Name: 배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: 배우세요 크로마틴 면역침전법을 이용한 심장 분화의 후성유전적 조절 메커니즘을 배아 줄기 세포와 조직에서 연구하는 방법입니다. 이 기술은 특정 DNA 위치의 후성유전적 표지를 분석하여 심장 발달 과정에서 유전자 전사 조절을 이해하는 데 활용됩니다.

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저자는 자금 지원 기관, IMI StemBANCC 유럽 공동체 프로그램, leducq 재단(SHAPEHEART) 및 Agence Nationale de la Recherche(Genopath)에 감사를 표합니다.

1. DNA 단백질 교차 결합 <ol><li> ES 세포와 배아 심장 조직에서 생성 된 15 ml의 튜브에 고정 수확-ES 세포 (일반 칩 2 × 10 6 세포, 마이크로 칩 2 × 10 5 세포), 배아 체 (사채)을 E9.5 마우스 배아에서 해부 (방실 운하, 유출 기관 및 뇌실) 세포 또는 배아 조직에 대한 permeabilization의 PB2 버퍼에 PBS에 1 %의 포름 알데히드를 사용하여. 정확히 10 분 동안 실온에서 60 rpm의 속도로 진탕에 튜브를 놓는다. </li><li> 125 mM의 최종 농도 글리신을 첨가하여 가교 반응을 정지하고 60 rpm의 속도로 진탕 기에서 실온에서 5 분 동안 배양한다. </li></ol> 2. 세포 용해 및 염색질 조각화 <ol><li> PBS 1X 또는 배아 조직을 1 ml의 PB2에 재현 탁 ml의 두 배 (10)에 재현 탁 가교 세포를 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. &lt;/ 리&gt; <li> PB1 또는 PB2 (2 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 1 μg의 / ㎖ 아프로 티닌, 0.1 mM의 PMSF) (표 1) 버퍼 프로테아제 억제제를 추가합니다. 각각 버퍼 PB1 또는 PB2 1 ml의 2.1 단계에서 세포 펠렛 또는 배아 조직을 재현 탁. 피펫 상하과 세포 나 조직을 재현 탁. 세포 나 조직을 균질화 21 게이지 바늘로 1 ML의 주사기를 사용합니다. 10 분 동안 (바퀴)에 4 ° C에서 품어. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 3,000 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 버린다. </li><li> 깨끗한 튜브 프로테아제 억제제가 보충 각 SB 버퍼 (표 1) 300 μL에 펠렛을 재현 탁 (RNA 분해 효소, DNase- 인증 및 발열원이없는)의 모든 DNA 저하를 방지 할 수있다. 얼음에 15 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> 각 재료에 대해, 표 2에 나열된 프로그램에 따른 초음파 처리기를 사용하여 염색질 전단 4 ℃에서 샘플을 초음파 처리. &lt;(다음의 용도에 따라 초음파 처리 시간을 조정EM&gt; 즉, PCR 또는 시퀀싱). 전단 DNA 크기는 PCR 500 bp의 시퀀싱 300 bp의 주위해야한다. </li><li> 원심 분리기는 깨끗한 1.5 ML 튜브에 뜨는 (염색질)을 전송하고 펠렛을 폐기, 4 ° C에서 6,000 XG에 10 분 동안 세포 용 해물을 초음파. </li><li> 물로 10 회 용액 염색질 (상등액을 완충액 B)을 희석하고, 나노 분광 1.5 μL를 사용하여 광학 밀도를 평가한다. 0.76 X OD 260-1.55 X OD 280 : 다음 공식을 사용하여 μg의 / ㎕의 단백질의 농도를 얻습니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 완충기 </td><td> 이용 </td><td colspan="4"> 구성 </td><td> 재료 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 에이 </td><td rowspan="2"> Permeabilization </td><td colspan="4"> PB1 : 5 밀리미터 파이프의 pH 8; 85mM의 KCl; 0.5 % NP40 </td><td> 모든 </td></tr><tr><td colspan="4"> PB2 : 15 mM의 HEPES pH가 7.6, 15 mM의 NaCl을 4 mM의 MgCl2를 60 mM의 KCl을 0.5 % 트리톤 X-100 </td><td> 배아 조직 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 비 </td><td rowspan="3"> 용해 / 초음파 처리 </td><td colspan="4"> SB1 : 1 % SDS; 10 mM의 EDTA; 50mM 트리스 - 염산 pH를 8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2는 50mM HEPES-KOH pH7.9; 140 밀리미터; 를 1mM EDTA; 0.1 % 데 옥시 콜레이트; 0.1 % SDS </td><td> 사채 </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3 : 15 mM의 HEPES pH7.6, 15 mM의 염화나트륨; 60 밀리미터의 KCl, 1mM의 EDTA, 0.5 mM의 EGTA; 1 % 트리톤 X100 0, 0.1 % SDS, 0.5 % laurylsarcosine </td><td> 배아 조직 </td></tr><tr><td> 기음 </td><td> 칩 버퍼 </td><td colspan="4"> 150 mM의 NaCl을; 50mM 트리스 - 염산 pH를 7.5; 5 mM의 EDTA; 0.5 % NP40; 1 % TRITON-X100. </td><td> 모든 </td></tr><tr><td> 디 </td><td> DNA / 단백질 용출 </td><td colspan="4"> D1 : 1 % SDS; (100)밀리미터의 NaHCO3 D2 : 50 mM 트리스 pH를 7.6 / 5 mM의 EDTA, 15 mM의 DTT, 2 % SDS </td><td></td></tr><tr><td> 이자형 </td><td> DNA 바인딩 비드 준비 </td><td colspan="4"> E : 20 % PEG 8000; 2.5 M의 NaCl; 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8; 를 1mM EDTA </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 칩 버퍼. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 자료 </td><td> 초음파 프로그램 </td></tr><tr><td> 배아 줄기 세포 </td><td> 30 초 ON의 15주기와 OFF 30 초 </td></tr><tr><td> 배아 체 </td><td> 30 초 ON의 30주기와 OFF 30 초 </td></tr><tr><td> 배아 조직 </td><td> 30 초 ON의 21주기와 OFF 30 초 </td></tr></tbody></table> 표 2. 초음파 처리 프로그램. 3. 면역 침전 및세척 <ol><li> 버퍼 C로 3 회 단백질 A-복합 구슬을 씻으십시오. 깨끗한 1.5 ML 튜브에 비즈 100 μl를 타고 버퍼 C (표 1) 1 ㎖를 추가합니다. 튜브는 다음에 자석로 전사되고; 1 분 동안 기다린 뜨는을 대기음. 두 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 깨끗한 1.5 ㎖의 튜브에 프로테아제 억제제가 보충 20 ㎕의 세정 된 단백질 공역 비즈 완충액 C 1 ㎖ 변성 히스톤 또는 전사 인자 (표 3 농도)에 대해 발생 된 항체를 부화. 4 ° C에서 최소 2 시간 동안 40 rpm으로 회 전자에 샘플을 설정합니다. </li><li> 워시 항체 - 비드를 완충액 C 1 ㎖ (3.1에 ​​기재된 조작)로 3 회 복합체. </li><li> 준비 2 튜브를 함유 한 150 염색질 항체 - 구슬 단지의 μg의 세척 구슬 150 염색질의 μg의 20 μl를 포함하는 다른 관; 각 튜브에 프로테아제 억제제가 보충 완충액 C 1 ㎖를 추가4 ℃에서 하룻밤 동안 40 rpm으로 회전하는 바퀴에 샘플을 품어. 참고 : 염색질의 농도는 적어도 300 μg의는 전사 인자 또는 순차적 칩을 면역 침전 할 수 있어야합니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 표준 </td><td> 농도 (NG / μL) </td><td> 볼륨 (μL) </td><td> 총 DNA 농도 (NG) </td></tr><tr><td> 에이 </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> 비 </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> 기음 </td><td> 2.50 </td><td> 1 </td><td> 2.50 </td></tr><tr><td> 디 </td><td> 1.25 </td><td> 1 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> 이자형 </td><td> 0.625 </td><td> 1 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> 에프 </td><td> 0.3125 </td><td> 1 </td><td> 00.3125 </td></tr><tr><td> 지 </td><td> 0.156 </td><td> 1 </td><td> 0.156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> 표 3. 표준 농도. 4. DNA 용출, 크로스 링크 취소 및 테 K 소화 <ol><li> 자기 랙에 샘플을 설정합니다. 언 바운드 항체 염색질을 포함하는 상층 액을 복구 할 수 있습니다. 주의 : 샘플을 신속하게 스텝 액체 질소에 냉동 -80 ℃에서 저장 될 수있다. 염색질 다른 항체와 다른 면역 분석법에 사용할 수있다. 버퍼 C 1 ㎖ (전술 조작)와 각 샘플 3 회 반복한다. </li><li> 순차 칩 세정 칩의 재료 (표 1)을 수행 할 경우 버퍼 D1 또는 D2의 150 μl를 첨가하여 항체 - 결합 된 단백질을 용출하고, 가열 블럭에서 50 ℃에서 20 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 에서 튜브를 제거가열 블록 및 자기 랙에 샘플을 넣어, (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증) 깨끗한 1.5 ML 튜브에 뜨는을 복구하고 구슬을 버린다. </li><li> 버퍼 C 2 권 제 3 μg의 항체에 1을 가산 순차 칩 상층 액을 사용하여 200 mM의 최종 농도를 얻기 위해 5 M NaCl을 첨가하여 가교 역방향. </li><li> 깨끗한 1.5 ㎖의 튜브에 염색질의 입력 샘플을 제조 (RNA 분해 효소, DNase- 인증 및 발열 성)을 물 150 μL의 최종 부피에서 IP 샘플 (150 μg의)의 것과 염색질 동일한 양의 복용 (의 RNase DNase의 무료 물). 200 mm의 최종 농도 500의 NaCl을 추가합니다. 65 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어. </li><li> 다음날, 가열 블록으로부터 샘플을 분리 칩 재료 250 μg / ML의 최종 농도를 수득하고, 2 시간 동안 55 ° C에서 소화 12.5 mM 내지 티나 제 K를 최종 농도를 얻기 위해 250 mM의 EDTA를 추가 가열 블록. </li></ol><ol><li> 구슬의 준비 <ol><li> 적어도 30 분, 와류에 대한 비드 철저히을 실온에서 비드를 가지고 시작한다. 비즈 정착, 그래서 피펫 팅 할 때 빠르게 작동합니다. 깨끗한 1.5 ML 튜브에 전송 구슬 1 ㎖ (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증). </li><li> 이 솔루션은 명확히하기 위해 3 분, 폐기 뜨는 - 자석에 설정이 기다립니다. 자석에서 제거 0.5 M EDTA 1 ㎖를 추가하고 간단한 텍싱하여 혼합한다. </li><li> 단계를 반복 5.1.2 두 번, 그리고 마지막에 상층 액을 버린다. </li><li> 자석에서 제거 버퍼 E 1 ㎖를 추가하고 천천히 구슬을 재현 탁. 쉐이커에 버퍼 E. 놓고 50 ㎖로 전 혼합 (버퍼 E 구슬)를 전송하고 실온에서 1 시간 동안 서서히 혼합 하였다. </li><li> 비드를 50 μL / DNA (1 부피 / 1 부피) 50 μL, 비드 100 ㎕ : 시험 3의 실험 조건을 이용하여 후술하는 정제 프로토콜 다음 비드 DNA 결합/ DNA의 50 μL (2 권 / 1 볼륨) 및 구슬 125 μL / DNA의 50 μL (2.5 볼륨 / 1 볼륨). 조각 (도 1a)의 크기를 확인하기 위해 1.5 % 아가 로즈 겔에서 정제 된 DNA를 이전하자. </li></ol></li><li> DNA 정제 <ol><li> 각각의 DNA 샘플 (약 170 μL)에 자석 구슬을 결합 DNA의 425 μL (2.5 권)를 추가합니다. 하 (약 10 배)를 피펫 팅에 의해 서서히 재현 탁하고 실온에서 10 분간 배양한다. </li><li> 다음 뜨는 기음과 (자석에) 폐기, 5 분 동안 자석에 놓습니다. </li><li> 1 분, 기음 뜨는를 기다리고 폐기 한 후 한 번 더 이전 단계를 반복 자석에 튜브에 갓 80 % 에탄올 600 μl를 추가합니다. </li><li> 빠른 스핀을주고 5 초 (미세 원심 분리)를 위해, 자석에 튜브를 놓고 에탄올의 마지막 방울을 제거합니다. 실온에서 1 분 동안 건조하자 </li><li> DNase의 자유의 RNase 물 20 μl를 첨가하여 DNA를 용출시킨다. 자석에서 제거하고 샘플을 소용돌이. </li><li> 실온에서 3 분 동안 품어 다음 자석에 샘플을 배치합니다. 새로운 튜브에 대기음 용출 된 DNA는 (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증). </li><li> DNA 단편 (도 1b)의 크기를 확인하기 위해 1.5 % 아가 로즈 겔의 입력 부분으로부터 DNA를 실행. </li></ol></li></ol> 6. DNA 정량은 형광 탐지 장비를 사용하여 <ol><li> 직렬 7 희석 플러스 노 DNA 포인트 (표 3에 모여 희석)의 총을주고 물 1 μg의 DNA를 (1킬로바이트 사다리)에 희석. </li><li> PCR 그린 I 염료 용액을 제조, 모든 샘플 (정제 DNA 및 표준 희석 AH)에 대한 충분한 : 1X TE 버퍼에서 녹색 염료를 10000 희석. </li><li> 모세 혈관의 큐벳에 10 ㎕의 1 배 녹색 염료 믹스 각각의 DNA 샘플 (정제 DNA 및 표준 희석 AH) 1 μl를 추가는 488 nm 파장에서 형광 계에서 읽을 수 있습니다. 무 DNA 분석의 경우, 1X TE 완충액 1 μl를 사용한다. </li><li> 짓다검량선 그래픽 소프트웨어를 사용하여 NG / μL의 DNA 샘플들의 범위에 대한 상대 농도를 결정한다. DNA를 PCR을위한 다음 준비 또는 시퀀싱 라이브러리를 만들 수 있습니다. </li></ol> 7. PCR <ol><li> 프라이머의 선택 <ol><li> 관심의 디자인 프라이머는 관심의 게놈 영역을 심문한다. 프라이머 디자인은 UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 유전자의 인핸서 영역을 증폭한다. 증강은 더 GEO 데이터 세트에서 9 자료 없음 H3K4me1 또는 P300 칩-서열을 이용하여 예측된다. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> 45 사이클 (8 초 ~ 95 ° C, 8 초, 60 ℃, 8 초 72 ° C) 25 μL 녹색 색소 혼합이 NG의 DNA 및 0.5 ㎕를 프라이머 믹스 실시간 PCR 용 열 순환기를 사용하는 실행 PCR 반응 (20 μM 원액) 10. </li></ol></li><li> 농축 분석 <ol><li> 뉴 클레오의 최대 1 %가 11 면역 있다고 가정하고 절대 농축을 계산합니다. </li><li> ConsideR 입력 DNA의 0.1 NG에 비해 10 NG의 IP 샘플이 큰 농축을 보여 주면 농축으로 게놈. </li><li> 비특이적 대조군 샘플과 입력 및 조정을 정상화 비 농후 영역 위에 농축의 배 증가와 같은 결과를 표현한다. </li><li> 입력 DNA가 100 (희석 배수 또는 DF)에 의해 희석 될 것이 좋습니다. </li><li> 코네티컷 [DF X 입력] - 다음의 수학 식 2 -ΔCt × 100 % -ΔCt = 코네티컷 [IP]를 사용하여 입력을 정상화. </li><li> 다음 식을 이용하여 제어를 조정 (ΔCT [IP] -ΔCt [NS]) NS는 비특이적 샘플 (항체없는 IP 또는 IgG의 IP)는이다. </li><li> 2 -ΔΔCt로 샘플의 배 농축을 계산합니다. 각 PCR 샘플 결과의 분석을 용이하게 입력 할 수있는 방식으로 모든 계산 단계를 포함하는 파일. </li></ol></li></ol>

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후성 유전학이 발달 생물학 연구의 중요한 분야가되고있다. 유전 적 프로그램이 배아 혈통 내에서 특정 ID를 인수로 셀 수 있도록 배아 세포에서 활성화하는 방법을 오랜 시간 동안 발달 생물 학자에 대한 핵심적인 질문이었다. 칩은 크게 마지막 년 이내에 사용 순서의 해상도 향상 다음 DNA 염기 서열에 결합하고있다. 이 넓은 의존적으로 게놈의 셀 또는 특정 배아 및 성인 조직의 후생 유전 학적 풍경을 조사하기 위해 강력한 기술이되고있다. 칩 검정 버퍼와 초음파 조건이 크게 생물학적 물질의 소량에 대한 분석을 허용하도록 향상되었다. 이 미세 절제 또는 형광 기자 단백질을 발현 FACS 정렬 된 세포에 의해 얻어진 배아 마음의 특정 지역을 포함한다. 실제로 칩은 이종의 세포 집단 13 14 캔에서 수행해석하기 어려운 잘못된 결과로 이어집니다. 후생 유전 학적 서명 마크는 매우 정확 인구 셀. 그 서명은 그들에게 차별화의 특정 가능성을 부여하고 ...

<html> 심장은 제 장기가 형성 될 상기 배아 기능하게하는 것이다. 심장은 제 1 및 제 2 배아 심장 필드 1에서 발생하는 많은 세포 계통에서 만들어집니다. 후 시비 배반포는 모양의 마음까지 무대에서 배아 세포는 많은 세포 운명 결정을하는 것이 있습니다. 유전자 전사는 시간과 공간에 의존하는 방식으로 규제 및 배아 개발하는 동안 세포 운명 결정의 기초가 중요한 생물학적 과정이다. 이러한 공정은 증강 및 심근 구조적 유전자의 프로모터를 포함하는 게놈 내에서 조절 영역을 특정 결합 전사 인자에 의해 매개된다. DNA는 예컨대 아세틸 화, 메틸화, ubiquitinylation 및 / 또는 인산화와 같은 변형을 실시 히스톤 감싸된다. 히스톤 변형 히스톤의 리신 잔기 (2) 개질 된 따라 활성화 또는 억압 태세 유전자 전사를 이끈다. jove_content &quot;&gt; 염색질 면역 분석법 (칩) 년전 3 설정된 가장 광범위하게 사용되는 기술은 수정 된 히스톤 또는 전사 인자 4. 히스톤 또는 전사 인자의 면역 따라 하나의 타겟을 식별하기 위해 현재, 결합 된 DNA 일 수있다 어느 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 또는 염기 서열. 칩은 기술적으로 어려운 겔 지연 분석법 (5)를 극복하고있다. 그러나 칩 DNA 겔 지연 분석법의 장점에 대한 전사 인자의 결합을 직접적으로 암시하지 않는다. 한편, 칩상의 DNA 염기 서열에 결합하여 유전자 조절에 대한 새로운 게놈 넓은 시각을 열었습니다. ES 세포 (ES 세포) 배양체 내 요점을 되풀이 (즉. 세포 응집체) 또는 2D 배양 심근 6 개발의 초기 단계에서 및 칩 원리 충분한 재료에 제공한다. 또한, 인간 ES 세포는 CA의 인간 세포 모델을 나타낸다자신의 심인성 가능성이 있지만 rdiogenesis은 후생 유전 학적 서명 (7)에 따라 달라집니다. 개발의 나중 단계에서 마우스 배아 조직 세포 정체성의 결정에 필요한 특정 후생 유전 학적 풍경을 조사를 허용합니다. 그러나, 게놈은 시간과 세포 유형 특정 방식으로 8 전사된다. 유전자 전사의 성적인 규제는 지역화 된 영역 내에서 연구되어야한다. 여기서, 우리는 PCR 또는 시퀀싱 ES 세포, 배아 체 심장 특정 배아 영역을 사용하여 다음 칩, 연속 칩의 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 심장 유전자 전사의 후생 유전 학적 조절 조사를 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>포름알데히드&nbsp;</td><td>시그마</td><td>F8775</td><td>세포 고정&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>교차 링크 스톱</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fluka</td><td>10820</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>Leupeptin hemisulfate</td><td>Sigma</td><td>L2882</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>단백질 A 자석 비즈&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>10001D</td><td>Immunoprecipitation</td></tr><tr><td>SPRI 자석 구슬</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>DNA 정제</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>25530-015</td><td>단백질 소화&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA BR 표준&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>교정 범위&nbsp;</td></tr><tr><td>Syber green</td><td>분자 프로브</td><td>S-11484</td><td>DNA 정량화</td></tr><tr><td>TE 버퍼&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>DNA 정량화</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Life technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>세척 DNase RNase 무료 물</td><td>Life technologies</td><td>10977-035</td><td>희석</td></tr><tr><td>Axygen 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP purifiction</td></tr><tr><td>Antibody&nbsp; </td><td>Company</td><td>Reference</td><td>ChIP 농도</td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 &micro; ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직</td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 &micro; ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 &micro; ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 &micro; ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 &micro; ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 &micro; ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; 티슈의 경우 G</td></tr></tbody></table>

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

특정 유전자 전사는 배아 개발하는 동안 세포 운명 결정의 기초가 중요한 생물학적 과정이다. 생물학적 공정은 증강 및 심근 구성 적 유전자의 프로모터를 포함 유전자 조절 영역을 결합 전사 인자에 의해 매개된다. DNA는 화학적 변형을 실시한다 히스톤 주위에 싸여있다. 히스톤의 수정은 추가하여 유전자 전사의 미세 조정 규제의 또 다른 레벨을 가져, 활성화, 억압 또는 태세 유전자 전사로 이어집니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)가 심장 개발의 초기 단계에 배양체 (즉, 세포 집합체) 내에 또는 2D 배양 요점을 되풀이. 그들은 염색질 면역 침전 (칩)를위한 원칙 충분한 재료 제공, 기술은 크게 유전자 조절 영역을 식별하는 데 사용. 또한, 인간 ES 세포 cardiogenesis의 인간 세포 모델을 나타낸다. 개발의 나중 단계에서 마우스 배아 조직을 허용셀 정체성 결정에 필요한 특정 후생 유전 학적 풍경을 조사. 여기서, 우리는 PCR 또는 ES 세포, 배아 체 심장 특정 배아 영역을 사용하여 칩 시퀀싱 뒤에 칩, 연속 칩의 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 심장 유전자 전사의 후생 유전 학적 조절 조사를 할 수 있습니다.

도 1a는 제 DNA 결합 비즈 다른 크기 (1킬로바이트 사다리)의 DNA를 이용하여 품질 관리의 제조를 예시한다. 0ne, 구슬이 2.5 부피 (1 내지 3)는 고 및 저 분자량 크기의 DNA 단편을 정제 할 수있는 샘플의 하나의 볼륨에 첨가 하였다. 도 1 B, C, D는 각각 마우스 ES 세포 또는 배아 체 (25 E9.5 심실 풀링) 배아 심장 영역으로부터 추출한 전체 초음파 DNA로부터 DNA 겔의 전형적인 예이다. ES 세포는 mesendodermal 후 중배엽 상태 내지 제 심장 세포의 운명을 향해 그들이 전송을 구별하는 경우. 이러한 발달 여행은 상피 세포가 epithelio ...

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

분화 중인 배아줄기세포 또는 심장 배아 조직에 이러한 염색질 면역침전법을 적용하는 전반적인 목표는 심장 발달의 후성유전학적 조절 기전을 밝혀내는 것입니다. 배아 심장 발달 과정에서 유전자 전사의 미세 조정은 후성유전학적 성분에 의해 조절되므로, 염색질 면역침전법은 이 과정을 이해하는 데 적합한 접근 방식입니다.이 기술의 주요 장점은 특정 유전자 좌위를 특이적으로 표적화하여 해당 DNA 부위에 존재하는 후성유전학적 표지를 확인할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 심장 발달의 후성유전학적 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 다른 장기나 모든 세포 유형에도 적용 가능합니다.여기에 Imen입니다. 그녀는 연구실의 박사 과정 학생이며, 오늘 실험을 진행할 예정입니다. 이 절차에서는 배아 줄기세포 또는 ES 세포를 사용합니다.ES 세포로부터 생성된 배아체와 E9.5 마우스 배아에서 적출한 배아 심장 조직입니다. 세포와 조직을 고정합니다. 세포에는 PBS 내 1% formaldehyde를 사용하고, 배아 조직에는 PB2 투과화 버퍼를 사용하십시오.튜브를 60 RPM 속도의 오비탈 셰이커에 놓고 상온에서 정확히 10분 동안 반응시킵니다. 최종 농도가 125 millimolar가 되도록 glycine을 첨가하여 가교 반응을 중단시키고, 60 RPM 속도의 오비탈 셰이커에서 상온으로 5분 동안 배양합니다. 이 절차를 시작하려면 펠렛을 10 milliliters의 PBS에 다시 현탁하십시오.그리고 1 mL의 PB2에 배아 조직을 넣습니다. 4 °C에서 1000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 2차 세척을 위해 해당 완충액을 추가합니다.얼음 위에서 버퍼 PB1과 PB2에 프로테아제 억제제를 첨가합니다. 프로테아제 억제제가 첨가된 버퍼 PB1 1 mL를 세포 펠릿에 넣고 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 동일한 방법으로, 프로테아제 억제제가 첨가된 버퍼 PB2 1 mL에 배아 조직을 재현탁합니다.그 후 21-gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기를 사용하여 세포 또는 조직을 균질화합니다. 세포 현탁액을 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 균질화된 세포와 조직을 4 °C에서 10분 동안 배양합니다.4°C에서 3000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 각 펠릿을 프로테아제 억제제가 첨가된 300 µL의 해당 초음파 처리 버퍼에 다시 현탁합니다. DNA 분해를 방지하기 위해 세포 현탁액을 인증된 RNase, DNase 및 파이로젠 프리 튜브로 옮겨 얼음 위에서 15분에서 30분 동안 배양합니다.크로마틴을 전단하기 위해, 각 시료에 적합한 초음파 처리 프로그램을 사용하여 4 °C에서 시료를 초음파 처리합니다. DNA를 PCR 또는 시퀀싱에 사용할 것인지에 따라 초음파 처리 시간을 조정하십시오. 다음으로, 초음파 처리된 세포 용해물을 10분 동안 원심분리합니다.각 샘플에서 용액 상태의 크로마틴인 상층액을 깨끗한 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 펠렛은 제거합니다. 각 샘플의 1.5 microliter 분취액을 취해 물로 1:10으로 희석합니다. 나노 분광광도계로 모든 샘플의 광학 밀도를 측정하여 단백질 농도를 결정합니다.크로마틴 면역침강법을 수행하기 전, 프로토콜 본문에 기술된 방식대로 세척하여 단백질 A 접합 비드를 준비합니다. 깨끗한 1.5 milliliter 튜브에 수식 히스톤 또는 전사 인자에 대해 생성된 항체, 세척된 단백질 A 접합 비드 20 microliters, 그리고 프로테아제 억제제가 첨가된 버퍼 C 1 milliliter를 혼합합니다. 시료를 로테이터 위에서 40 RPM으로 4 degree Celsius에서 최소 2시간 동안 배양합니다.프로토콜 본문에 기술된 대로 1 mL의 버퍼 C로 항체 비드 복합체를 3회 세척합니다. 한 튜브에는 150 µg의 크로마틴 및 항체 비드 복합체를 담고, 다른 튜브에는 150 µg의 크로마틴과 20 µL의 세척된 비드를 담아 두 개의 튜브를 준비합니다. 각 튜브에 프로테아제 억제제가 첨가된 1 mL의 버퍼 C를 넣고, 4 °C의 회전 휠에서 40 RPM으로 하룻밤 동안 배양합니다.밤새 진행한 면역침전이 완료되면, 샘플을 마그네틱 랙에 넣고 결합되지 않은 항체 크로마틴이 포함된 상층액을 회수합니다. 세척된 물질에 150 µL의 buffer D1을 첨가하여 항체 결합 단백질을 용출합니다. 가열 블록에서 샘플을 50 °C로 20분 동안 배양합니다.20분 후, 가열 블록에서 샘플을 꺼내 자석 랙에 놓습니다. 깨끗한 1.5 milliliter 튜브에 상층액을 회수하고 비드는 폐기합니다. 교차결합을 해제하려면, 상층액에 5 molar sodium chloride를 첨가하여 최종 농도가 200 millimolar가 되도록 합니다.깨끗한 1.5 milliliter 튜브에 chromatin 입력 샘플을 준비합니다. 면역침전 샘플과 동일한 양의 chromatin을 RNase 및 DNase free water와 최종 농도 200 millimolar가 되도록 맞춘 5 molar sodium chloride로 희석하여 최종 부피 150 microliters로 맞춥니다. 샘플을 65 degree Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 가열 블록에서 샘플을 꺼냅니다. EDTA를 최종 농도 12.5 millimolar가 되도록 첨가하고 Proteinase K를 최종 농도 250 micrograms per milliliter가 되도록 첨가한 후 55 degree Celsius에서 2시간 동안 소화시킵니다. 비즈를 준비하여 이 절차를 시작하십시오.먼저 비드를 최소 30분 동안 실온에 두어 온도를 맞춥니다. 그 다음 비드를 매우 충분히 볼텍싱하고, 비드 1 mL를 깨끗한 1.5 mL 튜브에 빠르게 분주합니다. 비드가 담긴 튜브를 자석 위에 2~3분 동안 놓아 용액을 투명하게 만든 후 상층액을 제거합니다.튜브를 자석에서 분리합니다. 0.5 M EDTA 1 mL를 첨가하고 짧게 볼텍싱하여 섞습니다. 이 방식으로 비즈를 두 번 세척하고, 마지막 세척 후 상층액을 제거합니다.자석에서 튜브를 제거합니다. Buffer E 1 mL를 첨가하고 비드를 천천히 재현탁합니다. 혼합물 전체를 50 mL의 Buffer E로 옮깁니다. 셰이커에 올려놓고 상온에서 1시간 동안 천천히 혼합합니다.그 후, 1 KB DNA ladder와 세 가지 서로 다른 비드 부피 대 DNA 부피 비율을 사용하여 DNA 결합 비드를 테스트합니다. 2.5/1 비율이 DNA 결합에 가장 적합한 것으로 결정되었습니다. DNA 정제를 위해 비드를 사용하려면, 각 DNA 샘플에 425 µL 또는 2.5배 부피의 비드를 첨가하고 피펫팅으로 약 10회 천천히 재현탁합니다.실온에서 10분 동안 배양합니다. 자석 위에 5분 동안 둡니다. 그다음 상층액을 흡입하여 제거합니다.각 튜브에 600 µL씩 갓 제조한 80% ethanol을 첨가하여 두 번 세척합니다. 1분 동안 기다린 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다. 튜브를 짧게 원심 분리합니다.튜브를 자석 위에 놓습니다. 남은 에탄올 방울을 제거하고 상온에서 1분 동안 건조합니다. 자석에서 샘플을 제거하고 20 µL의 DNase 및 RNase free water를 첨가하여 DNA를 용출합니다. Vortex합니다.마우스 ES 세포, 배아체 및 배아 심장 조직에서 추출한 초음파 처리된 전체 DNA의 역가교 후 획득한 DNA 단편의 크기를 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였습니다. ES 세포가 중배엽 세포 운명으로 분화할 때, 야생형 또는 유전자 변이 세포에서 상피-간엽 이행 유전자의 후성유전학적 조절을 관찰하기 위해 염색질 면역침전 실험을 설계하였습니다. 변형된 히스톤의 결합은 E-Cadherin 및 Twist 유전자의 프로모터 또는 인핸서에 대한 PCR을 통해 모니터링하였습니다.크로마틴 활성화 표지에 대한 항체와 이어서 억제 표지에 대한 항체를 사용하여, 네 가지 인간 ES 세포주에서 추출한 크로마틴에 대해 순차적 크로마틴 면역침강을 수행하였습니다. 이러한 표지들은 세포가 형태 형성 인자에 의해 자극을 받을 때 변형되지만, 인간 ES 세포주에 따라 가변적입니다. 이는 아마도 해당 세포주가 유래된 원래의 배반포 때문일 가능성이 큽니다.염색질 면역침강법은 특정 배아 심장 부위에서 추출한 염색질에도 적용할 수 있습니다. 이 그림은 수정된 히스톤에서 농축된 심장 유전자 Nkx2.5 및 TBx5의 게놈 영역과, 농축되지 않았으며 심실에서 발현되지 않는 Shox2 페이스메이커 특이 유전자의 한 게놈 영역을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때, IP 프로토콜을 시작하기 전 초음파 처리 효율을 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 크로마틴의 개방 또는 폐쇄 상태와 같은 이전 상태를 조사하거나 뉴클레오솜 간격을 모니터링하는 것과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 Eth-ek-se-ek와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 후성유전학 분야의 연구자들은 모든 세포 유형이나 배아 기관에서 세포 운명 결정의 후성유전적 조절을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.이 영상을 시청하신 후에는 크로마틴 면역침전법(chromatin immuno precipitation assay)의 수행 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

epigenetic-regulation-cardiac-differentiation-embryonic-stem-cells

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 ES 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 방법은 안정 cardiogenic 효율성을 단정 표준화된 플랫폼을 제공하고, 다른 세포 lineages의 연구에 적용됩니다.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

in vitro에서 만능 줄기 세포에서 심근 세포를 생성하면 기초 과학 및 임상 응용을 위해 많은 양의 in vitro 심장 조직에 접근할 수 있습니다.  이 프로토콜은 심방화 인자 Grem2를 사용하여 얻은 심근세포의 수를 증가시키고 심방 표현형을 가진 심근세포를 생성합니다.

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

이 프로토콜은 높은 수율, 순도 및 생존력을 가진 성체 마우스 심근세포의 재현 가능한 분리 및 장기 배양을 위한 단계별 방법을 설명합니다.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

배우세요 크로마틴 면역침전법을 이용한 심장 분화의 후성유전적 조절 메커니즘을 배아 줄기 세포와 조직에서 연구하는 방법입니다. 이 기술은 특정 DNA 위치의 후성유전적 표지를 분석하여 심장 발달 과정에서 유전자 전사 조절을 이해하는 데 활용됩니다.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

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