Name: 성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 배우세요 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하는 후성유전적 변환법을. 이 방법은 역바이러스 벡터 없이 안전하게 당뇨병 세포 치료에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 Carraresi 재단과 당뇨병 연구를위한 유럽 재단 (EFSD)에 의해 투자되었다. GP는 밀라노 대학의 후 문서의 교제에 의해 지원됩니다. 후성 유전학과 Periconception 환경과 BM1308 공유 큰 동물 모델에서 진행 비용 조치 (살람) : 저자는 비용 작업 FA1201 Epiconcept의 구성원입니다. TALB은 비용 조치 CM1406 성적인 화학 생물학 (EPICHEM)의 회원입니다.

주의 : 아래에 기재된 모든 절차를 무균 상태에서 층류 후드에서 수행되어야한다. 그들의 처리에 걸쳐 37 ° C에서 모든 문화 절차가 온도 조절 단계에서 수행하는 세포가 유지되어 있는지 확인합니다. 1. 피부 섬유 아세포의 분리 <ol><li> 문화 접시 코팅액을 제조 <ol><li> 물 (최종 농도 0.1 %) 100 ㎖에 돼지 젤라틴 0.1 g을 녹인다. 오토 클레이브와 솔루션을 소독. </li><li> 35mm 배양 접시에 무균 0.1 % 돼지 젤라틴의 1.5 ML을 추가합니다. 실온에서 그들을 유지, 코트에 2 시간을 기다립니다. 주 : 인간의 피부 생검 전완의 앞쪽 양태의 무 혈관 영역에서 국소 마취 절제하여 수거하고, 사용하기 전에 4 ℃에서 2 % 항생제 항진균제 용액이 보충 된 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS)에 저장된다. </li></ol></li><li> 새로운 PBS로 세척 생검은 2 % antibi 보충귀 안티 곰팡이 솔루션입니다. </li><li> 장소 a를 100mm 페트리 접시에 조직 검사와 멸균 메스와 약 2mm 3 조각으로 잘라. </li><li> 단편 도금 직전에 도포 액의 과도한 제거. </li><li> 사전 코팅 35mm 페트리 접시에 5-6 피부 조각을 놓습니다. </li><li> 섬유 아세포 배양 배지를 준비 : 77 % 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 고 글루코스, 20 % 우 태아 혈청 (FBS), 1 % L- 글루타민 용액 및 2 % 항생제 항진균제 용액. </li><li> 5 % CO 2 37 ° C에서 각각의 조각 (조각 당 보통 100 μL), 문화 그들을 섬유 아세포 매체의 방울을 추가합니다. </li><li> 24 시간 후, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 습윤을 유지하기 위해 조각 위에 섬유 아세포 배양 배지 500 μl를 추가한다. </li><li> 적어도 한 번 피펫마다 48 시간과 매체를 변경합니다. </li><li> 배양 6 일 후, 조심스럽게 조직 조각을 제거하고 폐기합니다. 참고 : 6 일 후, 섬유 아세포S는 조직 절편에서 성장하고 세포 단층을 형성하기 시작한다. </li><li> 매체 고침 섬유 아세포 배양액 2 ㎖를 추가 한 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포 단층 배양을 계속한다. </li></ol> 2. 섬유 아세포 문화 <ol><li> 37 ° C에서 배양 섬유 아세포 5 % CO 2에서 80 %의 합류까지 </li><li> 조직 배양 접시에서 계대, 흡인 섬유 아세포 배양 배지하십시오. PBS의 4 ㎖로 세포를 세 번 씻으 1 % 항생제 항진균제 용액으로 보충. </li><li> 트립신 EDTA 수용액 (0.5 g / 리터 돼지 트립신 및 0.2 g / L EDTA)의 얇은 층 (배양 배지 용적의 10 %)를 첨가하고, 세포 단층을 조직의 바닥으로부터 분리되기 시작할 때까지 37 ° C 부화 배양 접시에 세포를 떼어 놓다. </li><li> 트립신 작용을 중화 섬유 아세포 배지 9 부를 세포 현탁액을 희석. 원심 분리는 필요하지 않습니다. </li><li> 새로운 배양 접시에서 플레이트 세포 (와젤라틴 아웃)과 문화 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서. 성장 속도에 따라, 4 : 2, 1 : 1 사이의 통로 비율을 유지한다. </li><li> 세포 (주당 보통 회) 약 80 %의 합류 통로를 도달하면. </li></ol> 성적인 변환 3. 섬유 아세포 도금 <ol><li> 세포 배양 접시에 0.26 ㎖ / 0.1 % 돼지 젤라틴 cm 2 (1.1에 설명 된대로 준비) 추가합니다. 코트에 2 시간을 기다립니다. </li><li> 섬유 아 세포를 도금하기 전에 도포 액을 초과하는 10 ~ 30 분을 제거합니다. </li><li> 배양 접시에서 섬유 아세포 배양 배지를 제거합니다. PBS로 세포를 세 번 씻으 1 % 항생제 항진균제 용액으로 보충. </li><li> 트립신 EDTA 수용액 (0.5 g / 리터 돼지 트립신 및 0.2 g / L EDTA)의 얇은 층 (배양 배지 용적의 10 %)를 첨가하고, 세포 단층을 조직의 바닥으로부터 분리되기 시작할 때까지 37 ° C 부화 배양 접시에 세포를 떼어 놓다. </li><li> fibrobl 9 부분으로 세포 현탁액을 희석AST 배지는 트립신 중화 작용. </li><li> 실온에서 현미경 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 계산. / ㎠ 7.8 × 104 섬유 아세포의 세포 농도를 얻기 위해, 세포를 재현 탁하는 섬유 아세포 배양액의 필요한 부피를 계산한다. 이것은 사용 챔버의 특정 유형에 의존 할 것이다. 셀 / μL = 작은 그리드 X 90 (곱셈) × 희석 당 세포의 평균 수 </li><li> 실온에서 5 분 동안 150g로 원심 분리 세포 현탁액. 섬유 아세포 배지 이전에 계산 된 양으로 재현 탁하고 세포 상등액을 제거한다. </li><li> 0.1 % 젤라틴 미리 코팅 요리와 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 문화를 접시에 세포. </li></ol> 탈 메틸화 에이전트 5 아자 - CR을 사용하여 4. 증가 셀 소성 <ol><li> 날 0 <ol><li> DMEM 고 글루코스 메디칼 10ml에 5- 아자 CR 2.44 mg을 용해시켜 5- 아자 - CR 원액을 준비음. 여과 소독. 바로 사용하기 전에 5 아자 - CR 주식을 준비합니다. </li><li> 섬유 아세포 배양 배지 (최종 농도 1 μM) 1 ㎖에 5 아자 CR 원액 1 μl를 희석. </li><li> 세포의 가소성, 세포 도금 (소호 3.8) 후 24 시간을 늘리려면 시드 섬유 아 세포에서 배지를 제거하고 CO 2 배양기 5 %에서 37 ° C에서 18 시간 동안 1 μM 5 아자 - CR 원액과 문화를 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 표 1에 기재된 바와 같이 신선한 인간 다 능성 (HP) 배지를 준비한다. </li><li> 1 μM 5 아자 CR 함께 배양 한 결과, 5- 아자 - CR 멀리 세정되도록 PBS로 3 회 배지를 제거하고 세포를 세척한다. </li><li> 부화 -5- 아자 - CR 5 % CO 2에서 37 ℃에서 3 시간 (회복 기간)에 대한 HP 매체 처리 아세포. </li><li> 회복 기간 후, 중간 제거 PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 5- 아자 - CR 처리의 효율을 모니터링하기 위해,이 단계 f 체크인또는 형태 학적 변화의 존재는 (결과 섹션에 설명). 세포는 섬유 아세포의 전형적인 긴 형태를 잃고 확대 핵으로, 크기가 작아지고, 원형 또는 타원형 모양을 취득. </li><li> 췌장 분화를 진행합니다. </li></ol></li></ol> 5. 췌장 분화 프로토콜 <ol><li> 일 1-6 <ol><li> 표 2에 기술 된 바와 같이 췌장 기초 배지를 준비합니다. </li><li> 원액을 티빈 준비 : 멸균의 166.6 μL에서 재조합 인간 단백질을 티빈의 5 μg의 용해. </li><li> 배양 5 아자 CR 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 6일 위해 (5.1.2 참조) 1 μL / ㎖ 액 티빈 원액 보충 0.26 ㎖ / cm 췌장 기초 배지 2에서 섬유 아세포를 처리 하였다. 매체 매일을 변경합니다. </li></ol></li><li> 일 7-8 <ol><li> 레티노 ACI 50 mg의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 16.6 ml에 첨가하여 레티노 산 원액을 준비디. </li><li> 췌장 기초 배지 0.26 ㎖ / cm 2 배양 세포는 1 μL / ㎖ 37 ℃에서 원액 (5.1.2 참조) 2 일간 1 μL / ㎖ 레티노 산 원액을 (5.2.1 참조) 티빈 C 보충 5 %의 CO 2. 매체 매일을 변경합니다. </li></ol></li><li> 일 9-36 <ol><li> 췌장 기초 배지 0.26 ㎖ / cm 2 배양 세포 (v / v)의 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 (ITS), 2 % (v / v)의 B27 0.1 % (v / v)의 재조합 인간 FGF 기본 1 %로 보충 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 (bFGF의) 원액 (표 1 참조). 처음 15 일 동안 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 이후 하루에 16에서, 배양 접시의 바닥에서 분리 할 수​​ 있습니다 집계 세포를 형성하기 때문에, 현미경, 매일 매체를 새로 고칩니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475, 386-389 (2011).</li>
<li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Lineage+Conversion+of+Terminally+Differentiated+Hepatocytes+to+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Pig+Dermal+Fibroblast+into+Insulin+Secreting+Cells+by+a+Brief+Exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

본 논문은 조직 특이 적, 유도 프로토콜이어서 5- 아자 CR에 과도 짧은 노광, 인슐린 생산 세포에 인간의 피부 섬유 아세포의 변환을 허용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 전사 인자 또는 마이크로 RNA의 강제 표현이나 세포가 더 불안정하고 실수 (14)하는 경향이 있습니다 안정적인 만능 상태의 취득없이, 중배엽에서 내배엽과 관련된 세포로 전환 할 수 있습니다. 첫 번째 단계에서, 세포 가소성 말단 분화 세포에 일시적, 가역적 허용 상태를 유도하는 합성 후생 유전 학적 개질제로 확실히 증가한다. 특히, 5- 아자 - CR은 피부 섬유 아세포의 전체 메틸화의 감소를 야기하기 위해 사용되었다. 5- 아자 CR 직접 메틸 전이 효소의 활성을 억제하고, 새로 합성 된 DNA 메틸화에 새로이를 방지하는 것으로 알려져있다. 때문에 그 효과,이 분자이전 자동 유전자를 활성화 할뿐만 아니라 15,16 진핵 세포의 분화 상태를 변경하는...

재생 의료의 기본적인 목적은 수리되거나 손상된 대체 할 수있는 새로운 기능성 세포의 세대, 조직 변성. 다른 하나의 세포 유형에서 그들을 변환하여, 새로운에 쉽게 사용할 성인 세포 개조하기 필요한 세포 집단 액세스가 풍부하거나 어렵지 않다 특히, 특히 매력적인 방법이다. 그러나, 성인 세포는 매우 안정하다. 그들은 성숙한 터미널 전문화에 도달하면, 그들은 안정적는 1을 유지, 자신의 선택에 점진적으로 제한을 통해 차별화 된 상태를 취득합니다. 체세포 (IPS)의 다 능성을 재 프로그래밍을 가능하게하는 프로토콜 번호가 개발되었으며 최근 년에 전사 세트 2,3- 요인의 강제 발현을 통해 달성. 또한, 셀 변환 (4) 하나를 소개, 직접 혈통의 분화에 의해 얻을 수있다 </sup는&gt; 또는 전사의 조합은 5-7 요인. 이 전략은 역 분화 상태를 통해 전환을 포함하지만, 특정 전사가 8 요인의 고 발현을 필요로하지 않습니다. 우리는 최근 시티 딘 유사체 5- 아자 시티 딘 (5 아자 - CR), 잘 특징 DNA의 메틸화 억제제의 탈 메틸화 특성 성체 세포의 짧은 노출에 기초하여 변환 프로토콜을 개발했다. 탈 메틸화 단계는 즉시 필요한 단말 표현형을 얻을 수있는 특정 분화 프로토콜 9-11 따른다. 이 방법은 다른 혈통의 세포로 성숙, 분화 세포로 변환 할 수 있으며, 바이러스 벡터의 사용 및 외인성 전사 인자의 형질을 모두 회피하는 상당한 이점을 갖는다. 안정적인 만능 상태의 취득 및 불안정성을 셀에 관련 증가 감수성도 피할 수있다. <p class=&quot;jove_content&quot;&gt; 여기에 제시되는 모든 기능 인슐린 분비 세포로 성인 인간의 피부 섬유 아세포의 전환을 할 수 있습니다 자세한 프로토콜입니다. 그러나, 본 기술은 상이한 유형의 세포에 적용된 다양한 분화 세포를 향해 경로를 다루는 경우, 긍정적 인 결과를 생성 한 것을 주목할 가치가있다. 또한, 후생 유전 학적 변환이 성공적으로 인간 및 돼지 9-13 종뿐만 아니라 개에서 사용 된 방법의 다양한 효능과 안정성을 제안 (원고 제출).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS; 세포 세척 및 용액 준비용</td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>섬유아세포, HP 및 췌장 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>100 mm 페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>섬유아세포 분리용</td></tr><tr><td>돼지 젤라틴</td><td>시그마</td><td>G1890</td><td>접시 코팅용</td></tr><tr><td>물</td><td>: 시그마</td><td>W3500</td><td>용액 준비</td></tr><tr><td>용 35mm 페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>섬유 아세포 분리</td></tr><tr><td>DMEM, 고 포도당, 피루브 산</td><td>생명 기술</td><td>41966052</td><td>섬유 아세포 배양 매체</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>생명 기술</td><td>10500064</td><td>FBS; 섬유 아세포 및 HP 매체</td></tr><tr><td>L-글루타민 용액</td>의 구성 <td>요소 Sigma</td><td>G7513</td><td>섬유 아세포, HP 및 췌장 매체</td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액</td><td></td><td></td>의 구성 요소 섬유 <td>아세포 해리용</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10</td> 그리드 <td>포함 Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>5-Azacytidine</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, increrase 세포용 섬유아세포의 가소성</td></tr><tr><td>Ham's F-10 영양 혼합물</td><td>Life Technologies</td><td>31550031</td><td>HP 매체</td></tr><tr><td>DMEM, 저포도당, 피루브산</td>용 <td>Life Technologies</td><td>31885023</td><td>HP 매체</td></tr><tr><td>녹아웃 혈청 교체</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>HP 매체</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 솔루션의</td> 구성 요소 <td>Life Technologies</td><td>11140035</td><td>HP 및 췌장 기저 매체의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>M7522</td><td>HP 및 췌장 기초 매체의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>구아노신</td><td>시그마</td><td>G6264</td><td>뉴클레오시드 믹스 원료 HP 매체의 성분</td></tr><tr><td>아데노신</td><td>시그마</td><td>A4036</td><td>뉴클레오시드 믹스 원료 HP 매체의</td></tr> 시<tr><td>티딘</td><td>시그마</td><td>C4654</td><td>뉴클레오시드 믹스 원료 성분 HP 매체</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td>HP 매체</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T1895</td><td>뉴클레오시드 믹스 원료 성분 HP 매체</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &micro의 뉴클레오시드 혼합 원료 성분; m</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>용액</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) 재조합 인간 단백질</td><td>생명 기술</td><td>PHG0261</td><td>bFGF의 살균을 위해; HP 및 췌장 기저 매체</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A3311</td> BSA의 구성 요소<td>; 췌장 기저 매체의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>DMEM / F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320074</td><td>췌장 기초 매체</td></tr><tr><td>B-27 보충제 마이너스 비타민 A</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>12587010</td><td>췌장 매체</td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>17502048</td><td>췌장 기초 매체</td></tr><tr><td>액티빈 A 재조합 인간 단백질</td><td>라이프 테크</td>놀로지스의 구성 요소<td>PHG9014</td><td>췌장 매체</td></tr><tr><td>레티노산</td><td>시그마</td><td>R2625</td><td>췌장 매체</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td>DMSO; 레티노산 재고 준비</td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄</td><td>생명 기술</td><td>41400045</td><td>ITS; 췌장 최종 매체</td></tr><tr><td>항-바이멘틴 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:100</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>시그마</td><td>32670</td><td>DAPI. 면역세포화학 분석용. 작업 희석&nbsp; 1 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>5-메틸시티딘</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:500</td></tr><tr><td>Anti-C 펩타이드 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:100</td></tr><tr><td>Anti-PDX1 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>면역세포화학 분석기용. 작동 희석 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia 인슐린 ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>인슐린 방출 감지용</td></tr></tbody></table>

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

재생 의학은 퇴화되거나 손상된 조직을 복구하기 위해 환자에게 전달되는 완전히 기능하는 새로운 세포를 필요로 합니다. 이러한 세포를 쉽게 사용할 수 없는 경우, 많은 것 중에서 재프로그래밍(reprogramming) 및 트랜스-분화(trans-differentiation)를 포함하는 다양한 접근법을 사용하여 얻을 수 있으며, 이는 서로 다른 기술에 특이적인 장점과 한계를 가지고 있습니다. 여기에서는 성숙한 성숙한 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하기 위한 새로운 전략이 설명되며, 이는 임의로 후성유전학적 전환세포(EpiCC)로 지정됩니다. 이 방법은 세포 운명의 후성유전학적 조절과 분화를 제어하는 메커니즘에 대한 이해가 높아짐에 따라 개발되었습니다. 특히, 첫 번째 단계는 후성유전학적 변형자, 즉 5-아자-시티딘을 사용하여 성체 세포를 "매우 허용적인" 상태로 만듭니다. 그런 다음 이 짧고 되돌릴 수 있는 후성유전학적 가소성의 창을 활용하여 세포를 다른 계통으로 다시 처리합니다. 이 접근법은 "후성유전학적 세포 전환"이라고 명명됩니다. 이는 효율적이고 제어되며 안정적인 세포 계간 스위치를 얻을 수 있는 간단하고 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 유전자 transfection의 사용을 포함하지 않기 때문에 바이러스 벡터가 없고 안정적인 만능 상태를 포함하지 않기 때문에 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.

피부 생검에서 차 문화의 설립 피부 생검은 작은 조각으로 잘라 젤라틴 미리 코팅 요리에 넣었다. 육일 후, 섬유 아세포는 조직 조각에서 성장하기 시작하고 세포 단층 (그림 1A)을 형성했다. 세포는 전형적인 긴 형태를 보여, 예상대로 섬유 아세포 특정 마커 멘틴 (빔, 그림 1B)의 균일 한 면역 양성을 표시. 5 아자 - CR에 18 시간 노출 후 피부 섬유 아 세포의 형태 학적 변화와 메틸화 패턴 인슐린 분비 세포로 섬유 아세포의 성공적인 후생 유전 학적 변환을 얻으려면, 우리는 탈 메틸 화제, 5 아자 - CR을 사용하여 가소성을 증가했다. 인간 섬유 아세포를 7.8 × 104 아세포 / ㎠의 농도로 0.1 % 젤라틴 프레 코트 접...

여기에서는 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 변환할 수 있는 새로운 방법을 제시합니다. 이 기술은 후성유전학적 변환을 기반으로 하며, 레트로바이러스 벡터의 사용이나 안정적인 만능 상태의 획득을 포함하지 않습니다. 따라서 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

이 절차의 전반적인 목표는 다능성 유도나 레트로바이러스 벡터의 사용 없이 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하는 것입니다. 이 방법은 재생 의학 분야, 특히 당뇨병의 세포 치료와 관련된 핵심 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전환되는 세포에서 안정적인 다능성 상태를 유도하지 않고, 레트로바이러스 벡터 없이도 표현형의 전환을 유도할 수 있다는 점입니다.이 실험 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Georgia Pennarossa가 시연하겠습니다. 먼저, 35mm 페트리 접시에 멸균된 0.1% porcine gelatin 1.5 mL를 넣고 실온에서 2시간 동안 코팅되도록 둡니다. 그다음, 2% antibiotic antimycotic solution이 첨가된 PBS로 인간 피부 생검 조직을 세척합니다.그 후, 생검 조직을 100-millimeter 페트리 접시에 넣고 멸균된 메스를 사용하여 약 2 cubic millimeter 크기의 조각으로 자릅니다. 그런 다음, 5~6개의 피부 조각을 미리 코팅된 35-millimeter 페트리 접시에 넣습니다. 각 조각 위에 섬유아세포 배지를 한 방울씩 가하고 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다.6일간 배양한 후, 조직 조각을 조심스럽게 제거합니다. 섬유아세포가 조직 조각 밖으로 자라나기 시작하며 세포 단층을 형성하게 됩니다. 이 과정에서 섬유아세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 80% confluence에 도달할 때까지 배양하십시오.그 다음 세포를 새로운 배양 접시에 분주합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하며, 성장 속도에 따라 계대 배수 비율을 1:2에서 1:4 사이로 유지합니다. 이어서, 세포 배양 접시에 0.1% 돼지 젤라틴을 첨가하고 2시간 동안 코팅합니다.섬유아세포를 분주하기 10분에서 30분 전에 과잉의 코팅 용액을 제거합니다. 그런 다음, 배양 접시에서 섬유아세포 배양액을 제거합니다. 1% 항생제-항진균제 용액이 첨가된 PBS로 세포를 3회 세척합니다.그 다음, Trypsin-EDTA 용액을 얇게 층을 이루도록 첨가합니다. 세포 단층이 조직 배양 접시 바닥에서 떨어지기 시작하고 세포들이 분리될 때까지 37 °C에서 배양합니다. 그 후, 트립신의 작용을 중화시키기 위해 세포 현탁액을 섬유아세포 배양 배지 9부피로 희석합니다.그런 다음, 실온에서 현미경으로 카운팅 챔버를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포를 재현탁하여 cm²당 7.8 × 10⁴개의 섬유아세포 농도를 얻는 데 필요한 섬유아세포 배양 배지의 부피를 계산합니다. 이어서, 세포 현탁액을 실온에서 150 g로 5분 동안 원심 분리합니다.그 다음, 상층액을 제거하고 계산된 부피의 섬유아세포 배양 배지로 세포를 재현탁합니다. 이후, 0.1% gelatin이 사전 코팅된 디시에 세포를 분주하고 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 0일 차에, 사용 직전에 2.44 mg의 5-aza-CR을 10 mL의 DMEM high glucose 배지에 녹여 5-aza-CR 스톡 용액을 준비합니다.여과를 통해 멸균합니다. 다음으로, 1 µL의 5-aza-CR 스톡 용액을 1 mL의 섬유아세포 배양액에 희석합니다. 세포 가소성을 높이기 위해, 세포 도말 24시간 후 파종된 섬유아세포로부터 배양액을 제거합니다.1 µM 5-aza-CR 스톡 용액을 첨가하고, 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 18시간 동안 배양합니다. 1일 차에 신선한 HP 배지를 준비합니다. 1 µM 5-aza-CR과 함께 배양한 후, 배지를 제거하고 HP 배지로 세포를 3회 세척하여 5-aza-CR이 완전히 제거되도록 합니다.그 다음, 5-aza-CR로 처리된 섬유아세포를 HP 배지가 포함된 상태로 37°C, 5% CO₂ 환경에서 3시간 동안 배양합니다. 5-aza-CR 처리 효율을 모니터링하기 위해 형태학적 변화가 있는지 확인합니다. 세포는 섬유아세포 특유의 길쭉한 형태를 잃고, 핵이 커지면서 더 작은 원형 또는 타원형의 모양을 띠게 되어야 합니다.1일부터 6일까지, 췌장 기초 배지(pancreatic Basal Medium)와 Activin A 스톡 용액을 준비합니다. 그 다음, 5-aza-CR 처리된 섬유아세포를 Activin A 스톡 용액이 첨가된 췌장 기초 배지에서 37 °C, 5% carbon dioxide 조건으로 6일 동안 배양하며 배지를 매일 교체합니다. 7일부터 8일까지, 50 mg의 레티노산(retinoic acid)에 16.6 mL의 DMSO를 첨가하여 레티노산 스톡 용액을 준비합니다.Activin A 스톡 용액과 레티노산 스톡 용액이 첨가된 췌장 기초 배지(pancreatic Basal Medium)에서 37 °C, 5% CO₂ 조건으로 2일 동안 세포를 배양하며, 배지는 매일 교체합니다. 9일 차부터 36일 차까지는 ITS, B27 및 BFGS 스톡 용액이 첨가된 췌장 기초 배지에서 세포를 배양하며, 처음 15일 동안은 매일 배지를 교체하고 16일 차부터는 격일로 배지를 교체합니다. 세포는 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다.이 그림은 내분비 췌장 분화 과정 중에 일어나는 형태학적 변화를 보여줍니다. 유도 후 7일이 지나면 인간 세포들이 점차 클러스터 형태로 조직됩니다. 레티노산 첨가에 반응하여, 세포들은 그물망 패턴으로 재배열되며 구별 가능한 응집체로 클러스터를 형성합니다.이러한 형성물들은 시간이 지남에 따라 진행되며, 세포를 모집하고 확대된 3D 콜로니를 응집시킵니다. 최종적으로 콜로니는 구형 구조가 되어 배양액 내에서 떨어져 나와 자유롭게 흐르는 경향을 보이며, 이는 전형적인 인비트로(in vitro) 췌도와 유사합니다. 췌장 유도 36일 후, 인간 후성유전적 전환 세포의 전체 DNA 메틸화 수준은 처리되지 않은 섬유아세포에서 관찰된 수준으로 돌아왔습니다.PDX1과 CPEP의 공동 국소화는 전환 기간의 끝에서 관찰되며, 이러한 내분비 췌장 마커들은 처리되지 않은 섬유아세포에서는 완전히 나타나지 않습니다. 이 그래프는 20 millimolar D-glucose 및 20 millimolar L-glucose 노출에 반응하여 후성유전학적으로 전환된 세포에서 방출되는 인슐린의 양을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 38일 만에 완료할 수 있습니다.이 연구는 개발 이후 재생 의학 분야의 연구자들이 인간의 당뇨병 세포 치료를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 다능성을 유도하거나 레트로바이러스 벡터를 사용하지 않고 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

epigenetic-conversion-as-safe-simple-method-to-obtain-insulin

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

직접 신경 프로그래밍 시작 체세포의 나이 유지 하는 신경 세포 생성 합니다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자 로부터 얻은 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경 세포를 생성 하는 단일 벡터 기반 방법을 설명 합니다.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

우리는 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간의 피부 유래 섬유 아세포와 유도 된 천체 세포 (iA)로 후속 분화를 재프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 대량으로 iNPC 및 iA의 빠르고 재현 가능한 생성으로 이어집니다.

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.

마우스 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍

줄기세포를 섬세포로 분화하는 것은 기존의 당뇨병 치료 및 질병 모델링에 대한 대안을 제공합니다. 상용 분화 키트와 이전에 검증된 방법을 결합하여 접시에서 인슐린 분비, 줄기 세포 유래 섬을 생성하는 데 도움이 되는 자세한 줄기 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

배우세요 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하는 후성유전적 변환법을. 이 방법은 역바이러스 벡터 없이 안전하게 당뇨병 세포 치료에 활용할 수 있습니다.

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

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