배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

분화 중인 배아줄기세포 또는 심장 배아 조직에 이러한 염색질 면역침전법을 적용하는 전반적인 목표는 심장 발달의 후성유전학적 조절 기전을 밝혀내는 것입니다. 배아 심장 발달 과정에서 유전자 전사의 미세 조정은 후성유전학적 성분에 의해 조절되므로, 염색질 면역침전법은 이 과정을 이해하는 데 적합한 접근 방식입니다.

이 기술의 주요 장점은 특정 유전자 좌위를 특이적으로 표적화하여 해당 DNA 부위에 존재하는 후성유전학적 표지를 확인할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 심장 발달의 후성유전학적 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 다른 장기나 모든 세포 유형에도 적용 가능합니다.

여기에 Imen입니다. 그녀는 연구실의 박사 과정 학생이며, 오늘 실험을 진행할 예정입니다. 이 절차에서는 배아 줄기세포 또는 ES 세포를 사용합니다.

ES 세포로부터 생성된 배아체와 E9.5 마우스 배아에서 적출한 배아 심장 조직입니다. 세포와 조직을 고정합니다. 세포에는 PBS 내 1% formaldehyde를 사용하고, 배아 조직에는 PB2 투과화 버퍼를 사용하십시오.

튜브를 60 RPM 속도의 오비탈 셰이커에 놓고 상온에서 정확히 10분 동안 반응시킵니다. 최종 농도가 125 millimolar가 되도록 glycine을 첨가하여 가교 반응을 중단시키고, 60 RPM 속도의 오비탈 셰이커에서 상온으로 5분 동안 배양합니다. 이 절차를 시작하려면 펠렛을 10 milliliters의 PBS에 다시 현탁하십시오.

그리고 1 mL의 PB2에 배아 조직을 넣습니다. 4 °C에서 1000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 2차 세척을 위해 해당 완충액을 추가합니다.

얼음 위에서 버퍼 PB1과 PB2에 프로테아제 억제제를 첨가합니다. 프로테아제 억제제가 첨가된 버퍼 PB1 1 mL를 세포 펠릿에 넣고 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 동일한 방법으로, 프로테아제 억제제가 첨가된 버퍼 PB2 1 mL에 배아 조직을 재현탁합니다.

그 후 21-gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 세포 또는 조직을 균질화합니다. 세포 현탁액을 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 균질화된 세포와 조직을 4 °C에서 10분 동안 배양합니다.

4°C에서 3000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 각 펠릿을 프로테아제 억제제가 첨가된 300 µL의 해당 초음파 처리 버퍼에 다시 현탁합니다. DNA 분해를 방지하기 위해 세포 현탁액을 인증된 RNase, DNase 및 파이로젠 프리 튜브로 옮겨 얼음 위에서 15분에서 30분 동안 배양합니다.

크로마틴을 전단하기 위해, 각 시료에 적합한 초음파 처리 프로그램을 사용하여 4 °C에서 시료를 초음파 처리합니다. DNA를 PCR 또는 시퀀싱에 사용할 것인지에 따라 초음파 처리 시간을 조정하십시오. 다음으로, 초음파 처리된 세포 용해물을 10분 동안 원심분리합니다.

각 샘플에서 용액 상태의 크로마틴인 상층액을 깨끗한 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 펠렛은 제거합니다. 각 샘플의 1.5 microliter 분취액을 취해 물로 1:10으로 희석합니다. 나노 분광광도계로 모든 샘플의 광학 밀도를 측정하여 단백질 농도를 결정합니다.

크로마틴 면역침강법을 수행하기 전, 프로토콜 본문에 기술된 방식대로 세척하여 단백질 A 접합 비드를 준비합니다. 깨끗한 1.5 milliliter 튜브에 수식 히스톤 또는 전사 인자에 대해 생성된 항체, 세척된 단백질 A 접합 비드 20 microliters, 그리고 프로테아제 억제제가 첨가된 버퍼 C 1 milliliter를 혼합합니다. 시료를 로테이터 위에서 40 RPM으로 4 degree Celsius에서 최소 2시간 동안 배양합니다.

프로토콜 본문에 기술된 대로 1 mL의 버퍼 C로 항체 비드 복합체를 3회 세척합니다. 한 튜브에는 150 µg의 크로마틴 및 항체 비드 복합체를 담고, 다른 튜브에는 150 µg의 크로마틴과 20 µL의 세척된 비드를 담아 두 개의 튜브를 준비합니다. 각 튜브에 프로테아제 억제제가 첨가된 1 mL의 버퍼 C를 넣고, 4 °C의 회전 휠에서 40 RPM으로 하룻밤 동안 배양합니다.

밤새 진행한 면역침전이 완료되면, 샘플을 마그네틱 랙에 넣고 결합되지 않은 항체 크로마틴이 포함된 상층액을 회수합니다. 세척된 물질에 150 µL의 buffer D1을 첨가하여 항체 결합 단백질을 용출합니다. 가열 블록에서 샘플을 50 °C로 20분 동안 배양합니다.

20분 후, 가열 블록에서 샘플을 꺼내 자석 랙에 놓습니다. 깨끗한 1.5 milliliter 튜브에 상층액을 회수하고 비드는 폐기합니다. 교차결합을 해제하려면, 상층액에 5 molar sodium chloride를 첨가하여 최종 농도가 200 millimolar가 되도록 합니다.

깨끗한 1.5 milliliter 튜브에 chromatin 입력 샘플을 준비합니다. 면역침전 샘플과 동일한 양의 chromatin을 RNase 및 DNase free water와 최종 농도 200 millimolar가 되도록 맞춘 5 molar sodium chloride로 희석하여 최종 부피 150 microliters로 맞춥니다. 샘플을 65 degree Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 가열 블록에서 샘플을 꺼냅니다. EDTA를 최종 농도 12.5 millimolar가 되도록 첨가하고 Proteinase K를 최종 농도 250 micrograms per milliliter가 되도록 첨가한 후 55 degree Celsius에서 2시간 동안 소화시킵니다. 비즈를 준비하여 이 절차를 시작하십시오.

먼저 비드를 최소 30분 동안 실온에 두어 온도를 맞춥니다. 그 다음 비드를 매우 충분히 볼텍싱하고, 비드 1 mL를 깨끗한 1.5 mL 튜브에 빠르게 분주합니다. 비드가 담긴 튜브를 자석 위에 2~3분 동안 놓아 용액을 투명하게 만든 후 상층액을 제거합니다.

튜브를 자석에서 분리합니다. 0.5 M EDTA 1 mL를 첨가하고 짧게 볼텍싱하여 섞습니다. 이 방식으로 비즈를 두 번 세척하고, 마지막 세척 후 상층액을 제거합니다.

자석에서 튜브를 제거합니다. Buffer E 1 mL를 첨가하고 비드를 천천히 재현탁합니다. 혼합물 전체를 50 mL의 Buffer E로 옮깁니다. 셰이커에 올려놓고 상온에서 1시간 동안 천천히 혼합합니다.

그 후, 1 KB DNA ladder와 세 가지 서로 다른 비드 부피 대 DNA 부피 비율을 사용하여 DNA 결합 비드를 테스트합니다. 2.5/1 비율이 DNA 결합에 가장 적합한 것으로 결정되었습니다. DNA 정제를 위해 비드를 사용하려면, 각 DNA 샘플에 425 µL 또는 2.5배 부피의 비드를 첨가하고 피펫팅으로 약 10회 천천히 재현탁합니다.

실온에서 10분 동안 배양합니다. 자석 위에 5분 동안 둡니다. 그다음 상층액을 흡입하여 제거합니다.

각 튜브에 600 µL씩 갓 제조한 80% ethanol을 첨가하여 두 번 세척합니다. 1분 동안 기다린 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 튜브를 짧게 원심 분리합니다.

튜브를 자석 위에 놓습니다. 남은 에탄올 방울을 제거하고 상온에서 1분 동안 건조합니다. 자석에서 샘플을 제거하고 20 µL의 DNase 및 RNase free water를 첨가하여 DNA를 용출합니다. Vortex합니다.

마우스 ES 세포, 배아체 및 배아 심장 조직에서 추출한 초음파 처리된 전체 DNA의 역가교 후 획득한 DNA 단편의 크기를 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였습니다. ES 세포가 중배엽 세포 운명으로 분화할 때, 야생형 또는 유전자 변이 세포에서 상피-간엽 이행 유전자의 후성유전학적 조절을 관찰하기 위해 염색질 면역침전 실험을 설계하였습니다. 변형된 히스톤의 결합은 E-Cadherin 및 Twist 유전자의 프로모터 또는 인핸서에 대한 PCR을 통해 모니터링하였습니다.

크로마틴 활성화 표지에 대한 항체와 이어서 억제 표지에 대한 항체를 사용하여, 네 가지 인간 ES 세포주에서 추출한 크로마틴에 대해 순차적 크로마틴 면역침강을 수행하였습니다. 이러한 표지들은 세포가 형태 형성 인자에 의해 자극을 받을 때 변형되지만, 인간 ES 세포주에 따라 가변적입니다. 이는 아마도 해당 세포주가 유래된 원래의 배반포 때문일 가능성이 큽니다.

염색질 면역침강법은 특정 배아 심장 부위에서 추출한 염색질에도 적용할 수 있습니다. 이 그림은 수정된 히스톤에서 농축된 심장 유전자 Nkx2.5 및 TBx5의 게놈 영역과, 농축되지 않았으며 심실에서 발현되지 않는 Shox2 페이스메이커 특이 유전자의 한 게놈 영역을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때, IP 프로토콜을 시작하기 전 초음파 처리 효율을 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 크로마틴의 개방 또는 폐쇄 상태와 같은 이전 상태를 조사하거나 뉴클레오솜 간격을 모니터링하는 것과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 Eth-ek-se-ek와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 후성유전학 분야의 연구자들은 모든 세포 유형이나 배아 기관에서 세포 운명 결정의 후성유전적 조절을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 크로마틴 면역침전법(chromatin immuno precipitation assay)의 수행 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.