전체의 형광 시간 경과 영상 S. venezuelae 수명주기

이 형광 타임 랩스 현미경 프로토콜의 전반적인 목표는 포자 형성 사상 박테리아인 스트렙토마이세스 베네수엘라(Streptomyces venezuelae)의 발달 및 세포 분화를 뒷받침하는 생물학적 세포 과정을 연구하는 방법을 제공하는 것입니다. describe 방법은 동적 단백질 국소화, 편광 성장 및 포자 격막 등 스트렙토마이세스 수명 주기의 핵심인 세포 생물학적 과정을 연구할 수 있는 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 스트렙토마이세스 베네수엘라(Streptomyces venezuelae)가 액체에서 포자화한다는 것인데, 이를 통해 미세유체 장치에서 세포를 성장시키고 전체 수명 주기를 현미경으로 모니터링할 수 있습니다.

이 방법은 다기관 균사체를 포자 사슬로 분화하는 살아있는 세포를 이미징할 수 있기 때문에 속의 새로운 발달 시스템으로서 Streptomyces venezuelae의 엄청난 잠재력을 보여줍니다. 먼저, 30ml의 보충 성장 배지에 S.venezuela 균주의 포자 10마이크로리터를 접종하여 이미징합니다. 세포의 지속적인 성장과 포자 형성을 위해 배플 플라스크 또는 스프링이 포함된 플라스크를 사용하여 충분한 통기를 허용합니다.

섭씨 30도 및 250RPM에서 35-40시간 동안 세포를 배양합니다. 준비가 되면 액체에 장착된 위상차 현미경을 통해 균사체 조각과 포자를 볼 수 있어야 합니다. 배양액 1ml를 탁상용 원심분리기에서 400배 G로 1분 동안 원심분리하여 균사체와 더 큰 세포 조각을 펠릿화합니다.

그런 다음 포자의 현탁액을 포함하는 약 300마이크로리터의 상등액을 새로운 1.5mm 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 이후 단계에서 사용할 수 있도록 나머지 배양 배지를 보관합니다. 다음으로, 포자를 보충된 성장 배지에 1에서 20까지 희석하고 필요할 때까지 희석된 포자를 얼음 위에 보관합니다.

남은 배양액을 50ml 비커에 붓고 주사기로 10ml를 추출하고 멸균 22μm 주사기 필터를 사용하여 남은 배양액을 여과 살균합니다. 포자와 균사 조각이 없는 소모된 보충된 성장 배지를 얻기 위해. 유사한 성장 조건을 사용하여 추가 실험을 수행해야 하는 경우 여과된 보충 성장 배지를 섭씨 4도에서 며칠 동안 유지하십시오.

각 미세유체 플레이트는 최대 4개의 독립적인 실험에 사용할 수 있습니다. 사용하지 않는 유동 챔버의 오염을 방지하려면 실험을 설정할 때 멸균 용액과 작업 조건을 사용해야 합니다. 미세유체 플레이트에서 선적 용액을 제거하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 멸균 보충 성장 배지로 우물을 헹굽니다. 헹구면 300마이크로리터의 보충된 성장 배지를 웰 1의 입구에 추가하고 300마이크로리터의 사용된 보충 성장 배지를 웰 2에서 6까지의 웰에 추가합니다. 다음으로, 40마이크로리터의 희석된 포자를 레인 A의 웰 8에 로드하고 제조업체의 지침에 따라 매니폴드를 플레이트에 밀봉합니다.

미세유체역학의 제어 소프트웨어를 실행하고 적절한 플레이트 유형을 선택합니다. 유동 채널과 배양 챔버를 프라이밍하기 위해 유동 채널과 배양 챔버를 프라이밍하기 위해 유입구 웰 1에서 5까지 6psi에서 6psi까지 매체를 흐르도록 흐름 프로그램을 설정합니다. 그런 다음 6psi에서 보충된 성장 배지를 6시간 동안 입구 우물 1로 흐르게 합니다.

이것은 발아와 식물 성장이 일어날 수 있도록 합니다. 6시간 후에 프로그램을 사용한 보충 성장 배지로 전환하고 나머지 실험 동안 6psi에서 2-5개의 우물로 흐르게 합니다. 환경 챔버를 미리 섭씨 30도로 예열하십시오.

그런 다음 현미경과 현미경 제어 소프트웨어를 켭니다. 높은 개구수 오일 이멀젼 대물렌즈를 배치하고 황색 형광 및 적색 형광 단백질 융합 이미지와 함께 미분 간섭 대비 이미지를 획득하도록 설정된 적절한 필터와 다이어그램 거울이 제자리에 있는지 확인합니다. 이멀젼 오일 한 방울을 대물렌즈와 미세유체 플레이트의 이미징 창 바닥에도 놓습니다.

밀봉된 미세유체 장치를 도립 현미경의 스테이지에 조심스럽게 장착하고 제자리에 고정합니다. 내장된 위치 마커를 사용하여 미세유체 배양 챔버의 이미징 창에 초점을 맞춥니다. A라고 표시된 첫 번째 플로우 챔버의 가장 왼쪽 부분에 초점을 맞춘 다음 스테이지를 트랩 높이 7마이크로미터에 해당하는 트랩 크기 5로 이동합니다.

미세유체 소프트웨어에서 15초 동안 4psi에서 8개의 입구 웰에서 셀을 로드하도록 시스템을 설정합니다. 프로세스가 실행된 후 이미징 창을 가로질러 스테이지를 이동하여 배양 챔버의 세포 밀도를 확인합니다. 포자가 갇히지 않은 경우 세포 로딩 단계를 반복하거나 이미징 창당 1-10개의 포자라는 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 로딩 압력 및/또는 시간을 증가시킵니다.

배양실에 과부하가 걸리지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 제어 소프트웨어에서 이전에 준비된 흐름 프로그램을 시작하고 이미지 획득을 시작하기 전에 현미경 단계에서 미세유체 플레이트가 1시간 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 현미경 제어 소프트웨어에서 먼저 이미지 파일의 자동 저장을 위한 디렉토리를 지정하여 시간이 지남에 따라 여러 스테이지 위치에서 여러 이미지를 촬영하도록 다차원 획득을 설정합니다.

그런 다음 조명 설정으로 이동하여 각 특정 구성에 대해 미리 결정된 최적의 조명 설정을 입력합니다. 그런 다음 24시간 동안 40분마다 이미지를 획득하도록 시계열을 설정합니다. 스테이지 위치를 결정하고 자동 초점을 설정하려면 배양실을 스캔하고 관심 있는 각 이미징 위치에 대한 스테이지 위치를 저장하십시오.

단일 단계 위치가 광 표백 및 광 독성을 최소화할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어져 있는지 확인하십시오. 선택한 스테이지 위치의 Z 좌표가 확인되면 하드웨어 자동 초점을 활성화합니다. 그런 다음 현미경 제어 소프트웨어에서 타임랩스 실험을 시작합니다.

24-30시간 후 또는 관심 영역의 균사가 포자로 분화되면 이미지 획득을 중지합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 흐름 프로그램을 중지하고 미세 유체 장치를 분해합니다. Inlet well, waste well 및 cell loading well에서 남아 있는 매체를 제거하여 단기 보관을 위해 사용한 미세유체 플레이트를 준비합니다.

그런 다음 A 레인의 사용한 우물과 사용하지 않는 차선의 우물을 멸균 PBS로 채웁니다. 마지막으로 접시가 마르지 않도록 배 필름으로 밀봉합니다. 그리고 접시는 섭씨 4도에서 보관하십시오.

전체 S.venezuela 수명 주기의 성공적인 라이브 셀 이미징은 발아, 식물 성장 및 포자 형성의 주요 발달 단계를 포함한 연속적인 시계열을 생성합니다. 발아 또는 식물 성장 동안 DivIVA-mCherry는 성장하는 최면 팁에 독점적으로 축적되거나 새로 형성되는 균사 분기 지점을 표시합니다. 대조적으로, FtsZ-YPet은 성장하는 균사체에서 불규칙한 간격으로 단일 고리 구조를 형성합니다.

이러한 구조는 비건설적인 식물 교차벽의 합성을 위한 발판을 제공하여 상호 연결된 균사 구획의 형성으로 이어집니다. 포자 균사에서 FtsZ-YPet의 국소화 패턴은 극적으로 변화합니다. 먼저 나선 FtsZ-YPet 필라멘트가 균사를 따라 굴러가고, 그 다음에는 갑작스럽고 거의 동기화된 사건에서 이 나선이 규칙적인 간격의 FtsZ-YPet 고리의 사다리로 합쳐집니다.

마지막으로, 포자 형성 격막은 미분 간섭 대비 이미지에서 식별할 수 있게 되고 결국 새로운 포자가 방출됩니다. 이 기술은 전체 스트렙토마이세스 수명 주기의 라이브 셀 이미징을 수행할 수 있는 강력한 프로토콜을 제공합니다. 미세유체 시스템은 사용하기 쉽습니다.

이는 실험적 유연성을 제공하며 장기간 모니터링을 가능하게 합니다.이 실험 설정은 또한 변화하는 문화적 조건 또는 펩티도글리칸 합성을 모니터링하거나 염색체 조직을 시각화하기 위해 형광 염료의 사용에 대응하여 특정 발달 이벤트를 조사하기 위한 훌륭한 출발점을 제공합니다.