Name: TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 학습하세요 혈액암 치료제 후보를 식별하기 위한 헵타머형 sgRNA 라이브러리 선별 프로토콜입니다. 이 방법은 유전자 편집을 활용하여 새로운 항암 약물 발굴에 활용됩니다.

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이 작품은 대상 중심의 R &amp; D, 일본 과학 기술 진흥기구, 일본의 사립 학교에 대한 홍보 및 공제 Corporation의 과학 연구 진흥 기금을 통해 적응력과 원활한 기술 이전 프로그램에서 지원하고, JSPS KAKENHI ​​그랜트 번호 24300342과 15H04313했다 .

헵 타머 형 1. 건설 sgRNA 도서관 <ol><li> 본격적인 라이브러리의 구축에 사용되지 않는 한, 384 (4-7) -7- NT 시퀀스의 서브 세트를 선택한다. 참고 : 순서는 랜덤 및 / 또는 특정 세포의 RNA를 대상으로 설계 할 수있다. 후자의 경우, 헤어핀 구조 -4,10-의 바로 하류 -7- NT 서열에 상보 적절한 컴퓨터 프로그램 및 / 또는 시각, 선택 시퀀스들을 이용하여 표적 RNA에서의 tRNA의 T 아암 닮은 헤어핀 구조를 찾아 17, 18. </li><li> 로 선택한 heptamers의 각을 합성 완전히 2&#39;- O -methylated, 5&#39;- 및 DNA / RNA 합성과 3&#39;- 인산화 RNA. 제어 된 기공 유리 (CPG) 지지체 상 포스 방법을 사용하여 5&#39;- 말단 4,4&#39;- 디메 톡시 트리 틸 (DMT) 합성의 마지막 사이클에서 (5 &#39;포스페이트를 추가) 보호기를 남겨 23. 참고 : 사용자 정의 한건데nthetic RNA는 뉴클레오티드 공급 업체에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 마지막 합성주기의 완료 후, 8 시간 동안 55 ° C에서이를 1 ㎖의 29 % 암모늄 하이드 록 사이드를 추가 테플론 라이너 스크류 캡이있는 유리 병에 컬럼으로부터 합성 올리고 뉴클레오티드와 CPG를 전송하고, 부화 소비재에서 올리고 뉴클레오티드를 절단하고 기지와 인산염에서 보호 그룹을 제거합니다. </li><li> 40 ° C에서 원심 증발기로 암모늄 히드 록 시드를 증발시키고, 0.2 mL의 0.1 M N-hexylammonium 아세테이트로 올리고 뉴클레오티드를 재용. </li><li> 10~50% 아세토 니트릴 / 0.1 M N-hexylammonium 아세테이트를 함유하는 완충액, 폴리스티렌 - 디 비닐 벤젠 칼럼을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피를 통해 정제하여 합성 올리고 뉴클레오티드. 80 ° C에서 25 분 동안 / 2.0 ml의에서 분 열을 실행합니다. </li><li> 20 % 아세트산 용액을 제조하기 위해 분류 된 샘플 (1-2 ㎖)로 농축 아세트산 0.25-0.5 mL를 넣고 incubaTE, 실온에서 1 시간 동안이 용액은 DMT기를 제거한다. </li><li> 40 ° C에서 원심 증발기를 사용하여 샘​​플을 건조하고 1 ml의 29 % 암모늄 하이드 록 사이드에서 그것을 재 - 용해하고, 5 &#39;포스페이트의 측쇄를 제거하여 실온에서 15 분 동안 용액을 배양한다. </li><li> 40 ° C에서 원심 증발기로 약 0.3 ml의 시료의 부피 (1 ml)로 줄인다. </li><li> 차단 1000을 4 ℃에서 밤새 분자량 투석 튜브를 사용하여 증류수에 대한 전체 농축 샘플 (500 ml)에 투석. </li><li> 그 후, 피펫으로 1.5 ㎖의 튜브로 투석 튜브로 투석 샘플을 이동시켜 40 ℃에서 원심 증발기로 건조하고, 볼륨있는 경우, 물에 대한 주입 등급 물에 재용 더 큰 100 μM 솔루션을 만들기에 충분 작은. </li><li> 분광 광도계로 260 nm에서의 RNA 시료의 광학 밀도를 측정하고 (100)의 농도를 조정물에 대한 주입 등급의 물을 첨가하여 μM. -20 ° C 사용하기 전에 아래의 RNA 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 세포 생존에 대한 sgRNA 도서관 2. 심사 <ol><li> 준비 103 세포 / 99 μL / 웰 (예 : HL60 및 RPMI-8226) 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액이 보충 된 RPMI-1640 배지에서 96 웰 접시. 단지 배경 공제 미디어를 포함하는 우물을 준비합니다. 샘플 우물 주변 우물을 비우 멸균 물을 추가, 가장자리 효과를 제거합니다. </li><li> 각 웰에 물에 대한 주입 수준의 물에 용해 헵 타머 형 sgRNA (100 μM) 1 μl를 추가합니다. 세중 각 sgRNA를 분석. 3 일간 5 % CO 2 가습 배양기에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 각 웰에 시판 WST-8 솔루션의 적절한 볼륨을 추가합니다. 1 내지 4 시간 동안 동일한 인큐베이터에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 흡광도 A를 측정마이크로 플레이트 리더 450 nm의에서 t. 주 : 대부분의 경우, 흡광도 및 생존 세포 수 사이의 선형성 흡광도 값이 1.0를 초과하지 않는 한 유지 될 것으로 보인다. </li></ol> 유동 세포 계측법에 의한 효과적인 sgRNAs 3. 평가 <ol><li> 준비 103 세포 / 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액이 보충 된 RPMI-1640 배지에서 96 웰 접시에 99 μL / 웰 (예 : HL60). 하나 sgRNA가 테스트 될 때까지 적어도 10 우물을 준비합니다. 샘플 우물 주변 우물을 비우 멸균 물을 추가, 가장자리 효과를 제거합니다. </li><li> 각 웰에 물에 대한 주입 수준의 물에 용해 헵 타머 형 sgRNA (100 μM) 1 μl를 추가합니다. 3 일간 5 % CO 2 가습 배양기에서 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 피펫으로 5 ㎖의 튜브에 적어도 10 웰로부터 동일한 sgRNA로 처리 된 세포를 수집한다. 30 원심 분리기에서 5 분 동안 튜브를 스핀0 XG, 미디어를 폐기합니다. </li><li> 튜브로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 2 mL를 넣고 세포를 다시 일시. 300 XG에 원심 분리기에서 5 분 동안 튜브를 스핀, 그리고 PBS를 폐기합니다. 튜브에 1 배 넥신 V 결합 버퍼의 150 μl를 추가하고 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> , 피코 에리 트린의 2 μL (PE) π 공역 넥신 V 용액 튜브 내지 7 aminoactinomycin의 D (7AAD) 액 1 μl를 추가들을 잘 혼합하고, 어둠에서 실온에서 15 분 동안 튜브를 배양한다. (24) 플로우 사이토 미터를 사용하여 샘플을 분석한다. </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences는 heptamer형 sgRNA의 하위 집합에 대한 특허 출원 중입니다.

대부분의 경우, 주사용 물 등급 물(농도 100μM)에 용해된 완전히 2'-O-메틸화, 5'- 및 3'-인산화된 헵타머형 sgRNA는 암세포에서 세포사멸을 유도하는 활성으로 판단하여 최소 1년 동안 -20°C 미만에서 안정적인 것으로 나타난다. 그러나 안정성은 순서, 품질 및 순도에 따라 달라집니다. 어떤 경우에는 질량 분석 분석으로 판단할 때 sgRNA 분자 일부의 5'- 또는 3'-인산염이 보관 중에 자발적으로 제거되는 것으로 보이지만 이는 활성에 심각한 영향을 미치지 않을 수 있습니다.
라이브러리 스크리닝을 통해 히트 sgRNA를 얻으면 DNA 마이크로어레이 및/또는 차세대 시퀀싱을 통한 전사체 분석을 통해 세포 표적 RNA를 찾을 수 있습니다. 그러나, 지금까지 얻은 데이터는 형질감염 시약10,12,14,17,18의 존재 여부에 관계없이 헵타머형 sgRNA를 통한 표적 RNA의 하향 조절 수준이 일반적으로 보통임을 시사한다. 
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(TR Nase Z의 L 후 라 - 유 전자 fficacious 유전자 침묵을 tilizing) TRUE 유전자 침묵은 RNA 지시 유전자 침묵 기술 (1) 중 하나입니다. 이 기술은 개발 tRNase Z L (또는 3 &#39;tRNase), tRNA의 3&#39;처리 endoribonuclease의 속성을 기반으로하고있다 : 그것은을 인식하여 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)의 지시에 따라 어떤 예상 사이트에있는 모든 대상 RNA를 절단 할 수 있습니다 9 - 표적 RNA와 sgRNA (2) 사이에 형성된 프리 tRNA의 형상 또는 마이크로 사전의 tRNA 형 구조. 길이 NT를 일반적으로 7-31이다 sgRNA는 네 그룹, 5&#39;- 절반의 tRNA, 헵 타머 RNA, 14 NT를 선형 RNA, 그리고 훅 RNA로 분류된다. 15 - 우리는 셀 (10) 생활에 다양한 인위적으로 설계 sgRNAs을 도입하여 TRUE 유전자 침묵의 효과를 증명하고있다. 우리는 또한 sgRNAs이 세포 위스콘신에 의해 흡수 될 수 있음을 보여 주었다모든 형질 전환 시약 사전 통 보없이 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간 암세포 (16)에 세포 자멸을 유도 할 수있다 - 18. 21 - TRUE 유전자 침묵은 tRNase Z L과 자연 sgRNAs (19)를 통해 세포 내와 세포 간 유전자 조절 네트워크 시스템에서 작동하도록 나타납니다. 우리는 혈액 암 (22)에 대한 잠재적 인 치료 헵 타머 형 sgRNAs 검색 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 구축했다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 대한 효과를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 그 중 4 마우스 이종 이식 실험에서 종양 성장 속도를 감소시키는 것으로 나타났다. 여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 어떻게 포함세포 생존, 어떻게 더 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가하는 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성합니다. 이러한 프로토콜이 포함되지 않더라도 마우스 이종 이식 모델에서의 셀룰러 sgRNA 표적 RNA를위한 분석 및 sgRNAs 효과의 평가는, 17, 22 종래의 방법에 따라 수행 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>맞춤형 헵타머 RNA</td><td>Nippon Bioservice</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoSep Prep HC 카트리지</td><td>Transgenomic</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>물-주사 등급 물</td><td>Otsuka Pharmaceutical&nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 키트-8</td><td>DOJINDO</td><td>343-07623</td><td>WST-8 용액</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더, Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS 둥근 바닥 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V 결합 버퍼</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>유세포분석기, FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

true 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 rna 라이브러리의 심사

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE 유전자 침묵은 (TR Nase Z의 L 후 라 - 유 전자 fficacious 유전자 침묵 tilizing)의 tRNA 3 &#39;처리 endoribonuclease, tRNase Z L을 안내하는 인공 작은 가이드 RNA (sgRNA)을 이용 기술을 입을 RNA의 지시 유전자 중 하나입니다 , 표적 RNA를 인식한다. sgRNAs 모든 형질 전환 시약없이 세포에 의해 용해 될 수 있고, 그들의 표적 RNA 수준을 하향 조절 및 / 또는 인간의 암세포에서 아폽토시스를 유도 할 수있다. 우리는 인간 골수종 및 백혈병 세포의 생존에 미치는 영향 156 헵 타머 형 sgRNAs 함유 sgRNA 라이브러리를 스크리닝하고 20 효율적으로 암세포의 적어도 하나의 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 발견 하였다. 여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 세포 생존, 그리고 각 sgRNA의 효과를 평가하는 방법 쿵푸를하는 방법 sgRNA 라이브러리를 구성하는 방법을 포함rther는 유동 세포 계측법에 의해 유효 sgRNAs을 평가합니다. 약 2,000 명중은 16,384 heptamers 이루어지는 본격적인 sgRNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어 질 것으로 예상된다.

여섯 헵 타머 형 sgRNAs 5&#39;- AUCUUCA-3 &#39;(H1885), 5&#39;- ACACACA-3&#39;(H3277), 5&#39;- GGGGGCG-3 &#39;(H10927), 5&#39;- GGGGCCC-3&#39;(H10944), 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;(H12287), 및 5&#39;-CACCAGC-3&#39;(H13260)을 화학적으로 3&#39;- 및 5&#39;- 포스페이트를 함유하는 O -2&#39;- 메틸 RNA 합성 하였다. 이러한 sgRNAs은 인간 백혈병 세포주, HL60과 인간 골수종 세포주, RPMI-8226의 생존에 미치는 영향에 대해 조사 하였다. 세포 생존력 분석법 대표 결과.도 1에서 4 개의 sgRNAs H1885, H3277, H10927를...

여기에서 우리는 혈액 암에 대한 잠재적 인 치료 약물에 대한 헵 타머 형 sgRNA 라이브러리의 스크리닝을위한 프로토콜을 제시한다.

TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

이 스크리닝의 전반적인 목표는 혈액암에 대한 잠재적 치료 약물을 찾는 것입니다. 헵타머(Heptamer) 서열의 하위 집합을 선택함으로써 이 절차를 시작하십시오. 서열은 무작위로 선택하거나 특정 세포 RNA를 표적으로 하도록 설계할 수 있습니다. 특정 세포 RNA를 표적으로 하려면 적절한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 표적 RNA에서 T-arm과 유사한 헤어핀 구조를 찾으십시오. 헤어핀 바로 하류의 상보적인 7-뉴클레오타이드 서열을 선택하십시오. 제어 공극 유리(controlled pore glass) 또는 CPG 지지체에서 포스포아미다이트(phosphoramidite) 방법을 사용하여, DNA-RNA 합성기로 선택된 각 헵타머를 2-prime O-메틸화 및 5-prime 및 3-prime 인산화가 완전히 이루어진 RNA로 합성하십시오. 합성의 마지막 사이클에서는 5-prime 말단의 DMT 보호기를 그대로 유지하십시오. 마지막 사이클이 완료되면, 올리고뉴클레오타이드가 합성된 CPG를 컬럼에서 테플론 라이닝 스크류 캡이 있는 유리 바이알로 옮기십시오. 29% ammonium hydroxide 1mL를 첨가하고 튜브를 55

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기 우리는 세포 분열에 관련된 유전자에 대한 높은 처리량 화면에 인간의 esiRNA 라이브러리를 사용합니다. 우리는 설정하고 esiRNA 화면뿐만 아니라, 어떻게 결과를 분석하고 검증을 실시하는 방법을 보여줍니다.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

여기 우리는 세포 생존을 촉진 유전자 표적을 식별하는 방법을 순서 인간 LentiPlex 풀링 라이브러리 전통을 사용합니다. 우리는 설정하고 deconvolute LentiPlex 화면을하고 결과를 확인하는 방법을 보여줍니다.

임무 LentiPlex는 포유 동물 세포에서 shRNA 도서관 검사를 풀링

RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 녹아웃 이상의 많은 장점을 보유하고 광범위하게 유전자 기능 연구의 도구로 사용되었습니다. DNA를 벡터 기반의 RNAi 기술의 발명은 장기적으로 가능한 inducible 유전자 최저했고, 또한 유전자 입을의 가능성을...

암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.

약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

학습하세요 혈액암 치료제 후보를 식별하기 위한 헵타머형 sgRNA 라이브러리 선별 프로토콜입니다. 이 방법은 유전자 편집을 활용하여 새로운 항암 약물 발굴에 활용됩니다.

TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사

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