혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

이 간단한 세포 기반 생물학적 분석법의 전반적인 목표는 혈관 내피 성장 인자 계열의 리긴(ligins) 구성원의 활동을 검출, 정량화 및 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 VEG-FR 패밀리 리긴이 이러한 질병의 주요 과정을 방사하는 혈관 생물학, 바이러스학, 암 및 안과학의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 분석의 주요 장점은 특별한 상피 세포를 필요로 하지 않고 서로 다른 수용체를 결합하고 가교 결합할 수 있는 능력 측면에서 VEG-FM 패밀리 리진을 평가할 수 있다는 것입니다.

IL3 분비 세포주 WEHI-3D를 5배 10번째에서 6번째 세포로 피펫팅하여 50mm의 신선한 배양 배지를 함유한 4-10개의 T175 플라스크로 배양합니다. 7일 동안 또는 세포가 약 24-48시간 동안 성장 단계를 통과할 때까지 배양합니다. 플라스크에서 액체와 세포를 디캔팅합니다.

그리고 1, 000 GS에 15 분 동안 세포와 세포질 파편을 제거하기 위하여 회전시킨다. 그런 다음 상위 90%의 상층부를 제거하고 0.22미크론 필터 장치를 통해 여과합니다. 분석 준비를 위해 조절된 배지를 1mL 분취량으로 분취합니다.

배양 배지를 인자 의존성 세포주에 전달하기 위한 50mL 분취액과 섭씨 20도에서 장기 보관을 위한 200ml 용량. 더 작은 부피는 섭씨 20도에서 보관하십시오. 10%WEHI-3D 컨디셔닝 배지를 함유하는 배양 배지에서 BAF3 세포를 배양하여 대조군.

및 동일한 배지에 있는 VegFR2-EPoR-BAF3 세포와 밀리리터당 1밀리그램 G418. 계대 세포는 로그 단계에서 성장하는 세포에서 1-15 희석됩니다. 중간 로그 단계 배양을 위한 수확 제어 BAF3 또는 VegFR2VPoR-BAF3 세포.

펠릿을 회수하기 위해 750Gs에서 5분 동안 플라스크 원심분리기 바닥의 세포를 부드럽게 피펫팅하여 제거합니다. 펠릿을 10ml의 마우스 긴장도, 인산염 완충 식염수 및 원심분리에 다시 750Gs에서 5분 동안 현탁시킵니다. 세척을 두 번 더 반복하여 IL3가 포함된 매체를 제거합니다.

DEHI-3D 컨디셔닝 배지가 없는 배지를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. IL3를 함유한 배양 배지를 씻어내어 위양성 결과 또는 높은 백그라운드 활성을 생성할 수 있는 추가 성장 인자가 남아 있지 않도록 하는 것이 중요합니다. 원심분리하여 폐기한 후, supernayten은 동일한 IL3 유리 배지의 세포를 7.4 곱하기 10의 농도로 밀리리터당 네 번째 세포에 다시 현탁시킵니다.

마지막으로, PBS에서 동일한 부피의 트리판 블루를 세포 집단과 혼합하고 혈구계에 로드합니다. 최소 100개의 셀을 계산합니다. 염료를 흡수하는 세포는 죽었거나 죽어가는 것으로 간주됩니다.

분석에 사용되는 세포가 분석 조건에 반응할 수 있도록 높은 생존율을 갖는 것이 중요합니다. 잘 보정된 P20 자동 피펫 및 오토클레이브 팁을 사용하여 13.5마이크로리터의 IL 결핍 배지에 있는 1, 000개의 세포를 72웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 중력에 의한 세포 침전이 세포 농도를 편향시키지 않도록 부분 표본 작성 중에 세포 현탁액을 혼합하도록 주의하십시오.

잘 보정된 P2 피펫을 사용하여 1.5마이크로리터의 IL3 유리 매체를 제어 웰에 3배로 추가합니다. 혼합하는 것이 복잡합니다. 같은 방법으로 10%WEHI-3D 컨디셔닝 배지와 밀리리터당 100나노그램 VegFA no IL3 control을 원하는 웰에 추가합니다.

마지막으로 1.5마이크로리터의 테스트 샘플을 세 번 추가합니다. 마이크로웰 플레이트의 사용하지 않은 웰을 멸균수, PBS 또는 매체로 채웁니다. 물에 적신 티슈 페이퍼를 가스 투과성 용기에 넣어 가스 교환이 가능한 가습 챔버를 만듭니다.

챔버의 분석 플레이트를 10% 이산화탄소의 가습 분위기에서 16시간 동안 배양합니다. 16시간의 배양 후 표준 도립 위상 현미경을 사용하여 40-100배 배율로 플레이트를 분석합니다. 이때 양성 샘플과 음성 샘플을 구별 할 수 있습니다.

성장 인자의 지원이 없거나 배지만 있는 웰은 원형 세포의 수가 감소할 뿐만 아니라 죽거나 죽어가는 세포 및 세포 파편을 갖게 됩니다. 반면, VegFR2에 대한 IL3 또는 ligin을 함유한 배지로 배양된 세포는 크고 반투명하며 배양 내 세포 세포질 또는 세포 파편에 입도의 증거가 없거나 최소한입니다. 10, IL3 결핍 매체의 135 마이크로리터에 있는 세척된 세포 10, 000의 세척된 세포를 표준 96 웰 플레이트의 웰에 추가하십시오.

보정된 P20 피펫을 사용하여 15마이크로리터의 테스트 샘플과 컨트롤을 웰에 추가합니다. 세포, 성장 인자 및/또는 억제제의 혼합물을 이전과 같이 48시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 완료되면 프로토콜의 서면 부분에 설명된 방법을 사용하여 웰에서 생존 가능한 세포의 수를 평가합니다.

다음은 VEGF-R2 EPoR BAF3 생물학적 분석을 사용하여 VEGF-R2에 대한 특이성을 가진 3개의 누운 인간 리긴의 활성을 정량화하는 분석 결과입니다. VEGF-A165, VEGF-C 및 VEGF-D. VEGF-A165에 대한 억제성 단일클론항체인 베바시주맙(bevacizumab)의 존재 또는 비중화항체인 트라스투주맙(trastuzumab)의 존재 하에서 활성을 정량화하였다.

데이터는 VEGF-A165 단독에 대한 반응에 비해 정규화되었습니다. 예상대로 베바시주맙은 분석에서 VEGF-A165의 효과를 차단했지만 VEGF-C 및 VEGF-D의 활성에는 영향을 미치지 않았습니다. IL3에 노출된 세포는 생존율이 높았습니다.

반면 추가 성장 인자에 노출되지 않은 사람들은 생존력이 좋지 않습니다. 이 절차를 시도할 때는 분석 전에 생성되어야 하는 조절된 배지의 다양한 조절제라는 점을 염두에 두는 것이 중요합니다. 이 기술은 혈관 생물학, 바이러스학, 암 및 안과학에서 리긴에서 VEG-FM의 역할을 탐구하기 위한 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 생물학적 분석 세포를 준비하고, 생물학적 분석을 실행하고, VEG-FM 리긴 활성의 정량적 또는 반정량적 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.