역의 균사가 포자로 분화되었을 때 이미지 획득을 중단하십시오. 그런 다음 소프트웨어에서 흐름 프로그램을 중지하고 미세유체 장치를 분해하십시오. 입구 웰, 폐액 웰 및 세포 로딩 웰에서 남아 있는 배지를 모두 제거하여 사용한 미세유체 플레이트를 단기 보관용으로 준비하십시오.그런 다음 A레인의 사용한 웰과 사용하지 않은 레인의 웰을 멸균 PBS로 채웁니다. 마지막으로, 플레이트가 마르는 것을 방지하기 위해 파라필름으로 밀봉합니다. 그리고 플레이트를 4°C에서 보관합니다.S.venezuela 생애 주기 전체의 성공적인 살아있는 세포 이미징을 통해 발아, 영양 성장 및 포자 형성이라는 주요 발달 단계를 포함한 연속적인 시계열 데이터를 얻을 수 있습니다. 발아 또는 영양 성장 단계 동안, DivIVA-mCherry는 성장하는 균사 끝부분에만 선택적으로 축적되거나 새로 형성되는 균사 분지점을 표시합니다. 이와 대조적으로, FtsZ-YPet은 성장하는 균사체 내에서 불규칙한 간격으로 단일 고리 모양 구조를 형성합니다.이러한 구조들은 비구성적 영양격벽(nonconstructive vegetative cross walls) 합성을 위한 지지체 역할을 하여 서로 연결된 균사 구획의 형성을 유도합니다. 포자를 형성하는 균사에서 FtsZ-YPet의 국소화 패턴은 급격하게 변화합니다. 먼저, 나선형의 FtsZ-YPet 필라멘트들이 균사를 따라 굴러가며 이동하고, 이후 거의 동시에 일어나는 급격한 사건을 통해 이러한 나선들이 일정한 간격의 FtsZ-YPet 링 형태의 사다리 구조로 통합됩니다.마지막으로, 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지에서 포자 형성 격벽이 식별 가능해지며, 최종적으로 새로운 포자가 방출됩니다. 이 기술은 Streptomyces의 전체 생애 주기에 대한 살아있는 세포 이미징을 수행할 수 있는 강력한 프로토콜을 제공합니다. 이 미세유체 시스템은 사용법이 간편합니다.이 실험 구성은 실험적 유연성을 제공하며 장기간의 모니터링을 가능하게 합니다. 또한, 변화하는 배양 조건에 반응하는 특정 발달 사건을 조사하거나, 형광 염료를 사용하여 펩티도글리칸 합성을 모니터링하거나 염색체 조직을 시각화하는 연구를 시작하기에 매우 적합한 기초를 제공합니다.

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를...

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

간단한 마이크로 유체 장치는 마취 무료를 수행하기 위해...

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

출처: Schlimpert, S. et al. 미세유체 장치를 사용한 전체 S. 베네수엘라의 수명주기의 형광 타임랩스 이미징. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 미세유체 장치를 사용하여 박테리아 Streptomyces venezuelae 의 전체 수명 주기에 대한 형광 타임랩스 이미징을 통해 발아, 균사 성장 및 포자 형성을 실시간으로 시각화합니다.

Streptomyces venezuelae 수명주기의 형광 타임랩스 이미징

출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 피질 뉴런의 엑소 사이크 이벤트를 시각화하기 위한 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 보여줍니다. pH에 민감한 녹색 형광 단백질(GFP) 마커는 소포 융합 시 형광을 발하며, 선택적 TIRF 여기는 타임랩스 이미징에서 막-근위 엑소사이토시스를 포착합니다.

엑소 세포 사건의 시각화를 위한 전반사 형광 현미경 

이 프로토콜의 목적은 기공 복합체의 세포 피질에, GFP - 태그 PATROL1, 막 인신 매매 단백질의 점을 점멸 표시 가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면에 형광 표지 된 단백질의 역학을 모니터링하는 방법을 설명하는 것입니다 애기 장대.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

여기에 제시된 것은 아가로즈 패드 및 세포 화상 진찰 접시와 함께 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 약탈적인 박테리아 Bdellovibrio bacteriovorus의 완전한 수명 주기의 감시를 기술하는 프로토콜입니다.

시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 세균 육식 동물 Bdellovibrio 박테리오보루스의 라이프 사이클의 라이브 세포 이미징

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

학습하세요 형광 시간 경과 현미경법을 이용하여 Streptomyces venezuelae의 전체 수명주기를 실시간 관찰하는 방법을. 미세유체 장치를 활용한 이 기술은 세포 분화와 포자 형성 과정을 연구하는 데 탁월한 플랫폼을 제공합니다.

전체의 형광 시간 경과 영상

더 많은 동영상 탐색