Name: 혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 VEGF 계열 리간드의 활성을 정량적으로 평가하는 간단한 세포 기반 생물 검정법입니다. 키메라 수용체를 활용하여 혈관생물학 및 암 연구에 활용할 수 있습니다.

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SAS와 MGA는 프로젝트 그랜트, 호주 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council of Australia, NHMRC)의 프로그램 그랜트 및 연구 펠로우십, 그리고 호주 빅토리아 주정부가 제공하는 운영 인프라 지원 프로그램(Operational Infrastructure Support Program)의 자금으로 지원됩니다. MMH는 Peter MacCallum Foundation Grant의 지원을 받고 있습니다.

IL-3의 제조의 소스 WEHI-3D​​ 에어컨 중간 주 : 마우스 과립 구성 백혈병 세포주 WEHI-3D​​는 IL-3을 함유하는 합성 배지를 생성하기 위해 배양한다. <ol><li> 둘 베코 변형 이글 배지에서 배양 WEHI-3D​​ (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 긴 수명 글루타민 보충제, 50 μg의가 / ㎖ 젠타 마이신. T175의 cm 3 조직 배양 플라스크에서 신선한 배지 50 ㎖로 성장 로그 단계에서 5 × 106 세포를 접종하고 약 7 일 동안 성장 또는 세포를 약 24으로 성장 그 로그 상을 통과 할 때까지 - 48 시간 (문화 과도한 세포 사멸을 방지). 500 mL를 한번에 제조 할 수있다 - (200)의 배치가되도록 조정 배지는 -20 ° C에서 여러 해 동안 저장 될 수있다. </li><li> 15 분은 세포와 세포 파편을 제거하기 위해 1,000 × g으로 플라스크와 스핀에서 유체 및 세포를 가만히 따르다. supern의 최고 90 %를 제거atant. 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 필터링합니다. </li><li> 1 ml를 50 mL 및 -20 ° C에서 저장을위한 200 ml의 볼륨 또는 -70 ° C ~로 나누어지는 WEHI-3D​​ 에어컨 매체 (CM). 작은 분취 량의 장기 저장을위한 분석 준비 인자 의존적 세포주의 통과를위한 배양 배지를 제조하기위한 중간 볼륨 큰 볼륨에 유용하다. IL-3는 무균 조건 하에서 사용하는 경우 너무 해동 매체가 몇 주 동안 저장 될 수있다 4 ° C에서 상대적으로 안정적이다. </li><li> 대안 적으로, 0.22 μm의 필터 유닛을 통해 여과 된 후 배지로 희석하여 50 ng를 / ㎖의 농도로 재조합 마우스 IL-3를 사용한다. </li></ol> VEGFR-2-EPOR - 바 / F3 및 제어 바 / F3 셀 라인 2. 문화 및 평가 <ol><li> DMEM에서 배양 바 제어 / F3 세포를 10 % FBS, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신 또는 페니실린 / 스트렙토 마이신을 보충, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 안정화. 세포로부터 3 일에 대한 1시 15분 희석에서 통과 세포로그 상에 성장합니다. </li><li> DMEM에서 배양-VEGFR2 EPOR-BA / F3 세포를 10 % FBS가를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 1 % L- 글루타민 및 10 %의 WEHI-CM-3D 및 1 ㎎ / ㎖의 G418을 안정화. 로그 상에 성장하는 세포에서 1시 15분 희석에 통로 세포. 키메라 수용체의 구조와 표현에 대한 자세한 내용은 24를 참조하십시오. </li><li> 중앙 로그 상 문화에서 수확 제어 바 / F3 또는 VEGFR2-EPOR - 바 / F3 세포. 천천히 플라스크의 바닥으로부터 이들 비 - 부착 세포를 제거하기 위해 피펫. 매체 IL-3를 함유 제거 (세포 펠렛을 회수하기 위해 5 분 동안 750 x g에서 10 ㎖, 원심 분리), 마우스 긴장성 인산 완충 식염수, pH가 7.3 (PBS)으로 세 번 세척 하였다. </li><li> 10,000 세포 당 후 세척 상기 WEHI-3D-CM 또는 재조합 IL-3없이 회 DMEM 및 첨가제와 함께 세포, 및 7.4 × 104 세포 / ㎖ (즉, 13.5 μL 당 1000 세포의 농도로이 배지에 재현 탁 혈구를 사용하여 계산에 의해 결정된 135 μL)에 대한각각 분석의 반 정량적 또는 정량 버전에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 트리 판 블루 제외 (주의)에 의해 생존을위한 세포를 평가합니다. 세포 집단으로 1 혈구 100 셀들의 최소 개수 : PBS (0.4 %) (1)에 트리 판 블루를 섞는다. 염료을 차지 세포가 죽었거나 죽어 간주됩니다. 98 % 이상의 생존율 분석을 수행 할 필요가있다. </li></ol> 3. 반 정량 분석 <ol><li> RT에서 72 웰 마이크로 웰 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 매체의 13.5 μL에 포함 된 세척 세포 (1,000 세포)를 추가합니다. 중력 바이어스 세포 농도를하지 않습니다에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의하십시오. 잘 보정 P20 자동 피펫 및 멸균 팁을 사용합니다. </li><li> 교정 P20 피펫 또는, 바람직하게는, P2 피펫을 사용하여 (물론 1,000 세포를 포함하는 15 μL의 최종 볼륨을, 1.5 μL) 10 % 볼륨 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 캘리포니아를 타고재는 샘플의 pH, 소금 및 기타 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인합니다. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예를 들면, DMEM 또는 PBS, 각각) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 같은 팁 분쇄 혼합 보장합니다. </li><li> 대조 시료를 들어, (ⅰ) 보통 단독으로 함유 더 포함 IL-3,하지 (ⅱ) WEHI-3BD CM-10 %의 최종 부피에서 단독 배지에 첨가; 및 / 또는 (ⅲ) VEGF-A에는 IL-3를 함유하지 않는 단독 배지에서 100ng의 / ㎖로 희석 하였다. </li><li> 멸균, PBS 또는 매체와 마이크로 웰 플레이트의 사용하지 않는 우물을 채우고 수 있도록 가스 교환 (물 티슈 페이퍼 젖과) 가습 컨테이너 내에서 접시를 놓습니다. 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 컨테이너 내에 세포를 인큐베이션. 테스트 샘플 및 미디어 구성 요소를 사용할 수있는 경우이 분석은 편안하게 한 사람이 3 시간에 설정할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 16 시간 후 번호판을 평가배양이되는 포지티브 및 네거티브 샘플 사이의 시간 차별은 분명하다. 세포 배양에 표시하는 방법의 예 그림 3을 참조하십시오. 100 × 배율 - 40 표준 역 위상차 현미경을 사용하여 번호판을 분석합니다. 참고 : 웰스 둥근 반투명 표시 셀을 포함 이러한 IL-3 또는 VEGF-A로지지 성장 인자를 포함. 지지 성장 인자없이 또는 배지 단독 웰 둥근 세포뿐만 아니라 죽었거나 죽어가는 세포 및 세포 찌꺼기 (예컨대,도 3c)의 수를 감소한다. 24 ~ 48 시간 게시물 배양에서 분석 평가하는 것은 감도 최적입니다. </li></ol> 4. 양적 생물 검정 <ol><li> RT에서 표준 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 IL-3 결핍 배지에서 세정 균체 (135 μL 10,000 세포)를 추가한다. 가전​​ 영향을주지 않습니다 중력에 의해 세포 안정을 보장하기 위해 aliquotting 동안 세포 현탁액을 혼합주의LL 농도. </li><li> 10 % 볼륨 (15 μL) 보정 피펫 (P20)를 사용에서 우물에 테스트 샘플 및 컨트롤을 추가합니다. 샘플의 pH, 소금 또는 다른 세포 증식 억제 / 잠재적으로 세포 독성 물질의 관점에서 바 / F3 세포의 배양 조건과 호환되는지 확인하기 위해주의하십시오. 가능한 경우, 호환 매체를 사용하거나 버퍼 (예., DMEM 또는 PBS) 또는 중간 또는 버퍼에 희석. 필터는 0.22 ㎛의 세공 셀룰로오스 아세테이트 원심 관 필터 유닛을 이용하여 소량 살균. </li><li> 48 시간 동안 10 % CO 2의 가습 된 분위기에서 세포 성장 인자 및 / 또는 억제제 제의 혼합물을 인큐베이션. 물에 적신 휴지를 가지고 있으며, 가스 교환을 할 수있는 가습 컨테이너 내에서 분석을 수행합니다. 잘 내 생존 세포 수의 대용 마커 배양 기간의 종료에서, 이는 아래에 나열된 다른 방법 중 하나를 사용하여 분석 평가이다. </li><li> 대안 1 : 3 H-thymidi북동 설립 참고 :이 정량은 96 웰 플레이트 형식을 위해 설계되었습니다. <ol><li> 37 ° C (웰 당 150 ㎕의 부피)에서 48 시간 동안 분석 플레이트를 배양 한 후 (IL-3 / WEHI-3D ​​CM없이 학사 / F3 배지) 분석 배지 50 ㎕의 부피로 3 H 티미 딘을 추가 웰 당 1 μCi를 최종 투여 20 μCi를주고 잘 / ml의 농도로 당. </li><li> 셀 수확기를 사용하여 세포를 수확하기 전에 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 접시를 품어. 섬광에 필터를 배치하여 각각의 샘플을 추출하여 액체 섬광 계수기로 정량화. </li></ol></li><li> 대안 # 2 : 셀룰러 ATP의 생물 발광 검출 주 :이 방법은 집단의 생존 세포를 반영하는 생물 발광 신호를 생성 할 수있는 세포 용 해물과 결합 된 ATP 모니터링 시약을 사용한다. <ol><li> 를 Lyse 세포 ATP를 추출하고, 생성하는 ATP 모니터링 시약을 사용제조업체의 지시에 따라, 발광 신호를 출력한다. 96 웰 플레이트 형식과 호환 루미를 사용하여 발광을 읽어보십시오. </li></ol></li><li> 대안 3 : 실행 가능한 세포에 의한 표시 염료의 효소 감소 참고 : 레사 주린 기반 분석은 세포 생존에 좋은 상관 관계를 보여줍니다. <ol><li> 레사 주린 계 염료로 배양 된 세포를 결합하고 제조자의 지시에 따른 형광 플레이트 판독기를 사용하여 분석을 정량화. </li></ol></li></ol>

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</ol>

스티븐 A. 스태커 및 마크 M. Achen은 일주기 기술 (주), 성장 인자의 VEGF 가족을 대상으로 치료제를 개발하는 회사의 주주입니다.

여기에 설명 된 분석은 성장 인자에 의존 높은 생존 세포를 사용하는 방법에 의존한다. 세포는 따라서 그들이 인자 의존 확인하고 키메라 수용체의 발현을 유지하기 위해주의 깊게 배양 할 필요가있다. 매체가 갓과 지나치게 긴 기간 동안 및 WEHI-3D​​ CM이 중요 매우 활성화되어 저장되지 않도록. 세포를 완전히 구출 리간드에 세포를 노출 할 때 잔류 IL-3 분석을 오염되지 않도록 상기 분석 배지에 IL-3 포함 매체로부터 세정 될 필요가있다. 리간드는 상이한 형태의 숫자에 올 수있는 바와 같이, 케어 시금 이러한 제조 할 때 수행되어야한다. 방부제, 항균제, 소금 또는 다른 산도의 버퍼 분석에 영향을 미칠 수 있고, 형질 감염되지 않은 바 / F3 세포의 병렬 테스트 버퍼 관련 문제에 대해 알릴 수 있습니다 이유입니다. 우리는 모두에게 반 정량 및 정량 프로토콜을 사용합니다. 반 quantitati적이 분석은 이전 시간과 샘플을 요구하는 완전히 정량 분석​​에 투입, 샘플의...

분비 된 단백질 성장 인자 및 그들의 동족 세포 표면 수용체의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리는 가용성 리간드 및 막을 매립 수용체 세포막을 가로 질러 신호를 형질 도입에 각각 해당 기능에 중요하고 다양한 기이다. 이들은 내피 세포뿐만 아니라 상피 기원의 세포 및 면역계의 1,2-들에서 주로 기능한다. 자주 임상 사용을 목표로 리간드 활성화 VEGF 수용체 (VEGFRs) 연령 관련 황반 변성 및 암과 같은 주요 병리, 중요하고, 치료제에 의해 결합 신호 전달 경로입니다 (예를 들어, VEGF-A를 대상으로하는 단일 클론 항체 베바 시주 맙) 3,4. VEGF를 가족의 복잡성 중 하나는 자연에 존재하는 수용성 리간드 (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D는 parapox 바이러스 가족 ORF와 뱀의 독 VEGF,과 기타에 의해 인코딩 VEGF 단백질의 다양성입니다 금지의VEGF-A) (2)의 이성체. 이러한 리간드 즉 수용체 티로신 키나제 군의 3 명, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 상호 작용. 이 수용체는 가변적으로 다른 세포 유형에 표현하지만 종종 모든 규모 5의 혈액과 림프 혈관을 줄 내피 세포의 표면에 공동으로 표현된다. VEGFR-2는 포유류가 VEGF-A 6, VEGF-C (7)와 VEGF-D 8,9뿐만 아니라 ORF 바이러스 VEGF (10)와 뱀의 독 VEGF (11) 리간드 바인딩 할 수 있습니다. VEGFR-2가 혈관 배아 발달의 (기존의 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장), 상처 치료, 암, 안과 질환을 유도하는 중요한 역할을한다. 이러한 상황에서, 이러한 VEGF-A, -C와 -D 바인드로와 리간드는 혈액 혈관 내피 세포 12-15의 수용체를 활성화합니다. 림프관 내피 세포에서 VEGFR-2 림프관 형성에서 역할 새로운 림프관 (16)의 형성을 수행한다. VEGFR-2도 팽창하고 건강한 조직과 질병 (17)의 주요 동맥과 림프관의 확장을 홍보 할 수 있습니다. VEGFR-2의 완전한 이해 : 리간드 상호 작용은 혈관 신생 - 의존성 질환을 치료하는 (18)에 사용하기위한 억제제의 개발이 중요하다. VEGFR-2 VEGF-A 바인드 대부분의 동종은, VEGF-C와 VEGF-D의 단백질 분해 절단은 VEGFR-2 (19, 20)에 결합하는 높은 친 화성을 ​​나타내는 VEGF-상동 도메인으로 구성된 단편을 해제 할 필요가있다. 우리는 21 (전문 매체를 필요로) 차 내피 통로에 기술적으로 어려운 세포, 구입 비용과 문화에 대한 필요성을 우회하도록 설계 VEGFR-2의 리간드를 모니터링하는 생물 검정을 개발하고 여러 VEGFRs을 표현하고 코를 연결 한 (22) 수용체. 스터드 목표로 할 때 다른 VEGF 수용체 또는 공동 수용체와 VEGFR-2의 Heterodimerization 불필요한 복잡성을 야기 할 수Y 이진 수용체 - 리간드 상호 작용, 특정 수용체에 기인하는 활성을 평가하거나 억제 시약의 효과를 평가. 23. 생물학적 검정법은 세포막의 관련 수용체의 이동도를 유지하고 결합 리간드의 능​​력 크로스 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역의 평가를 허용한다. 생물학적 검정법 (이 경우 VEGFR-2)은 VEGF 수용체의 세포 외 영역은 상기 트랜스과 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR), 사이토 카인 리셉터 패밀리의 구성원의 세포 내 영역에 융합시킨, 키메라 수용체의 생성에 의존 8,24. 이 융합 단백질은 그 후, 인자 - 의존 프로 B 세포주 학사 / F3로 표현 결합 및 수용체의 세포 외 도메인이 가능한 세포질 효과기 영역의 활성화를 일으키는 가교 결합 할 수있는 리간드되는 자극에 따라 셀을 촉진하기 위해 야누스 키나제 (JAKs)를 통해 생존 신호를 열 변환의생존 및 / 또는 증식. 반면, 리간드와 전체 길이 VEGFR-2와 동일한 세포 유형, 그리고 자극의 발현은 VEGFR-2 통로의 근위 신호 이펙터이 세포 유형에서 사용할 수없는 것을 나타내는, 세포 생존 및 증식을 촉진하지 않습니다. 우리는 새로운 VEGFR-2 리간드 10,19,20,24-29의 결합을 탐구하는 다양한 상황의 분석을 사용했다. VEGFR-3 EPOR-BA / F3 분석과 함께, 우리는 바인딩 및 VEGFR-2 및 VEGFR-3 (30)을 가교하기위한 기준으로 VEGF-C의 활동 및 VEGF-D 성장 인자를 비교 하였다. 상기 분석은 VEGFR-2, VEGF-D, 가용성 VEGFR-2 트랩 및 VEGF 패밀리 31 타겟팅 펩티 모노클로 중화 항체의 억제 활성을 특성화하는데 사용되어왔다. 분석은 기본 내피 세포에 결합하는 다른 ORF 바이러스 균주에서 VEGFs의 능력과 가교 VEGFR-2 이전 테스트에 표시하는 데 사용 <s&gt; 10, 26입니다. 분석은 그들이 더 힘든 내피 세포 분석 25시 정화 성장을위한 평가 프로토콜 (27) 요인에 도입되기 전에 신속하게 활동 평가 될 수있다 VEGFs의 돌연변이의 빠른 검사에 특히 유용합니다. 우리가 묘사 분석을 수행하기 용이하며, 반 정량적 버전은 성장 인자, 항체 또는 다른 실험 가용성 수용체 도메인의 제조 또는 정제를 모니터링 할 때 종종 필요한 빠른 결정을 허용한다. 분석의 사용의 용이성은 특정 조직 또는 기관 시스템에서 혈액이나 림프 혈관에서 파생 된 차 내피 세포로 수행 더욱 더 완벽한 연구에 이상적인 보완한다.

<table><tbody><tr>PBS의 <td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4% 용액은 생존 가능한 세포를 측정하기 위해 세포 현탁액과 1:1로 사용됩니다. 위험-암을 유발할 수 있음</td></tr><tr><td>G418 황산염(유전신)</td>형질주입된 진핵 세포를 선택하기 위한 <td>Invivogen</td><td>ant-gn-5</td><td>제제. 위험 - 알레르기 또는 천식 증상 또는 호흡 곤란을 일으킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>3H-Thymidine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET-027</td><td>이 방사성 뉴클레오시드는 유사분열 동안 염색체 DNA에 통합됩니다. 위험 방사선</td></tr><tr><td>Vialight Plus Kit</td><td>Lonza</td><td>LT07-221</td> ATP 모니터링 시약 Prestoblue 세포 생존력 시약 Invitrogen A13261 Resazurin 기반 세포 생존력 지표를 <td>사용하여 생존력을 정량화하기 위한 세포 ATP의 생물 발광 검출</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>. </td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface (72 well)가 있는 세포 Nunc Minitray</td>의 환원 환경에서 빨간색으로 변함<td>Thermo Scientific</td><td>136528</td><td>Small microtitre plate</td></tr><tr><td>96 well Tissue Culture Plate</td><td>Falcon, Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>353072 DMEM (1X)</td><td>Gibco</td><td>11965-92</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>소태아 세럼</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 10099-141</td><td></td></tr><tr><td>세포 수확기</td><td>Tomtec Life Sciences</td><td></td><td>Tomtec 수확기, 96 마하 3M 세포 수확기</td></tr><tr><td>액체 섬광 카운터</td><td>LKB Wallac</td><td>1205</td><td>LKB Wallac 1205 베타 플레이트 섬광 카운터</td></tr><tr><td>UniFilter-96 GF / B</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005177</td><td>White 96-well Barex Microplate with GF / B filterof 1 &micro; m poresize</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um 공극 셀룰로오스 아세테이트 원심분리기 튜브 필터 유닛</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>8160</td><td>원심분리기 튜브 필터는 0.22 &마이크로; m pore CA 멤브레인 함유 필터 유닛 500 &micro; L 용량 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브.</td></tr><tr><td>형광 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td>BioTek Synergy 4 하이브리드 마이크로플레이트 리더&nbsp;</td></tr></tbody></table>

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

혈관 생물학 관련 수용체 티로신 키나제 및 작용 리간드 분석 인해 관련 수용체 관련 리간드의 다양한 전문 내피 세포의 일차 배양 취급의 어려움 가족의 구성 적 발현 종종 도전적이다. 여기서 우리는 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2), 혈관 및 림프관을 촉진 신호의 핵심 변환기에 리간드의 검출을위한 생물학적 검정을 기술한다. 횡단 및 에리트로 포이 에틴 수용체 (EPOR)의 세포질 영역으로 VEGFR-2의 세포 외 (리간드 결합) 영역의 융합을 코드하는 cDNA를 인자 의존적 세포주 학사 / F3 표현된다. 이 세포주는 24 시간 이내에 세포 죽음 인터루킨 -3 (IL-3),이 계수 결과의 금단의 존재하에 성장한다. VEGFR-2 / EPOR 수용체 융합의 발현은 생존과 포텐을 촉진하기위한 대안 메커니즘을 제공합니다결합 및 융합 단백질 (즉, 하나의 수 크로스 - 링크 VEGFR-2의 세포 외 영역)의 세포 외 부분을 가교 결합 할 수있는 리간드의 존재 하에서 안정하게 트랜 스펙 션 된 Ba / F3 세포의 증식 에서야. 리간드와 세포의 소량은 24 시간으로 신속한 결과를 허용하는 반 - 정량적 인 접근과 생존 세포 수의 대용 마커를 포함하는 정량 방법 : 분석은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다. 분석 수행 비교적 쉽게, 알려진 VEGFR-2 리간드에 매우 응답 및 VEGFR-2는 수용체 나 리간드 및 수용성 리간드 트랩에 대한 단일 클론 항체로 신호의 세포 외 억제제를 수용 할 수 있습니다.

이 섹션에서는, 우리는 VEGFR-2-EPOR - 바 / F3의 생물 검정 (분석의 원리 그림 1 참조)의 필수 기능을 보여주는 실험의 결과를 보여줍니다. 다른 발표 된 연구는 다른 VEGFR-2 리간드, 돌연변이 VEGF 분자 및 저해 모노클로 날 항체 8,10,19,24-30에 대한 분석의 광범위한 응용 프로그램을 보여줍니다. 여기에 제시된 데이터는 VEGFR-2 EPOR-BA / F3 생물 검정법은 세 가지 재조합 인간 리간드 (VEGF-165, VEGF-C 및 VEGF-D) VEGFR 대한 특이 활성을 정량화하는데 사용되는 분석법을 나타낸다 -2 저해 성 모노클로 날 항체 (베바 시주 맙)의 존재 하에서 VEGF-A (165)의 데이터는 VEGF-A (16...

우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

이 간단한 세포 기반 생물학적 분석법의 전반적인 목표는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) 패밀리 리간드 구성원들의 활성을 검출, 정량 및 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 VEGF-R 패밀리 리간드가 질병의 핵심 과정을 조절하는 혈관 생물학, 바이러스학, 암 및 안과학 분야의 주요 질문들에 답을 제공할 수 있습니다. 이 분석법의 주요 장점은 특수한 상피 세포를 필요로 하지 않으면서 VEG-FM 패밀리 리간드가 서로 다른 수용체에 결합하고 교차 결합하는 능력을 평가할 수 있다는 점입니다.대수 성장기(log phase)의 IL3 분비 세포주 WEHI-3D 5 × 10⁶개를 50 mL의 신선한 배지가 담긴 4~10개의 T175 플라스크에 분주하여 배양합니다. 7일 동안 또는 세포가 대수 성장기를 지나 약 24~48시간이 경과할 때까지 배양합니다. 플라스크에서 배양액과 세포를 따라냅니다.세포와 세포 잔해를 제거하기 위해 1,000 Gs에서 15분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액의 상위 90%를 제거하고 0.22 micron 필터 유닛으로 여과합니다. 분석 준비를 위해 컨디셔닝 배지를 1 mL씩 소분합니다.인자 의존성 세포주의 계대를 위한 배양액 제조용으로 50 milliliter씩 분주하고, 20 degree Celsius에서 장기 보관하기 위해 200 milliliter씩 분주합니다. 소량 분주액은 20 Celsius에서 보관하십시오. 대조군 BAF3 세포는 10% WEHI-3D 조건화 배지가 포함된 배양액에서 배양합니다.그리고 1 mg/mL G418이 추가된 동일한 배지에서 VegFR2-EPoR-BAF3 세포를 배양합니다. 대수 증식기에 있는 세포로부터 1:15 비율로 희석하여 세포를 계대 배양합니다. 대수 증식기 중간 단계의 배양액에서 대조군 BAF3 또는 VegFR2VPoR-BAF3 세포를 수확합니다.플라스크 바닥에서 세포를 조심스럽게 피펫팅하여 제거한 후, 750 Gs에서 5분간 원심분리하여 세포 펠릿을 회수합니다. 펠릿을 10 milliliters의 마우스 등장성 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고 750 Gs에서 5분간 다시 원심분리합니다. IL3가 포함된 배지를 제거하기 위해 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.DEHI-3D 조건화 배지가 포함되지 않은 배지를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 추가적인 성장 인자가 남아 있어 위양성 결과나 높은 배경 활성이 생성되는 것을 방지하기 위해, IL3가 포함된 배양 배지를 완전히 세척하는 것이 중요합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 동일한 IL3 무첨가 배지를 사용하여 세포를 7.4 × 10⁴ cells/mL 농도로 재현탁합니다.마지막으로 PBS에 희석한 trypan blue와 세포 현탁액을 동일한 부피로 혼합한 후 hemacytometer에 로딩합니다. 최소 100개의 세포를 계수합니다. 염료가 염색된 세포는 죽었거나 죽어가는 세포로 간주합니다.어세이에 사용되는 세포가 어세이 조건에 적절히 반응할 수 있도록 높은 생존율을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 잘 보정된 P20 자동 피펫과 멸균된 팁을 사용하여, IL 결핍 배지 13.5 microliters에 포함된 1,000개의 세포를 72-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 분주 과정 중에 세포 현탁액을 잘 섞어 중력에 의한 세포 침전으로 인해 세포 농도에 편차가 생기지 않도록 주의하십시오.잘 보정된 P2 피펫을 사용하여 대조군 웰에 IL3가 없는 배지 1.5 µL를 3반복으로 첨가하십시오. 가볍게 혼합하십시오. 동일한 방식으로 10% WEHI-3D 조건화 배지와 IL3가 없는 100 ng/mL VegFA 대조군을 해당 웰에 첨가하십시오.마지막으로 테스트 샘플 1.5 µL를 3회 반복하여 첨가합니다. 마이크로웰 플레이트의 사용하지 않는 웰은 멸균수, PBS 또는 배지로 채웁니다. 가스 교환이 가능한 습윤 챔버를 만들기 위해 가스 투과성 용기에 물에 적신 티슈를 넣습니다.어세이 플레이트를 10% 이산화탄소가 포함된 습윤한 분위기의 챔버 내에서 16시간 동안 배양하십시오. 16시간의 배양 후, 표준 도립 위상 현미경을 사용하여 40배에서 100배 배율로 플레이트를 분석하십시오. 이 단계에서 양성 샘플과 음성 샘플을 구분할 수 있습니다.성장 인자가 없거나 배지만 포함된 웰에서는 둥근 세포의 수가 감소하며, 죽었거나 죽어가는 세포 및 세포 파편이 관찰됩니다. 반면, IL3 또는 VegFR2용 ligin이 포함된 배지에서 배양된 세포는 크고 투명하며, 세포질 내 과립이나 배양액 내 세포 파편의 증거가 없거나 매우 적습니다. 세척된 세포 10,000개를 IL3 결핍 배지 135 µL에 넣어 표준 96-웰 플레이트의 웰에 추가합니다.교정된 P20 피펫을 사용하여 테스트 샘플과 대조군 15 µL를 웰에 첨가합니다. 세포, 성장 인자 및/또는 억제제 혼합물을 이전과 동일하게 48시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 프로토콜의 서면 부분에 설명된 방법을 사용하여 웰 내의 생존 세포 수를 평가합니다.여기 VEGF-R2 EPoR BAF3 바이오어세이를 사용하여 VEGF-R2에 특이성을 가진 세 가지 재조합 인간 리간드인 VEGF-A165, VEGF-C 및 VEGF-D의 활성을 정량화한 어세이 결과가 제시되어 있습니다. 활성은 VEGF-A165에 대한 억제성 단클론 항체인 bevacizumab이 존재하거나, 비중화 항체인 trastuzumab이 존재하는 조건에서 정량화되었습니다.데이터는 VEGF-A165 단독 처리 시의 반응에 대해 정규화되었습니다. 예상대로 bevacizumab은 분석에서 VEGF-A165의 효과를 차단했으나, VEGF-C 및 VEGF-D의 활성에는 영향을 미치지 않았습니다. IL3에 노출된 세포는 높은 생존율을 보였습니다.반면, 추가 성장 인자에 노출되지 않은 경우에는 생존력이 낮게 나타납니다. 이 절차를 시도할 때, 분석 전에 생성해야 하는 조건부 배지 내의 다양한 제어 인자들이 있다는 점을 염두에 두는 것이 중요합니다. 이 기술은 혈관 생물학, 바이러스학, 암 및 안과학 분야에서 리간드 내 VEG-FM의 역할을 탐구하는 재등장의 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후에는 바이오에세이 세포를 준비하고, 바이오에세이를 수행하며, VEG-FM 리그닌 활성에 대한 정량 또는 반정량 분석을 진행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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이 동영상은 체외의 angiogenesis 분석에의 프로토콜을 보여줍니다 angiogenesis의 recapitulates 여러 단계의 것을. 시간 저속 돋아의 이미지, 루멘 형성, 분기 및 문합 - angiogenesis의 주요 기능은 - 표시됩니다.

Angiogenesis 연구에 최적화된 섬유소 젤 비드 분석

physiologic angiogenesis 그 부족 일반 성인 vascularized 포유류의 조직은 학습하는 데 사용됩니다 수술 개입에 노출되지 않았습니다 (I) 개시 및 시험 요원의 intraperitoneal 관리 다음 angiogenesis의 개발, 그리고 체계적인 관리 아래와 angiogenesis의 (2) 수정 테스트 에이전트를 선택했습니다.

쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

우리는 암세포가 분비하는 인자 풀의 혈관 형성 가능성을 설명하기 위해 초음파와 내시경이라는 두 가지 상보적인 이미징 방식을 사용하여 마트리겔 플러그 분석을 설명합니다. 세포외 기질(ECM)-모방 겔인 마트리겔(matrigel)은 조건화된 배지(C.M.)로 분비되는 혈관 형성 인자를 숙주(마우스)에 도입하는 데 사용됩니다.

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

이 원고는 통제된 환경에서 내피 세포관 형성을 사용하여 혈관 신생에 대한 주어진 화합물 또는 조건의 효과를 정량화하기 위한 튜브 형성 분석을 설명합니다.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

이 종이 여부를 평가 체 외에 고전적인 종양 신생 hemangioblastomas (HBs)와 HBs에서의 역할에 있는 포괄적인 절차를 제공 합니다. 결과 HB neovascularization의 복잡성을 강조 하 고는 것이 좋습니다이 일반적인 형태의 신생 HB neovascularization만 보완 메커니즘.

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

여기, 선물이 murine 피부에 침투성 홍보 요원의 피부 관리에 의해 유도 된 혈관 누설을 측정 하는 프로토콜. 이 기술은 홍보 또는 혈관 누설을 억제 하거나 혈관 침투성을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 분자의 능력을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

배우세요 VEGF 계열 리간드의 활성을 정량적으로 평가하는 간단한 세포 기반 생물 검정법입니다. 키메라 수용체를 활용하여 혈관생물학 및 암 연구에 활용할 수 있습니다.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

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