Name: 치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한 비켜에서 마이크로 전기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 배우세요 수정된 in ovo 마이크로 전기영동법을 사용하여 닭 청각 기관에서 유전자 조작을 수행하는 방법을. 이 기술은 청각 전구세포의 증식과 분화를 연구하는 데 효과적입니다.

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우리는 발현 플라스미드과 현장 프로브 박사 도리스 K. 우 감사, 감각 생물 이미징 시설의 존스 홉킨스 대학 센터와 청력과 균형을위한 센터. 이 작품은 LE에 NIDCD 부여 T32 DC000023에 의해 지원되었다

계란과 깐 배아는 마음에 든다고 윤리적 및 인도적으로 처리됩니다. 깐 배아 사용에 대한 모든 프로토콜은 의학, 볼티모어, 메릴랜드의 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 계란과 식 구조의 제조 <ol><li> 달걀 : <ol><li> 3 품어 - 4 다스 수정 된 닭고기 달걀 (갈 루스 갈 루스) 37 ° C에서 자신의 양쪽에 평평하게 누워. <ol><li> 배양 24 시간 후, 계란의 라운드 백 엔드에서 주사기와 알부민의 3 CC를 당겨 명확한 테이프로 구멍을 밀봉. 이 계란 (19)의 상단에 액세스를 위해 창을 절단 할 때 쉘을 고집 배아없이 배아에 대한 접근의 용이성을 허용, 배아와 껍질 사이에 공기 실을 만듭니다. </li><li> 배양 시간의 117 시간에서 햄버거와 해밀턴 (20) 발달 단계에 따라 배아를 무대E4 (HH24-25)에서 (그림 1D 참조). </li></ol></li></ol></li><li> 식 구축 : <ol><li> 시약을 사용하여 플라스미드 DNA와 시판 제제 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜을 준비한다. 제제의 최종 단계에서, 500 ㎕의 TE (트리스 EDTA) 1.5 ㎖의 튜브에 키트에 제공된 버퍼에 DNA를 용출시킨다. </li><li> 에탄올을 3 M 아세트산 나트륨 50 μL 튜브 100 % 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 농축하는 DNA를 침전. -20 ° CO / N에서 튜브를 놓습니다. </li><li> 4 ℃에서 14,000 rpm으로 30 분 동안 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 실온에서 10 분 동안 펠렛을 공기 건조. ~ 4 μg의 / μL의 농도를 산출한다 15 ㎕의 TE 버퍼에 펠렛을 용해. 참고 : 여기에 사용되는 제어 식 구조는 닭 β - 액틴 프로모터에 의해 구동된다 pMES-IRES-GFP (10), 또는 PCI-H2B-IRES-RFP 있습니다 <sCMV 프로모터에 의해 구동된다&gt; (10), 최대. </li></ol></li></ol> 비켜 마이크로 전기에와 비켜 세포 증식 분석 2. 닭 <ol><li> 발현 구조체 및 마이크로 일렉트로 비켜 마이크로 인젝션 조작에있어서 : <ol><li> 2.5 X 2.5 mm 상자 플래티넘 난방 필라멘트에 대해 다음과 최적화 된 매개 변수를 사용하여 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 바늘로 유리 모세관 튜브를 당겨 : 압력 = 500, 열 = 600 ° C, 속도 = (105), 및 시간 = 64 당겨 = 150 밀리 초 (표 1 참조). </li><li> 왼쪽 및 현미경을 측면 오른 손잡이 마이크로 매니퓰레이터 단계는 설정 (그림 1A 참조). 오른쪽 손잡이 마이크로 매니퓰레이터는 유리 모세관 바늘과 왼손 마이크로 매니퓰레이터는 전극 (그림 1A)를 보유하고를 보유하고있다. </li><li> 절단에 의해 미세 주입을위한 미세 뽑아 유리 모세관 바늘을 준비겸자와 바늘의 끝은 현미경으로 작업하는 동안. </li><li> 현미경으로 작업하는 동안 0.1 % 빠른 그린으로 색을 칠한 플라스미드 DNA의 2.5 μL와 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 손으로 직접 바늘을 입력합니다. </li><li> (그림 1A 참조) 금형 / 계란 유지 장치 내 옆에 누워 계란을 놓습니다. 가위 19 (그림 1A)를 사용하여 계란의 상단에 둥근 창을 잘라. </li><li> 현미경으로 작업하는 동안주의 깊게 집게를 사용하여 배아를 오버레이 두 막을 엽니 다. </li><li> 현미경에서 작업하는 동안, 수동으로 미세 조작기를 사용하여 마이크로 일렉트로 오른손을 사용하여 마이크로 인젝션에 의해 오른쪽 귀 소포 루멘 플라스미드 DNA의 약 0.5 ~ μl를 제공한다. <ol><li> 동시에 왼손 머무르고 사용시 그래서 우측의 마이크로 매니퓰레이터 (도 1b-D)과 DNA와 오른쪽 귀 소포 루멘 마이크로 - 주입 수행태아의 머리가 단계 E4에서 딥 때문에 조지아 forcep는 배아의 머리를 안정합니다. 이 귀의 소포가 손상 될 수 있기 때문에, 귀의 소포 루멘 과거 마이크로 주입하지 마십시오. </li><li> 바로 마이크로 주사 후, 현미경으로 작업하는 동안, 양극 (양극) 백금 전극의 전방-복부 오른쪽 귀의 소포 및 병렬 부정적인 2mm 전극 (음극)에 2mm를 배치 왼쪽 미세 조작기를 사용 1mm 간격 (도 1 C 참조). 100 밀리 초 지속 시간 200 밀리 초 간격으로 12 V에서 4 펄스를 제공합니다. 왼쪽 귀의 소포는 내부 처리되지 않은 제어 역할을합니다. 참고 : 1X PBS에 담근 면봉 electroporations 사이에 전극을 청소합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 비켜 세포 증식 분석에서 : <ol><li> 즉시 전기 후 수동으로 전체에 50 μl의 에듀 솔루션을 놓아 0.25 밀리그램의 50 μl를 추가 / ㎖ EDU 1X PBS에서피펫을 사용하여 OVO의 배아. 테이프로 계란을 밀봉하고 18 일 동안 인큐베이터로 돌아 - 96 시간. </li><li> ( &#39;그림 1 EE 참조) 표준 형광 현미경을 사용하여 24 시간 - 조심스럽게 테이프를 제거하고 18 후 귀의 소포 내에서 형광 GFP 또는 RFP 신호의 배아를 확인합니다. 형광 시그널이있는 경우 ( &#39;FP도 1 참조),이 시점에서 분석을 위해 수확하거나 배아 테이프 봉인 및 수집 동안 인큐베이터로 돌아가서 이후 단계에서 분석한다. 참고 : - 7 시간 전기 10 후 pMES-IRES-GFP 구조와 GFP 신호의 발현은 6 분명하다. </li></ol></li></ol> 현장 하이브리드 및 면역 조직에서 RNA 3. 배아 수확 및 조직 처리 <ol><li> 집게를 사용하여 배아를 수확. 차가운 1X PBS에서 배아를 씻어. 목으로 머리를 절단하여, 배아의 머리를 제거4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 O / N로 머리를 집게를 사용하고 배치합니다. 헤드 내부의 4 % 파라 포름 알데히드의 침투를 허용하는 forcep을 이용하여 뇌에 구멍. </li><li> 4 ° C에서 O / N (1X PBS)에 30 % 자당의 머리를 탈수. </li><li> 드라이 아이스와 메틸 부탄 (2- 메틸 부탄)의 슬러리에 급속 냉동하여 cryoprotective 매체의 헤드를 탑재합니다. 대안 적으로, 신속한 액체 질소 cryoprotective 매체에 헤드를 고정. -80 ° C에 탑재 된 헤드를 저장합니다. </li><li> 12 μm의 두께 조직 섹션에 머리를 동결 절단 (Cryosections) 및 superfrosted 현미경 유리 슬라이드 위에 모든 내이 함유 조직 섹션을 수집합니다. </li><li> 이전 4,21 바와 같이 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 화학의 표준 RNA를 수행하고, 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜은 다음 듀 세포 증식 분석. 주 : 머리 셀의 토끼 폴리 클로 날 사용하여 식별 될 수-α를 MyosinVIIa (Myo7a)을tibody (1 : 1000, 프로테우스 Biosciences 사)과 형광 표지 된 이차 항체 (1 : 250, 염소 항 - 토끼 AlexaFluor 488; 인비 트 로젠). </li></ol> 4. 이미지 캡처 및 처리 <ol><li> 디지털 이미징 장비와 이미지를 가져 가라. 표준 형광 현미경 (배의 배율 40 배까지) 표준 와이드 필드 현미경을 사용하여 현장에서의 결과와 이미지 면역 조직 화학 염색 결과. </li><li> 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리​​. </li></ol>

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오보 마이크로 일렉트로에서의 여기에 설명 된 방법은 현상 청각 기관으로의 유전자 전달에 대해 최적화되어있다. 그것은 일반적으로 유전자 기능 / 발현을 조작하는 데 사용되는 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 호환된다. E4에서 전기의 타이밍은 청각 기관에서는 HC 개발에 집중 조사에 적합하다. 가장 중요한 단계는 바늘 너무 깊이 가서 귀의 소포를 손상시키지 않고 귀의 소포 루멘에 DNA를 미세 주입하는 귀의 소포의 앞쪽-복부 도메인에 의해으로 DNA를 대상으로, (그림. 1A-D 참조) 구체적 추정 청각 타겟팅 - (4- μg의 / μL ~ 3.5) 이에 따라 전극을 배치하는이 전기 매개 변수를 최적화 된 플라스미드 DNA의 농도를 최적화 12 V.에서 4 펄스의 최적화 된 전기 매개 변수 전달 (.도 1C를 참조), E4에서 기관. 처음에 우리가 시작 오유타은 형광 신호를 산출하지 6 V에서 electroporations을 실시. 전압...

포유류 및 조류 청각 감각 기관 사이의 형태 차이 및 세포 패턴에도 불구하고, 분자 요인과 감각 HC의 개발을 담당 경로는 진화 1-3 보존 될 것으로 생각된다. 청각의 HC와 그 주변으로 SC를 수용하는 기저 유두는, 내부 귀 otocyst의 outpocketing으로 개발하고 있습니다. 초기 HC 및 SC 조상의 풀은 귀의 placode / 귀 컵 신경 감각 능력 도메인 (NSD) 내에서 지정됩니다. 운명 매핑 데이터는 신경 및 감각 계통이 연결과 귀 컵의 안테 - 복부 지역에 위치한 나 마우스와 치킨 4,5에 otocyst NSD에서 발생된다는 증거를 제공. 먼저 neuroblasts 결국 청각 및 전정 신경으로 분할 청각-전정 신경절의 뉴런을 야기 할 NSD로부터 박리. 이 신경은 뇌간에있는 내이 및 핵의 감각의 HC를 신경을 분포시키다. 세포 일NSD에 남아있는 열 변환 - 기계 감각의 HC 및 연관된으로 SC 구성된 청각의 감각 기관을 포함하는 다양한 관능 패치를 야기 할 것으로 생각된다. 병아리와 쥐 모두에서, 청각 기관의 감각 전구 세포주기 출구와 HC 차별화 그라디언트 반대에서 발생합니다. 병아리 청각 전구 세포주기 종료 ~ E5 주위 시작 기저부로부터 꼭지점까지 진행하고, 중심으로부터 외주 6. 어느 날 이후, HC 차별화가 정점에서 시작베이스 (7)에 진행한다. 작용 메커니즘이 복잡한 수술을 필요로 다른 모델 시스템에서의 자궁에 배아 조작 반대로 오보에서 비교적 용이하게 조사 할 수 있기 때문에 닭 내이의 개발 공부 많은 기술적 장점을 제공한다. 여기에 설명 된 방법은 추정 basila에 대한 관심의 유전자를 대상으로 비켜 마이크로 전기에 사용특히 E4에 귀의 소포의 연구 유두 영역 전방 - 복부. OVO의 전기가 잘 설립하고 일반적으로 8-14를 사용하는 기술이다. 일렉트로 기술의 원리는 뉴클레오티드 (예를 들면, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드) 음으로 하전된다는 사실에 기초한다. 한 DNA는 관심있는 조직으로 주입된다. 전류는 조직을 통해 배치 될 때, 전류는 셀 벽에서 과도 모공을 열어 상기 음으로 하전 된 DNA는 양극 (애노드)을 향하여 흐를 때 상기 DNA의 흡수를 허용한다. 이득의 기능 실험을 위해, 관심의 유전자는 일반적으로 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)에 적합한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드에 서브 클로닝된다. 손실의 기능 실험 플라스미드 기반의 지배적 인 부정적인 리프레 구조, 또는 RNAi의, 또는 모르 폴리 노의 구조를 들어 C는ommonly는 15, 16을 사용했다. 플라스미드 계 전형적 마이크로 RNA (miRNA의) 기능의 miRNAs 스폰지 구조를 억제하기 위해 17 사용될 수있다. 오보 마이크로 전기 천공 방법에서의 용이 전체 배아 듀를 추가 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있는 여기에 기술 된 방법은 청각 기관의 증식 및 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 조사 할 수있다. 일렉트로과 에두의 추가는 어느 날 청각 기관의 세포주기 출구의 시작 앞에있는 귀의 소포에 E4에서 수행됩니다. 일반적으로 18 수행되는 청각 기관의 분석 - (HC 분화시) E5 (감각 전구 세포주기 출구의 시작), E6 (HC 차별화의 시작)와 E7에서 전기 후 96 시간을; 이상 ~ E9 (HC 차별화 끝)까지. 유전자 전달이 전기 천공 방법은 ~ 4 일 정도 지속 일시적인 becauSE는 관심 유전자가 게놈 내로 통합되지 않지만, 상기 방법은 TOL2 매개 유전자 전달 (11)의 게놈 내로 통합하는 능력이 있는가 적절한 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 함께 사용하기 위해 적용 가능하다. 이 방법 강력한 GFP 또는 RFP 발현 지속 ~로 신호를 가리 페이드, 아직 청각 기관의 복잡한 현상을 연구하기 위해 충분한 시간 창을 제공 한 후, 달팽이관 4 일. 비켜 유전자 전달 방법이 소설 특히 청각 기관에 HC 개발에 초점 조사에 최적입니다 E4에서 추정 청각 기관을 대상으로 할 수 있습니다. 훨씬 이하의 개발 단계 (11, 12) 또는 기저 관내 유두 이식편 배양 물 (18)의 사용에 비해 electroporate 다른 방법에 좋은 재료이다.

<table><tbody><tr><td>멸균 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린 FCF 파우더</td><td>시그마</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU 파우더</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 이미징 키트</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&nbsp;</td><td>BTX 하버드 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>바나나-마이크로그래버 케이블 키트</td><td>BTX 하버드 장치</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>오른손잡이 & 왼손잡이용 마이크로매니퓰레이터</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M3301R 및 M3301L</td><td></td></tr><tr><td>7인치 수직 포스트가 있는 두 개의 12mm 자기 홀딩 장치 스테이지</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>메탈 스틸 베이스 플레이트 12x24인치</td><td>월드 프리시전 Instruments Inc.&nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>계란 용 가위 12cm 길이 곡선, 12mm 극세 칼날; 스프링 가위</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>바늘을 당기기 위한 마이크로 피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5mm 박스 플래티넘 가열 필라멘트</td><td>셔터 기기 Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 / 바늘 / 섬유 없음 / Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 유리 주사기 100 &mu; l</td><td>Hamilton</td><td>80601 모델 710LT</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일(중) 해밀턴 유리 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>유리 주사기 및 유리 캡필러리 바늘 연결용 폴리에틸렌 튜브/무독성</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427420 Intramedic Clay Adams 브랜드</td><td></td></tr><tr><td>3cc 일회용 주사기</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>일회용 21 게이지 바늘</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2mm 백금 전극 한 쌍</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>Dumont fine yplocks number 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td> 한 쌍</tr>계란 <tr><td>밀봉</td><td>을 위한 무광택 마감 투명 테이프Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

닭 배아 유전자 기능의 조작은 오보에서 비교적 용이하게 수행 될 수있는 배아 발달 공부 이상적인 모델 시스템이다. 내이의 청각 감각 기관들을 수있는 우리의 능력 중요합니다. 그것은 지원 세포 (희주) 아교와 같은 고도로 전문화 된 감각 HCS () - 기계 열 변환 유모 세포로 구성되어 상피와 주변 주택. 청각 기관의 구조적인 차이에도 불구하고, 청각 기관의 발달을 조절하는 분자 메커니즘이 진화 포유 동물과 AVES 사이에 보존되어 비켜 전기에서 E1의 초기 단계에 크게 제한된다 -. E3. 때문에 E5의 청각 기관의 상대적으로 늦게 개발, E3 과거 비켜 전기에 의한 청각 기관의 조작으로 인해 나중 단계에서 닭 배아의 고급 개발에 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 관심 유전자를 타겟팅하는 일시적 유전자 전달 방법단계 E4 - 비켜 마이크로 전기의를 통해 개발 치킨 청각 감각 기관에 E4.5. 이 방법은 이득 - 및 상실 함수 종래의 플라스미드 DNA 계 발현 벡터를 적용하고 상기 전체 배아 EDU (5-에 티닐 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘)을 첨가하여 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있다 전기의 시간입니다. 녹색 또는 적색 형광 단백질 (GFP 또는 RFP) 발현 플라스미드의 사용은 실험 신속 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 판단 할 수있다. 이 방법 논문에서는 GFP 전기 천공 표본의 대표적인 예는 예시; 전기 후 96 시간과 청각 기관의 프로 감각 영역에 GFP의 대상은 현장 하이브리드의 RNA에 의해 확인되었다 - 배아는 18을 수확했다. 이 방법은 종이 셀 prolif를 분석 듀 아날로그 티미 딘의 사용을 위해 최적화 된 프로토콜을 제공한다eration; 면역 라벨링을 결합 듀 화학을 클릭했을 듀 계 세포 증식 분석의 예를 제공한다.

녹색 형광 단백질로 구성된이 방법 종이 플라스미드 DNA에서 (GFP) 발현 카세트는 ~를 산출, 12 V 4 100 밀리 초 펄스 폭과 펄스와 200 밀리 초 간격의 최적화 된 매개 변수를 사용하여 개발 치킨 기저 돌기 (BP)에 대상이되었다 50 % 태아 생존율 및 BP에 타겟팅 플라스미드 DNA의 효율. (; 흰색 화살표 그림 1 EE &#39;)와 GFP 발현 시간 걸쳐 올 수 있습니다 배아를 개발 기본 GFP 발현의 형광 이미징은 전기의이 방법은 우선적으로 BP에 상승을 제공하는 otocyst의 앞쪽-복부 측면을 대상으로했다 약 ~ 4 일까지 (그림 1 EH). 계내 혼성화 (ISH)에서 RNA는 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 결정하는 데 사용되었다. GFP는 청각에 의해 찍은 여부를 확인하려면감각 선조는 ISH 실험 BP 인접 부에서 수행 하였다. ...

청각 기관은 청각을 중재합니다. 여기에서는 발달 중인 닭 청각 기관에서 청각 전구 세포 증식 및 분화를 연구하기 위해 최적화된 수정된 in ovo micro-electroporation 방법을 제시합니다.

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

이 방법의 전반적인 목표는 배아 4일째부터 발달 중인 닭의 청각 기관에서 유전자 조작을 수행하는 것입니다. 이는 닭 배아의 진행된 발달 단계에서 작업하는 것이 어렵다는 점 때문에 매우 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 복잡한 자궁 내 수술이 필요한 다른 기술들에 비해 상대적으로 용이하게 난내(in ovo)에서 발달 중인 청각 기관을 특이적으로 표적으로 삼을 수 있다는 점입니다.이 방법은 청각 감각 발달의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 감각 전구세포 증식과 유전적 분화의 공간적 및 시간적 패턴이 어떻게 조정되는지가 포함됩니다. 이 절차를 시작하려면 우측 마이크로매니퓰레이터에 배치된 유리 시린지와 연결된 튜브를 사용하여 유리 모세관 바늘을 부착하고, 좌측 마이크로매니퓰레이터에 전극을 배치하십시오.현미경 하에서 핀셋을 사용하여 바늘 끝을 자릅니다. 다음으로, 0.1% fast green으로 염색된 plasma DNA 2.5 µL를 디쉬에 넣습니다. 우측 마이크로매니퓰레이터에 연결된 시린지 플런저를 사용하여 바늘에 plasma DNA를 채웁니다.홀딩 장치에 달걀을 옆으로 눕혀 놓습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 달걀 윗부분에 둥근 창을 냅니다. 그 후, 현미경 아래의 홀딩 장치에 달걀을 배치합니다.포셉을 사용하여 배아를 덮고 있는 두 개의 막을 조심스럽게 열어 오른쪽 이낭(otic vesicle)을 노출시킵니다. 왼손의 포셉으로 배아의 머리를 고정한 상태에서, 오른손의 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 약 0.5 µL의 플라스마 DNA를 주입합니다. 이낭 내강을 지나쳐 주입하면 이낭이 손상될 수 있으므로 주의하십시오.이소포낭에 손상을 주지 않고 이소포낭 내강에 DNA를 미세주입하는 것은 매우 중요하며, 이를 위해서는 양손을 모두 사용해야 합니다. 미세주입 직후, 왼손 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 2mm 백금 양극 및 음극 전극 세트를 오른쪽 이소포낭의 전복측에 배치하고, 전기천공기를 작동시켜 12V에서 4회 펄스를 가합니다. 전극을 전복측의 추정 청각기관 영역에 정확하게 배치하는 것이 중요하며, 이를 통해 발달 중인 청각기관을 정확히 타겟팅할 수 있습니다.전기천공법 직후, 배아 전체에 50 µL의 EdU를 in ovo로 첨가합니다. 그다음, 테이프로 달걀을 밀봉합니다. 조작 및 밀봉이 완료된 모든 달걀을 배양기에 넣고 18~96시간 동안 배양합니다.18~24시간 후에 테이프를 조심스럽게 제거합니다. 표준 형광 현미경을 사용하여 이낭(otic vesicle) 내에 형광 GFP 또는 RFP 신호가 있는지 배아를 확인합니다. 형광 신호가 나타나면 분석을 위해 배아를 수확하거나, 테이프로 다시 밀봉하여 인큐베이터로 옮겨 추후 단계에서 수확 및 분석을 진행합니다.발달 중인 내이의 청각 부위가 전기천공법으로 성공적으로 타겟팅되었는지 확인하기 위해 RNA 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)을 수행하였다. 발달 중인 BP 내에서, 감각 전구세포는 Sox2 및 Lunatic Fringe의 발현을 통해 식별되었다. 이 이미지들은 기저부와 정점부 전체의 발달 중인 BP에 있는 감각 전구세포들이 성공적으로 타겟팅되었으며, 전기천공법 수행 68시간 후에 GFP를 발현했음을 보여준다.또한, GFP는 비감각 상피 세포와 Neurod1 발현으로 표시된 청신경절의 감각 영역 외부에서 발현되었습니다. 감각 전구세포의 증식 행동을 결정하기 위해, 배아 4일째(E4) 전기천공 시에 티미딘 유사체인 EdU를 첨가하였으며, 4일 후 조직 절편에서 발달 중인 BP의 EdU 통합 여부를 분석하였습니다. 발달 중인 BP에서 분화 중인 유모세포를 식별하기 위해 유모세포 특이적 단백질인 Myosin7a에 대한 면역염색을 수행하였습니다. BP의 정단부에서는 Myo7a 양성 유모세포가 EdU 양성인 경우가 빈번했습니다.기저부에서는 Myo7a 양성 유모세포 중 극소수만이 EdU를 통합했으며, 이는 E4 시점에 EdU를 첨가했을 때 기저부의 감각 전구세포들이 이미 대부분 분열 후 상태(postmitotic)임을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 알 하나당 5분에서 8분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 배아의 생존을 보장하기 위해 갓 조제한 멸균 시약을 사용하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 전정 기관의 발달 및 내이 신경 발생과 같이 발달 중인 내이의 다른 현상을 연구하기 위해 방법 매개변수를 수정할 수 있습니다. 이 기술은 내이 분야의 연구자들이 배아 4일 이후부터 상대적으로 늦게 발달하는 닭의 청각 기관을 구체적으로 연구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 닭 배아를 적절하게 다루는 방법, 미세주입 및 전기천공법 수행 방법, 그리고 in ovo 세포 증식 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다.  또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.

In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부

배우세요 수정된 in ovo 마이크로 전기영동법을 사용하여 닭 청각 기관에서 유전자 조작을 수행하는 방법을. 이 기술은 청각 전구세포의 증식과 분화를 연구하는 데 효과적입니다.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한

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