혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

이 간단한 세포 기반 생물학적 분석법의 전반적인 목표는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) 패밀리 리간드 구성원들의 활성을 검출, 정량 및 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 VEGF-R 패밀리 리간드가 질병의 핵심 과정을 조절하는 혈관 생물학, 바이러스학, 암 및 안과학 분야의 주요 질문들에 답을 제공할 수 있습니다. 이 분석법의 주요 장점은 특수한 상피 세포를 필요로 하지 않으면서 VEG-FM 패밀리 리간드가 서로 다른 수용체에 결합하고 교차 결합하는 능력을 평가할 수 있다는 점입니다.

대수 성장기(log phase)의 IL3 분비 세포주 WEHI-3D 5 × 10⁶개를 50 mL의 신선한 배지가 담긴 4~10개의 T175 플라스크에 분주하여 배양합니다. 7일 동안 또는 세포가 대수 성장기를 지나 약 24~48시간이 경과할 때까지 배양합니다. 플라스크에서 배양액과 세포를 따라냅니다.

세포와 세포 잔해를 제거하기 위해 1,000 Gs에서 15분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액의 상위 90%를 제거하고 0.22 micron 필터 유닛으로 여과합니다. 분석 준비를 위해 컨디셔닝 배지를 1 mL씩 소분합니다.

인자 의존성 세포주의 계대를 위한 배양액 제조용으로 50 milliliter씩 분주하고, 20 degree Celsius에서 장기 보관하기 위해 200 milliliter씩 분주합니다. 소량 분주액은 20 Celsius에서 보관하십시오. 대조군 BAF3 세포는 10% WEHI-3D 조건화 배지가 포함된 배양액에서 배양합니다.

그리고 1 mg/mL G418이 추가된 동일한 배지에서 VegFR2-EPoR-BAF3 세포를 배양합니다. 대수 증식기에 있는 세포로부터 1:15 비율로 희석하여 세포를 계대 배양합니다. 대수 증식기 중간 단계의 배양액에서 대조군 BAF3 또는 VegFR2VPoR-BAF3 세포를 수확합니다.

플라스크 바닥에서 세포를 조심스럽게 피펫팅하여 제거한 후, 750 Gs에서 5분간 원심분리하여 세포 펠릿을 회수합니다. 펠릿을 10 milliliters의 마우스 등장성 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고 750 Gs에서 5분간 다시 원심분리합니다. IL3가 포함된 배지를 제거하기 위해 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.

DEHI-3D 조건화 배지가 포함되지 않은 배지를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 추가적인 성장 인자가 남아 있어 위양성 결과나 높은 배경 활성이 생성되는 것을 방지하기 위해, IL3가 포함된 배양 배지를 완전히 세척하는 것이 중요합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 동일한 IL3 무첨가 배지를 사용하여 세포를 7.4 × 10⁴ cells/mL 농도로 재현탁합니다.

마지막으로 PBS에 희석한 trypan blue와 세포 현탁액을 동일한 부피로 혼합한 후 hemacytometer에 로딩합니다. 최소 100개의 세포를 계수합니다. 염료가 염색된 세포는 죽었거나 죽어가는 세포로 간주합니다.

어세이에 사용되는 세포가 어세이 조건에 적절히 반응할 수 있도록 높은 생존율을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 잘 보정된 P20 자동 피펫과 멸균된 팁을 사용하여, IL 결핍 배지 13.5 microliters에 포함된 1,000개의 세포를 72-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 분주 과정 중에 세포 현탁액을 잘 섞어 중력에 의한 세포 침전으로 인해 세포 농도에 편차가 생기지 않도록 주의하십시오.

잘 보정된 P2 피펫을 사용하여 대조군 웰에 IL3가 없는 배지 1.5 µL를 3반복으로 첨가하십시오. 가볍게 혼합하십시오. 동일한 방식으로 10% WEHI-3D 조건화 배지와 IL3가 없는 100 ng/mL VegFA 대조군을 해당 웰에 첨가하십시오.

마지막으로 테스트 샘플 1.5 µL를 3회 반복하여 첨가합니다. 마이크로웰 플레이트의 사용하지 않는 웰은 멸균수, PBS 또는 배지로 채웁니다. 가스 교환이 가능한 습윤 챔버를 만들기 위해 가스 투과성 용기에 물에 적신 티슈를 넣습니다.

어세이 플레이트를 10% 이산화탄소가 포함된 습윤한 분위기의 챔버 내에서 16시간 동안 배양하십시오. 16시간의 배양 후, 표준 도립 위상 현미경을 사용하여 40배에서 100배 배율로 플레이트를 분석하십시오. 이 단계에서 양성 샘플과 음성 샘플을 구분할 수 있습니다.

성장 인자가 없거나 배지만 포함된 웰에서는 둥근 세포의 수가 감소하며, 죽었거나 죽어가는 세포 및 세포 파편이 관찰됩니다. 반면, IL3 또는 VegFR2용 ligin이 포함된 배지에서 배양된 세포는 크고 투명하며, 세포질 내 과립이나 배양액 내 세포 파편의 증거가 없거나 매우 적습니다. 세척된 세포 10,000개를 IL3 결핍 배지 135 µL에 넣어 표준 96-웰 플레이트의 웰에 추가합니다.

교정된 P20 피펫을 사용하여 테스트 샘플과 대조군 15 µL를 웰에 첨가합니다. 세포, 성장 인자 및/또는 억제제 혼합물을 이전과 동일하게 48시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 프로토콜의 서면 부분에 설명된 방법을 사용하여 웰 내의 생존 세포 수를 평가합니다.

여기 VEGF-R2 EPoR BAF3 바이오어세이를 사용하여 VEGF-R2에 특이성을 가진 세 가지 재조합 인간 리간드인 VEGF-A165, VEGF-C 및 VEGF-D의 활성을 정량화한 어세이 결과가 제시되어 있습니다. 활성은 VEGF-A165에 대한 억제성 단클론 항체인 bevacizumab이 존재하거나, 비중화 항체인 trastuzumab이 존재하는 조건에서 정량화되었습니다.

데이터는 VEGF-A165 단독 처리 시의 반응에 대해 정규화되었습니다. 예상대로 bevacizumab은 분석에서 VEGF-A165의 효과를 차단했으나, VEGF-C 및 VEGF-D의 활성에는 영향을 미치지 않았습니다. IL3에 노출된 세포는 높은 생존율을 보였습니다.

반면, 추가 성장 인자에 노출되지 않은 경우에는 생존력이 낮게 나타납니다. 이 절차를 시도할 때, 분석 전에 생성해야 하는 조건부 배지 내의 다양한 제어 인자들이 있다는 점을 염두에 두는 것이 중요합니다. 이 기술은 혈관 생물학, 바이러스학, 암 및 안과학 분야에서 리간드 내 VEG-FM의 역할을 탐구하는 재등장의 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 바이오에세이 세포를 준비하고, 바이오에세이를 수행하며, VEG-FM 리그닌 활성에 대한 정량 또는 반정량 분석을 진행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.