성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환
2016년 3월 18일
여기에서는 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 변환할 수 있는 새로운 방법을 제시합니다. 이 기술은 후성유전학적 변환을 기반으로 하며, 레트로바이러스 벡터의 사용이나 안정적인 만능 상태의 획득을 포함하지 않습니다. 따라서 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 다능성을 유도하거나 역활력 벡터를 사용하지 않고 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하는 것입니다. 이 방법은 재생 의학 분야, 특히 당뇨병의 세포 치료에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 변환 세포에서 안정적인 만능 상태를 유도하지 않고 레트로바이러스 벡터 없이 표현형에서 스위치를 얻을 수 있다는 것입니다.
이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 박사후 연구원인 Georgia Pennarossa입니다. 이 절차를 시작하려면 35mm 페트리 접시에 1.5ml의 멸균 0.1% 돼지 젤라틴을 넣고 실온에서 2시간 동안 코팅합니다. 다음으로, 2% 항생제 항진균 용액이 보충된 PBS로 인간 피부 생검을 세척합니다.
그런 다음 생검 결과를 100mm 페트리 접시에 넣고 멸균 메스로 약 2입방밀리미터 조각으로 자릅니다. 그런 다음 5-6개의 피부 조각을 미리 코팅된 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 각 단편 위에 섬유아세포 배지 한 방울을 추가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다.
배양 후 6일이 지나면 조직 조각을 조심스럽게 폐기하십시오. 섬유아세포는 조직 조각에서 자라기 시작하여 세포 단층을 형성하기 시작해야 합니다. 이 절차에서 섬유아세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 80% 합류할 때까지 배양합니다.
그런 다음 새로운 배양 접시에 세포를 플레이트합니다. 5% 이산화탄소에 섭씨 37도에서 배양하고 성장 속도에 따라 1-2 및 1-4 사이의 통과 비율을 유지하십시오. 다음으로 세포 배양 접시에 0.1% 돼지 젤라틴을 넣고 2시간 동안 코팅합니다.
섬유아세포를 도금하기 10-30분 전에 과도한 코팅 용액을 제거하십시오. 그런 다음 배양 접시에서 섬유아세포 배양 배지를 제거합니다. 1% 항생제 항진균 용액이 보충된 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
그런 다음 Trypsin-EDTA 용액을 얇게 층을 추가합니다. 세포 단층이 조직 배양 접시의 바닥에서 분리되기 시작하고 세포가 해리될 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다. 그 후, 트립신 작용을 중화하기 위해 세포 현탁액을 섬유아세포 배양 배지의 9개 부분으로 희석합니다.
그런 다음 실온에서 현미경 아래의 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포를 다시 현탁시키고 평방 센티미터당 4번째 섬유아세포의 7.8배인 10배의 세포 농도를 얻는 데 필요한 섬유아세포 배양 배지의 부피를 계산합니다. 그 후, 실온에서 5분 동안 150g에서 세포 현탁액을 원심분리합니다.
그런 다음 상층액을 제거하고 계산된 부피의 섬유아세포 배양 배지로 세포를 다시 현탁시킵니다. 그 후, 0.1% 젤라틴이 미리 코팅된 접시에 세포를 도금하고 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 0일차에 사용 직전에 2.44mg의 5-aza-CR을 10ml의 DMEM 고혈당 배지에 용해시켜 5-aza-CR 원액을 준비합니다.
여과로 살균하십시오. 다음으로, 1마이크로리터의 5-aza-CR 원액을 1ml의 섬유아세포 배양 배지에 희석합니다. 세포 가소성을 높이려면 세포 도금 후 24시간이 지나면 파종된 섬유아세포에서 배양 배지를 제거합니다.
1 마이크로 몰 5-aza-CR 원액을 넣고 5 % 이산화탄소를 섭씨 37도에서 18 시간 동안 배양합니다. 첫째 날에는 새로운 HP 매체를 준비합니다. 1개의 마이크로몰 5-aza-CR로 배양한 후 배지를 제거하고 HP 배지로 세포를 세 번 세척하여 5-aza-CR을 헹굽니다.
그런 다음 5-aza-CR로 처리된 섬유아세포를 HP 배지로 섭씨 37도에서 3시간 동안 5% 이산화탄소에 주입합니다. 5-aza-CR 처리의 효율성을 모니터링하려면 형태학적 변화가 있는지 확인하십시오. 세포는 섬유아세포의 전형적인 길쭉한 형태를 잃고 핵이 확대된 더 작은 원형 또는 타원형 모양을 획득해야 합니다.
1일차부터 6일차까지 췌장 기초 배지(Basal Medium)와 액티브빈(Activin) A 원액을 준비합니다. 그런 다음 Activin A 원액이 보충된 췌장 기저 배지에서 5-aza-CR 처리된 섬유아세포를 5% 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 6일 동안 배양하고 배지를 매일 교체합니다. 7일에서 8일째에 50mg의 레티노산에 16.6ml의 DMSO를 첨가하여 레티노산 원액을 준비합니다.
Activin A 원액과 레티노산 원액을 보충한 췌장 기저 배지에서 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 2일 동안 배양하고 배지를 매일 교체합니다. 9일에서 36일까지, ITS, B27 및 BFGS 스톡 용액이 보충된 세포와 췌장 기저 배지를 배양하고 처음 15일 동안은 배지를 매일 교체하고 16일째부터 격일로 배지를 새로 고칩니다. 섭씨 37도에서 5%이산화탄소로 세포를 배양합니다.
이 그림은 내분비 췌장 분화 과정에서 발생하는 형태학적 변화를 보여줍니다. 유도 7일 후 인간 세포는 점차 무리를 지어 조직됩니다. 레티노산(retinoic acid)의 첨가에 대한 반응으로, 이들은 망상 패턴으로 재배열되고 구별 가능한 응집체로 군집됩니다.
이러한 형성은 시간이 지남에 따라 진행되어 세포를 모집하고 확대된 3D 군체를 응집합니다. 마지막으로, 군체는 배양 배지에서 분리되고 자유롭게 흐르는 경향이 있는 구형 구조가 되어 일반적인 시험관 내 췌장섬을 연상시킵니다. 췌장 유도 36일 후, 인간 후성유전학적 전환 세포의 전체 DNA 메틸화 수준은 처리되지 않은 섬유아세포에서 관찰된 수준으로 돌아왔습니다.
PDX1과 CPEP의 공동 국소화는 전환 기간이 끝날 때 관찰되는 반면, 이러한 내분비 췌장 마커는 처리되지 않은 섬유아세포에서는 전혀 없습니다. 이 그래프는 20 밀리몰 D-글루코스 및 20 밀리몰 L-글루코스 노출에 대한 반응으로 후성유전학적 변환된 세포에서 방출되는 인슐린의 양을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 38일 안에 완료할 수 있습니다.
개발 후 이 연구는 재생 의학 분야의 연구자들이 인간의 당뇨병에 대한 세포 요법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다능성을 유도하거나 레트로바이러스 벡터를 사용하지 않고 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하는 새로운 방법을 제시합니다. 이 기술은 레트로바이러스 벡터의 사용을 피하고 안정적인 전분화 상태를 요구하지 않아 번역 의학을 위한 유망한 접근 방식을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 재생 의학
- 세포 치료
- 당뇨병 연구
배경
- 섬유아세포는 결합 조직에서 흔한 세포입니다.
- 인슐린 분비 세포는 당뇨병 치료에 중요합니다.
- 현재 방법은 종종 전분화성 또는 레트로바이러스 벡터를 포함합니다.
- 더 안전하고 효율적인 세포 전환 기술이 필요합니다.
연구 목적
- 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하는 방법을 개발합니다.
- 전환하는 세포에서 전분화성을 유도하지 않습니다.
- 전환 과정에서 레트로바이러스 벡터의 사용을 제거합니다.
사용된 방법
- 완전히 소독된 돼지 젤라틴으로 페트리 접시를 코팅합니다.
- PBS 및 항생제 용액으로 인간 피부 생검 조직을 세척합니다.
- 섬유아세포의 후성 유전적 전환을 수행합니다.
- 실험실의 박사후 연구원이 절차를 시연합니다.
주요 결과
- 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 성공적으로 전환합니다.
- 시연된 방법은 안정적인 전분화 상태를 유도하지 않습니다.
- 레트로바이러스 벡터의 제거는 안전성을 향상시킵니다.
- 당뇨병 세포 치료에 잠재적인 응용이 있습니다.
결론
- 이 새로운 방법은 세포 치료를 위한 유망한 접근 방식을 제공합니다.
- 기존 기술의 주요 제한 사항을 해결합니다.
- 방법을 최적화하고 검증하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables direct conversion of adult fibroblasts into functional insulin-secreting cells without pluripotency induction or viral vectors, addressing key safety and scalability barriers in diabetes cell therapy. By leveraging transient epigenetic plasticity, it offers a controlled, reproducible pathway for generating therapeutic cell products from accessible adult tissues. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for regenerative medicine pipelines focused on pancreatic beta-cell replacement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epigenetic mechanisms governing cell fate conversion and lineage reprogramming in human fibroblasts.
- Operational Value: Provides a defined, chemical-based system to study transcriptional and epigenetic dynamics during pancreatic differentiation.
- Predictive Value: Supports assessment of insulin secretion competence in response to glucose stimulation as a functional readout for beta-cell maturity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a scalable, human-derived cell model for screening compounds that enhance or inhibit epigenetic reprogramming efficiency.
- Operational Value: Yields insulin-secreting cells with glucose-responsive secretion, enabling functional assays for therapeutic candidate evaluation.
- Assay Readiness: Produces stable, monolayer-derived 3D islet-like clusters suitable for high-content imaging and secretion-based readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates reversal of epigenetic marks post-differentiation, supporting genomic stability assessments critical for translational safety.
- Operational Value: Uses defined, serum-free media supplements (Activin A, retinoic acid, ITS, B27, BFGS) to enable reproducible differentiation across laboratories.
- Predictive Confidence: Co-localization of PDX1 and CPEP provides a measurable biomarker panel for confirming endocrine pancreatic commitment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a human-relevant system for validating epigenetic targets and assessing functional maturation of insulin-secreting phenotypes prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of epigenetic modifiers in directing fibroblast-to-beta-cell lineage conversion without pluripotency intermediates.
- Screening: Supports development of assays to identify small molecules that enhance conversion efficiency or functional maturation.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including insulin secretion levels, DNA methylation dynamics, and marker co-localization for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Establishes a disease-relevant system using human skin-derived fibroblasts, enabling direct assessment of therapeutic potential in diabetes models.
- Enterprise Reuse: The epigenetic priming strategy can be adapted to other lineage conversions, offering a platform approach for regenerative medicine target exploration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by avoiding pluripotency intermediates, clarifying direct epigenetic drivers of lineage switching.
- Operational Value: Employs standardized, reagent-based steps (gelatin coating, defined media, timed inhibitor exposure) supporting protocol reproducibility.
- Strategic Value: Eliminates viral vector use and pluripotency risks, improving safety profile and reducing regulatory complexity for cell therapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on functional insulin output and genomic stability metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, epigenetic modulation, and pancreatic differentiation protocols.
- Depends on access to defined reagents including 5-aza-cytidine, Activin A, retinoic acid, and specialized media supplements.
- Necessitates standardized timing and medium change schedules to maintain epigenetic window and differentiation fidelity.
- Involves monitoring morphological and molecular shifts to confirm conversion efficiency and rule out aberrant states.
- Limited by the finite epigenetic plasticity window, requiring precise temporal control of modifier exposure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Skin Fibroblast Isolation
1:53
Fibroblast Culture and Plating for Epigenetic Conversion
4:00
Increase Cell Plasticity Using the De-methylating Agent 5-aza-CR
5:31
Pancreatic Differentiation Protocol
6:47
Results: Morphological and Functional Changes During Epigenetic Conversion
8:02
Conclusion
