Name: 완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 배우세요 완두콩 진딧물(Acyrthosiphon pisum) 태아의 전체 면역 염색법을 통해 조직 투과성을 높이고 배경 염색을 감소시키는 최적 조건을 확인하는 방법입니다. 이 기술은 단백질 발현 검출을 개선하여 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

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단클론 4D9 항체를 제공해 주신 Chau-Ti Ting(대만의 Fly Core)님, 컨포칼 현미경을 제공해 주신 NTU 생명과학대학의 Technology Commons(TechComm), 원고 교정을 해주신 Hsiao-Ling Lu님, 촬영을 도와주신 Chen-yo Chung님께 감사드립니다. CC는 특히 전략적 제안을 제공하고 원고를 비판적으로 편집한 Charles E. Cook에게 감사를 표합니다. 이 연구는 과학기술부(GWL 및 CC의 경우 101-2313-B-002-059-MY3 및 104-2313-B-002-022-MY3)와 국립대만대학교(CC의 경우 NTU-CESRP 101R4602D3, GWL의 경우 103R4000)의 지원을 받았습니다.

진딧물 1. 문화 참고 :. 처녀 생식 태생 완두콩 진딧물의 실험실 변형 pisum는 원래 중앙 대만에서 수집 된 300 개 이상의 세대에 긴 일 광주에서 기주 식물 (정원 완두콩 Pisum의 속 sativum 또는 광범위 한 콩 잠두)에서 사육 된 (한 세대 : ~ 10 일). <ol><li> 씨앗의 발아 <ol><li> RT 3-5 일 동안 수돗물에 기주 식물의 씨앗을 만끽 해보세요. 하루에 한 번 신선한 물을 채우십시오. 참고 : 또는 직선 습한 토양에 기주 식물의 씨앗을 퍼팅뿐만 아니라 발아를 유도 할 수있다. </li><li> 광주 16 시간 조명 / 20 ° C에서 8 시간의 어둠에서 성장 챔버에서 토양과 작은 냄비 (9cm 지름 X 7cm 높이) 10 발아 씨앗을 성장. </li><li> 성장이 시작 약 10 일 후에, 그 높이보다 8cm입니다 식물에 진딧물을 전송합니다. </li></ol></li><li> 진딧물의 전송 <oL&gt; <li> , 1 리터 유리 비커 내에서 식물의 각각의 냄비를 유지 붓을 사용하여 식물에 8 성인 진딧물을 전송 한 다음 탈출 진딧물을 방지하기 위해 거즈 메쉬로 통기성 커​​버 비커를 밀봉. </li><li> 광주 16 시간 조명 / 20 ° C에서 8 시간의 어둠에서 성장 챔버에서 진딧물을 품어. 매일 하루에 한 번 식물의 각 공장 냄비에 물을. </li><li> 진딧물 차세대 얻는 단계 1.1.3-1.2.2 십일 차 전사 후 진딧물을 유지한다. </li></ol></li></ol> 2. 해부 및 난소의 고정 <ol><li> 갓 고정 버퍼로서 1X 인산 완충 식염수 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비한다. </li><li> PFA (약 500 μL)에 자리 판 잘 하나 채우기, 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 접시를 놓고 해부에 대한 PFA 내 성인 진딧물 잠수함. </li><li> , 포셉 한 세트와 머리와 복부를 유지하는 등의 오픈 절단하여 난소를 해부하다복부의 표피 및 복강에서 멀리 난소를 드래그. </li><li> 20 분 동안 실온에서 PFA 1 ㎖를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 난소 세 쌍 수정. </li><li> 전송 피펫 (유리 하나 또는 일회용) 1X PBS에서 0.2 % 트리톤-100 (PBST) 10 분 각 3 회와 난소를 세척 후와와 디 캔트 고정 버퍼입니다. 마일드 (회전 각도 : 60 ° (F60) / 회전 속도 : 8 RPM) 믹서 / 회전에 떨고하는 고정 및 세척을 모두 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. 테 K (PK)과 치료는 배아 조직의 투과성을 증가 참고 : PK 처리 이후 세균 밴드 확장 (단계 개발의 11)에서 배아에 적용됩니다. 젊은 배아의 경우,이 단계는 선택 사항입니다. <ol><li> 직렬 작업 1 μg의 농도 / ㎖로 1X PBS와 PK의 스톡 용액 (10 ㎎ / ㎖)을 희석. </li><li> 가벼운 흔들림과 함께 10 분 동안 PK (약 500 μL)의 1 μg의 / ㎖과 난소를 품어. </li><li> 가만히 따르다 PK의 soluti다음 글리신의 700 μL (2 ㎎ / ㎖) 5 분마다 3 번과 난소를 씻어에. </li><li> 10 분마다 두 번 0.2 % PBST로 난소를 씻으십시오. </li><li> 가벼운 흔들림으로 실온에서 15 분 동안 고정 버퍼 다시 난소를 수정합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 10 분마다 두 번 0.2 % PBST로 난소를 씻는다. </li></ol> 4. 메탄올 배양 내인성 과산화 효소를 억제 (POD) 활동에 대한 참고 : 메탄올 배양 메탄올 민감 Phalloidin의 염색 또는 항체 항원 결정기를 실시 배아에 적용되지 않습니다. <ol><li> 직렬 PBST 0.2 % 메탄올의 다른 비율로 난소 탈수 (3 : 1 : 1, 3 : V / V 1) 온화한 교반과 함께 10 분 동안 메탄올 용액의 각 농도에서 배양함으로써 난소. </li><li> 온화한 교반과 함께 RT에서 1 시간 동안 100 % 메탄올로 난소 탈수. 주 : 염색의 만족스러운 결과는 여전히 100 % 메탄올에 저장되었다 진딧물 조직으로부터 얻을 수 -20# 176; C 1 개월. </li><li> 직렬 PBST 0.2 % 메탄올의 다른 비율로 난소 재수 (1 : 1 : 3 1, 1, V / V 3) 온화한 교반과 함께 10 분 동안 메탄올 용액의 각 농도에서 배양함으로써 난소. </li></ol> 5. 항체 염색 <ol><li> DIG-기반의 버퍼 세트의 10 배 차단 솔루션을 희석 (DIG-B)는 1 배로. 주 : 1X DIG-B 블록킹 용액 (BSA 표준 블로킹 5 %로 이루어지는 시약 (v / v)의 정상 염소 혈청 (NGS)와 0.5 % (v / v)의 소 혈청 알부민보다 염색 배경을 감소시키기위한보다 효과적인 ) 0.2 % PBST에. </li><li> 가벼운 흔들림 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 2.5 시간 4의 1 배 DIG-B 차단 솔루션과 난소를 품어. 참고 : 1.5 ML 튜브에서 난소 삼쌍를 들어, 200 μL 샘플 차단 및 항체 염색의 최소 볼륨입니다. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다하고 적절한 diluti에서 일차 항체를 포함하는 신선한 1X DIG-B 차단 솔루션으로 대체비에. 가벼운 흔들림 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 4 시간 동안 난소를 얼룩. 주 : (1) ApVas1 항체 : 1 : 여기에 설명 된 실험, 일차 항체의 다음과 같은 최적의 희석 사용 발색 염색 500, 면역 형광 염색 1:50; (2) 항 - 튜 불린 α 항체 1 : 500; (3) 4D9 단일 클론 항체 : 1시 25분. </li><li> 15 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 난소를 씻으십시오. </li><li> 가벼운 흔들림으로 실온에서 1 시간 동안 1X DIG-B 차단 솔루션과 난소를 품어. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다 신선한 1X DIG-B 차단 솔루션은 적절한 희석 비율로 차 항체를 포함로 교체. 가벼운 흔들림 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 4 시간 동안 난소를 얼룩. <ol><li> 이차 항체의 다음 희석 비율을 사용하여 (1) 면역 염색의 경우 : 1 : 알렉사 플 루어 633 염소 항 - 토끼 IgG에 또는 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스 IgG 500; (2) 발색 염색 : 1 : 200 비오틴 염소 항 - 토끼 IgG를합니다. 주 : 바이오틴 이차 항체 염색 신호가 크게 증폭되는 기판 계 (발색) 검출에 아비딘 - 비오틴 - 복합체 (ABC)와 상호 작용하기 위해 적용된다. </li><li> 이차 항체가 민감한 빛 때문에 면역 형광 염색은, 어둠 속에서 염색을 실시하고 있습니다. </li></ol></li><li> 10 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 차 항체를 씻으십시오. </li></ol> 6. 원자력 및 F - 굴지 염색 참고 :이은 면역 형광 염색법에 대해 적용됩니다. <ol><li> 어둠 속에서 실온에서 DAPI (2 NG / μL), 2 시간 동안 Phalloidin의-TRITC (100 nm의)를 포함 0.2 % PBST로 난소를 얼룩. </li><li> 10 분 각각 0.2 % PBST로 4 회 난소를 씻으십시오. </li><li> 가벼운 흔들림 4 ° C에서 설치 매체 O / N과 난소를 품어. </li></ol> 7. 신호 개발 참고 :이는 발색 염색 적용됩니다. <ol><li> 100 μl를 준비비오틴 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제와 접합 (시약 B 1 μL를, 0.2 % PBST 98 μL 시약 (아비딘) 1 μl를 첨가 부드러운 피펫을 통해 철저히 혼합하고, 추가로 신호를 향상 (ABC) 시약 아비딘 - 비오틴 - 복합체 ), 즉시 혼합 하였다. 온화한 교반과 함께 30 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. </li><li> 온화한 교반과 함께 30 분 동안 실온에서 시약 A 및 B의 혼합물에 (해리 달걀 챔버 포함) 난소 배양한다. </li><li> 10 분간 각각 0.2 % PBST로 4 회 시약 및 B의 혼합물을 씻어. </li><li> 플라스틱 적기에 현장 접시에 잘에 PBST에 잠긴 난소를 전송합니다. </li><li> 3,3&#39;- 디아 미노 (DAB)의 기질 용액을 제조 하였다 : 하나 DAB 태블릿 플러스 1 분 동안 격렬하게 볼 텍싱 통해 DDH 2 O 1 ㎖를 함유하는 또 하나의 우레아 과산화수소를 녹인다. 참고 : DAB, 퍼 옥시 다제의 침전 기판, 면역 염색에 대한 인기 발색입니다. 그것은 BR를 생산과산화 효소에 의해 산화 된 후 자신의 불용성 침전물. 약한 신호는 기질 용액 (최종 농도 0.05부터 0.08까지 %)에 염화 니켈을 첨가함으로써 향상 될 수있다. </li><li> 웰 내에 잔류 PBST 용액을 제거하고 신호 개발 DAB 기질 용액 100 ㎕와 리필. </li><li> 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 신호의 강도를 모니터링합니다. </li><li> 즉시 1X PBS로 재충전 하였다 DAB 용액을 제거하여 반응을 정지. 두 번 세척을 반복합니다. </li><li> 1.5 ML 튜브로 다시 난소로 이동 한 다음 15 분마다 두 번 1X PBS 또는 PBST로 씻는다. </li><li> 가벼운 흔들림 4 ° C에서 글리세롤 기반 설치 매체 (70 % 글리세롤) O / N에서 난소를 품어. </li></ol> 8. 진딧물 배아를 장착 참고 : 진딧물 배아의 두께는 개발 단계 사이에 다릅니다. 설치 전략 따라서 조기에 맞게 수정 (germaria 및 0-10 스테이지), 중간 (단된다그림 2B에서 설명된다 11-18), 늦은 배아 (단계 19 ~ 20) - D. 배아 준비는 미우라 등을 따랐다. (12) <ol><li> 낮은 배율에서 스테레오 현미경으로 샘플을 플라스틱 스포이드로 셀 트레이에 매체를 장착와 함께 난소를 전송하고 관찰한다. </li><li> 곤충 핀을 사용하여 측면 난관과 관련된 꽃받침을 차단하고 적기에 잘 빈 유리에 고립 ovariole을 전송합니다. 설치 매체를 사용하여 50 ~ 100 μL에 최종 볼륨을 확인합니다. </li><li> 유리 dropper으로 슬라이드에 ovariole을 전송 한 다음, 곤충, 핀을 사용하여 난자 챔버 해부. 참고 : 개발의 단계 6 세 이상 배아를 들어, 계란 챔버의 분리를 제안한다; germaria 무대 6 세 미만의 처음 두 계란 챔버에 대한 분리는 선택 사항입니다. </li><li> 유리 dropper를 사용하여 깨끗한 슬라이드에 해부 계란 챔버를 변경합니다. </li><li> 커버 슬립 (크기를 넣어 : 22 X 22해부 germaria 또는 천천히 거품을 피하기 위해 달걀 챔버 (단계 개발의 1-10에서 배아를 포함) mm 이상). <ol><li> 마운트 달걀 챔버 일방적 coverslip에 다리와 슬라이드 (단계 개발의 11-18에서 배아를 포함) 및 다른 coverslip에 배치 : 샘플의 상단에 (크기 18 X 18mm)를. </li><li> 마운트 달걀 챔버 양면 커버 슬립의 다리로 슬라이드 (개발의 단계 19 이전의 배아를 포함) 및 다른 coverslip에 배치 : 샘플의 상단에 (크기 18 X 18mm)를. </li></ol></li><li> 샘플을 건조 방지하기 위해 설치 매체를 사용하여 상단 커버 슬립 아래 공간을 채 웁니다. </li><li> 온화하게 관찰에 대한 올바른 방향을 얻기 위해 커버 슬립을 밀어 배아를 굴립니다. </li><li> 매니큐어와 (브리지 된 커버 포함) 된 커버의 가장자리 주위에 인감. </li></ol> 9. 이미징 분석 <ol><li> 사진 미분 간섭 대비 (DIC)의 이미지 compou와 배아를 전체를 마운트차 현미경 DIC 광학 및 카메라에 연결 건조 대물 렌즈 (10X, 20X, 40X)를 장착. 제조업체의 지침을 사용하여 카메라와 컴퓨터 사이의 이미지 전송을위한 소프트웨어를 설치합니다. </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (14)과 형광 표지 된 배아의 돌기를 획득. , 촬영 Z-스태킹 및 3D 이미징 소프트웨어를 사용하여 투사 제조업체의 지침을 따르십시오. <ol><li> 10X 목적에 탑재 된 샘플을 발견, 거꾸로 슬라이드를 켜고 잘 기름칠 기반의 펜으로 샘플 영역을 동그라미. 참고 :이 공 초점 현미경의 목표를 통해 검색 할 때 샘플을 쉽게 식별합니다. </li><li> 반대측 9.2.1에 설명 된대로 표지 커버 슬립 영역의 상부에 오일 방울을 추가한다. </li></ol></li><li> 40X 기름 침지 목표에 초점면 다음 63X 기름 침지 목표로 변경하실 수 있습니다. 수동으로 미세 초점 제어를 이동 할WN 최고의 초점면을 촬영합니다. 참고 : germaria 및 초기 배아의 세부 구조를 관찰, 우리는 40X 목적 또는 더 높은 배율을 가진 사람을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 다른 여기 채널에서 배아를 스캔 Z 스택 이미지를 얻을 수 있습니다. 참고 : 완두콩 진딧물 조직의 경우, 1.5 ㎛ 이하까지 각각의 광 부분의 두께를 줄일 수 있습니다. </li></ol>

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우리는 완두콩 진딧물에 성공 면역에 중요한 최적의 조건을 확인했다. pisum, 게놈과 발달 연구 3,15에 대한 새로운 모델 생물. 조직 투과성을 증가시키고, 배경 얼룩을 감소시키기위한 최적 조건은 신호 강도 및 특이성을 향상. 이들은 세포막에 구멍을 만들고 결합 비 - 특이 적 항체를 차단하는 단계에서 다른 동물 모델에서 면역 염색을위한 표준 프로토콜이 다르다. 면역 염색 및 현장 하이브리드에, 단백질 분해 효소 K (PK) 소화은 조직 투과성 16-19을 증가시키는 일반적인 방법 중 하나입니다. (1) PK 소화가 상당히 있지만, 세균 밴드 확장 (단계 11 ~ 14) (그림 3B &#39;&#39;C &#39;&#39;) 중 처녀 생식 태생 태아의 면역 신호를 강화 : 진딧물 조직의 항체 염색, 우리의 결과는 것을 보여 주었다약한 신호는 여전히 PK 처리 <strong...

진딧물은 작은 (1-10mm) 소프트 기관과 hemipteran 곤충이다. 그들은 피어싱 구기와 체관부 수액을 빨아 식물을 먹고. 또한, 그들은 체관부 수액 다이어트 결핍 필수 아미노산을 합성, 의무적 endosymbiotic 세균 Buchnera의 aphidicola에 의존한다. 진딧물은 봄과 여름 긴 일 photoperiods 그들이 월동 계란 1, 2의 제한된 수의 누워있는 동안 짧은 일 photoperiods에 의해 트리거 성적 난생 재생시 처녀 생식 태생 재생을 포함하는 복잡한 삶의 역사를 가지고 있습니다. 봄이 계란 가을까지 처녀 생식 재생의 많은 라운드를 다음, 모든 여성 진딧물 (fundatrices)의 첫 번째 세대를 생산하기 위해 부화. 연간 라이프 사이클에 무성 성적 단계의 대체가 진화 참신 1,2로 간주 된 진딧물에 순환 처녀 생식. 처녀 생식 태생 진딧물에서, 배아는 난소 세관 (ovarioles)의 달걀 챔버 내에서 발생한다. 반면, 성적 난생 배아는 수정란에서 개발. 외에도 생식 소성에서, 진딧물은 transgenerational 날개 polyphenism를 표시 할 수 있습니다 과밀 신호와 포식자의 위협에 대한 응답으로, unwinged 성별이 여성은 viviparously 장거리 이동을위한 날개 자손을 생성 할 수 있습니다. 완두콩 진딧물의 게놈 시퀀스의 출판 Acyrthosiphon pisum 년 -에 대한 최초의 게놈 서열을 기초 hemimetabolous 곤충 - 수 생식 소성, 날개 polyphenism 및 분자에 진딧물 곤충 - 식물의 상호 작용, 바이러스 벡터링과 공생을 포함한 다른 기능의 추가 탐사 기준 3. 시퀀스 된 게놈 외에, 유전자 발현과 기능을 특성화 툴 성숙한 모델 생물로서 4 완두 진딧물을 촉진해야한다. 우리는 전체 마운트의 강력한 프로토콜을 설명했다 <em&gt; 진딧물 배아 5-7에서의 mRNA의 발현을 검출하기위한 현장 하이브리드에. 이중 가닥 RNA 주입 및 이송을 통해 RNA 간섭 (RNAi) 진딧물 약충 및 성인에서 유전자 침묵에 사용되었지만, 배아 유전자 녹다운을위한 조건은 아직 안정 8-10보고되지 않았다. 면역 염색 및 RNAi의 최저 후, 완두콩 진딧물 배아 11-13에서 수행되기 전에 샘플에서 단백질 발현을 검출 할 수있는 항체 기반의 접근 방식. 그러나, 조직 투과성 및 배경 얼룩 제거의 증가는 완두콩 진딧물의 무성 태생 배아에서 면역 염색을위한 표준 프로토콜을 사용하여 아직 만족스럽지 못하다. 예를 들어, 우리는 조직에 대한 항체의 침투 gastrulating 배아 감소 발견 (8-10 스테이지)과 형태 학적으로 식별 사지 싹 (단계 13 ~ 14)와 배아 항체에 거의 투과 있다고. 또한, 배경 염색은 무성 viviparo에 가시화생식 세포 마커 바사뿐만 아니라 그에 대한 배아 세그먼트 (12, 13)로 표현 Engrailed / Invected 단백질에 대한 항체를 이용하여 염색 우리 완두콩 진딧물의 배아. 사실 배경 염색은 여전히​​ 혼자 차 항체로 염색 배아에서 분명히 볼 수 있었다. 진딧물 조직의 완전성을 손상시키지 않고 투과성을 증가시키기 위해, 우리는 신중 테 K의 농도를 적정하고 진딧물 배아 조직 분해를위한 최적의 조건을 결정 하였다. 완두 진딧물에 비특이적 염색을 방지하기 위해, 우리는 배아를 효과적으로 차단하고 내인성 퍼 옥시다아제 (POD)의 활성, 면역 동안 신호를 증폭하기 위해 사용되는 효소를 억제 할 수있는 화합물을 검색. 전통적으로 사용되는 표준 오히려 염소 혈청 (NGS), 디곡시 제닌 (DIG) 기반 버퍼 세트에 의해 제공되는 차단 시약 / 소 혈청 알부민 (BSA)을 크게 백그라운드 염색을 감소시켰다. 또한, 메탄올 INHI였다과산화수소보다 효과적으로 POD 내인성 활성 비트 (H 2 O 2). 배아에 대한 면역 염색에 대한 이러한 진딧물 특정 조건에 관한 세부 사항은 다음 절에서 설명한다.

<table><tbody><tr><td>30% 수소 퍼시다아제(H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>배아의 내인성 과산화효소 표백용.</td></tr><tr><td>4' 6-디아미디노-2-페닐-인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9542</td><td>이중 가닥 DNA 라벨링용. 유독. 장갑을 착용하고, 작은 부분 표본에 분배하고, 노출을 최소화하기 위해</td></tr><tr><td>4D9 항충일성/주입형 마우스 단클론 항체</td><td>발달 연구 하이브리도마 은행</td><td>AB_528224</td><td>배아의 발달 세그먼트를 라벨링합니다.</td></tr><tr><td>ApVas1 토끼 다클론 항체</td><td>우리 실험실</td><td>N/A</td><td>배아에서 진딧물 생식세포 특이적 Vas1 단백질을 라벨링하기 위해. 이 항체는 우리 실험실에서 만들었습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Austerlitz 곤충 핀</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>난소에서 각 난실을 분리하기 위해. 사이즈 000, 블랙 에나멜 처리.&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>항체의 비특이적 결합을 차단합니다.</td></tr><tr><td>진딧물 배아 촬영을 위해</td> 복합 현미경 <td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>에 연결된 카메라</td>.</tr><tr><td>Colorimetric 8 cell tray</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>진딧물 배아의 염색 신호 개발용. 직경 95 x 57mm, 셀 깊이 2mm.</td></tr><tr><td>DIC 광학 장치가 있는 복합 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMR</td><td>슬라이드에 장착된 진딧물 배아 촬영용.</td></tr><tr><td>DIG 세척 및 블록 버퍼 세트</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>항체의 비특이적 결합을 차단합니다. 10x Blocking 용액을 1x로 희석하여 차단 시약으로 사용했습니다.</td></tr><tr><td>겸자</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>진딧물에서 난소 해부용. 제조사 부품 번호 5: 5 SA.&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 스포이드</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>진딧물의 난소를 플롯 플레이트에서 튜브로 옮기기 위해. 총 길이 150mm, 팁 길이 5 3/4".</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>진딧물 배아 제거 및 장착용.</td></tr><tr><td>글리신</td><td>바이오샵</td><td>N/A</td><td>proteinase K(PK)의 효소 활성을 차단합니다.</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG conjugated Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>마우스에서 1 차 항체 검출용.</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG conjugated Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>토끼의 1 차 항체 검출.</td></tr><tr><td>Intelli mixer</td><td>ELMI 실험실 장비</td><td>RM-2M</td><td>시약과 난소의 thorughly 반응을 개선합니다.</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 라이</td><td>카 마이크로시스템</td>즈 <td>SP5</td><td>플로라스트 태그가 있는 슬라이드에 장착된 진딧물 배아 촬영용.</td></tr><tr><td>메탄올&nbsp;</td><td>Burdick and Jackson</td><td>AH2304</td><td>배아의 내인성 과산화효소 표백용.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>배아 장착용. SUPERFROST 접지 가장자리, ca./env. 76 x 26mm.</td></tr><tr><td>현미경 커버 안경</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>슬라이드에 배아를 장착하기 위해. 크기 : 18 x 18 mm. 두께 번호 1 (0.13-0.16 mm)</td></tr> <tr><td>현미경 커버 안경</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>슬라이드에 배아를 장착합니다. 크기 : 22 x 22 mm. 두께 No. 1 (0.13-0.16 mm)</td></tr><tr><td>마우스 monoclonal anti-alphaTubulin 항체 (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>세포의 알파 튜불린 분포를 라벨링합니다.</td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>슬라이드의 커버슬립을 밀봉합니다.</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청 (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>항체의 비특이적 결합을 차단합니다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>진딧물 난소 고정용.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>배아에 F-actin의 분포를 라벨링하기 위해.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>진딧물 난소에 대한 등장성 용액.</td></tr><tr><td>플라스틱 스포이드</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>진딧물의 난소를 튜브에서 세포 트레이로 옮기는 데 사용됩니다. 크기 3ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>세포막에 기공을 만들고(펀칭) 항체의 접근을 용이하게 합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pyrex spot plate</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>현미경 검사에서 진딧물 난소의 해부 및 색상 반응용. 각 구멍은 지름이 22 mm이며&nbsp; 깊이 7mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 정제&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>기질 신호 개발용. DAB peroxidase 기질 정제 세트라고도합니다.</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>진딧물 난소의 해부 및 관찰용.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>세포막에 기공(펀칭)을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Vector laboratories</td><td>PK-6101</td><td>신호 향상용. 비오틴화된 염소 항토끼 IgG 2차 항체, A 및 B 시약을 포함합니다.</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 마운팅 매체</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>진딧물 배아 제거 및 장착용.</td></tr></tbody></table>

완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

완두콩 진딧물 Acyrthosiphon의 pisum는 시퀀스 된 게놈과 풍부한 표현형 소성으로, 게놈 및 개발 연구를위한 새로운 모델이되고있다. 다른 진딧물, 등을들 수있다. pisum은 배아가 ovariole의 조립 라인 방식으로 계란 챔버 내에서 개발 처녀 생식 태생 재생을 통해 빠르게 전파. 이전에 우리는 진딧물의 배아에서 mRNA 발현의 검출을 허용 현장 하이브리드의 전체 마운트의 강력한 플랫폼을 설립했다. 단백질의 발현을 분석하지만, 만족스러운 결과를 생성하지 않았다 무성 태생 진딧물의 ovarioles를 면역 염색을위한 프로토콜을 설립했다. 여기에서 우리는 조직 투과성을 증가 설립 방식을 적용 할 때 문제가 있었다 둘 배경 염색을 감소시키는 최적의 조건을보고합니다. 최적화는 다음과 같습니다 필수 F 발견 된 단백질 분해 효소 K (1 μg의 / ㎖, 10 분),의 (1) 배양중간 및 말기 진딧물 배아 또는 항체 침투; 디곡시 제닌 (DIG)에 의해 공급 차단 시약 정상 염소 혈청 / 소 혈청 알부민 (2) 여분 세트 버퍼와 내인성 퍼 옥시다아제 표백 메탄올 오히려 과산화수소 (H 2 O 2), (3)베이스 어플리케이션; 이는 크게 진딧물 조직에서 배경 염색을 감소시켰다. 면역 염색에 최적화 된이 중요한 조건은. pisum과 다른 진딧물의 배아에서 유전자 산물의 효율적인 검색을하실 수 있습니다.

본 연구에서는 무성 완두콩 진딧물 (그림 1A)의 배아에 전체 마운트 면역 염색을 시행 하였다. 이 여성은 생식에와 viviparously 자손을 생산하고 있습니다. 이 여성 배아는 난소 세관 (ovarioles) (그림 1B 그림 2A)의 달걀 챔버 내에서 개발. 현미경 전에 해부 ovarioles는 염색 타겟이고; 그러나, 달걀 챔버 분리 현미경 (- D도 2b) 아래의 배아 관찰 필요하다. 조직 투과성의 증가 테 K는 (PK) 치료는 조직 투과성을 향상시키기위한 표준 방법이지만-같은 생물 ...

진딧물 배아에 대한 전체 마운트 면역 염색 프로토콜이 제시되며, 이 프로토콜에서는 배경 염색을 줄이고 조직 투과성을 증가시키기 위한 중요한 조건을 다룹니다. 이러한 조건은 진딧물의 배아 조직에서 단백질 발현을 효과적으로 검출하기 위해 특별히 개발되었습니다.

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

본 면역염색 프로토콜의 전반적인 목표는 진딧물 배아 내의 단백질 발현을 검출하는 것입니다. 진딧물의 배아 조직을 염색할 때 오랫동안 문제되었던 조직 투과성 증가 및 배경 염색 감소를 위한 핵심 조건들이 확인되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 면역염색 프로토콜에서는 일반적으로 설명되지 않는, 항체의 효과적인 침투와 배경 염색 감소를 위한 특이적 조건을 제공한다는 점입니다.우리는 유전체학 및 환경 연구를 위한 다양한 곤충 모델인 완두진딧물에서 생식세포가 어떻게 지정되는지 연구하던 중 처음으로 이 측정 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 완두진딧물(A. pisum)의 실험실 계통은 원래 대만 중부에서 수집되었으며, 300세대 이상 기주 식물에서 사육되었습니다.발아를 위해 호스트 식물의 종자를 실온의 수돗물에 3~5일 동안 담가 둡니다. 매일 한 번씩 깨끗한 물로 교체하십시오. 발아된 종자 10립을 흙이 담긴 작은 화분에 심어, 20 °C의 배양기 내 광주기 16시간 명기 및 8시간 암기 조건에서 성장시킵니다.성장이 시작된 후 약 10일이 지나면 식물의 높이는 보통 8cm 이상이 됩니다. 각 식물 화분을 1L 유리 비커 안에 넣고, 붓을 사용하여 성체 진딧물을 식물 위로 옮깁니다. 그런 다음, 진딧물이 탈출하는 것을 방지하기 위해 거즈 망과 같이 공기가 통하는 덮개로 비커를 밀봉합니다.광주기 16시간 명기, 8시간 암기, 온도 20 °C 조건의 생장실에서 진딧물을 배양하며, 각 식물 화분에 매일 한 번씩 물을 줍니다. 스팟 플레이트의 웰 하나에 약 500 µL의 4 % 파라포름알데히드를 채웁니다. 플레이트를 저배율 실체현미경 아래에 두고, 해부를 위해 성체 진딧물 한 마리를 파라포름알데히드에 담급니다.한 쌍의 핀셋으로 머리와 복부를 잡고, 복부의 등쪽 큐티클을 절개한 뒤 난소를 복강에서 끌어내어 적출합니다. 다음으로, 1 mL의 파라포름알데히드가 들어 있는 1.5 mL 튜브에 난소 세 쌍을 넣고, 믹서로 가볍게 흔들어주며 상온에서 20분 동안 고정합니다. 유리 스포이드로 고정액을 제거한 후, PBST를 사용하여 10분씩 세 번, 가볍게 흔들어주며 난소를 세척합니다.난소를 처리하려면, 먼저 배아 조직의 투과성을 높이기 위해 Proteinase K와 함께 10분 동안 가볍게 흔들어 배양합니다. 배양 후 Proteinase K 용액을 버리고, 700 µL의 glycine으로 난소를 5분씩 세 번 세척합니다. 다음으로, PBST를 사용하여 난소를 10분씩 두 번 세척합니다.완만한 흔들림과 함께 실온에서 15분 동안 고정 버퍼를 사용하여 난소를 다시 고정합니다. 내인성 peroxidase 활성을 억제하기 위해, 0.2% PBST 내 메탄올의 부피 비율을 1:3, 1:1, 3:1 순으로 하여 난소를 단계적으로 탈수시킨 후, 완만한 흔들림과 함께 실온에서 100% 메탄올로 1시간 동안 추가 배양합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 난소를 단계적으로 재수화합니다.1.5 mL 튜브에 담긴 3쌍의 난소의 경우, 샘플 블로킹 및 항체 염색을 위한 최소 부피는 200 µL입니다. 난소를 1x DIG-B 블로킹 용액과 함께 실온에서 4시간 동안, 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 가볍게 흔들어주며 배양합니다. 배양 후 상층액을 제거하고, 적절한 희석 비율로 1차 항체가 포함된 신선한 1x DIG-B 블로킹 용액으로 교체합니다.난소를 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 완만한 진동과 함께 하룻밤 동안 염색합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 난소를 세척한 후, 상층액을 제거하고 적절한 희석 비율로 2차 항체가 포함된 신선한 1x DIG-B 블로킹 용액으로 교체하여 이전과 동일하게 난소를 염색합니다. 면역형광 염색의 경우, 2차 항체는 빛에 민감하므로 암실에서 염색을 수행하십시오.진딧물 배아의 두께는 발달 단계에 따라 다릅니다. 따라서 초기, 중기 및 후기 배아에 맞게 마운팅 전략을 수정해야 합니다. 플라스틱 스포이드를 사용하여 마운팅 매질과 함께 난소를 셀 트레이로 옮긴 후, 실체 현미경의 저배율에서 시료를 관찰하십시오.곤충 핀을 사용하여 측면 수란관과 연결된 굳은살 부위를 절단한 다음, 분리된 난소 소관을 드로퍼를 이용해 빈 유리 웰로 옮깁니다. 마운팅 용액을 사용하여 최종 부피를 50에서 100 µL 사이로 맞춥니다. 그런 다음, 유리 드로퍼를 사용하여 난소 소관을 슬라이드 위로 옮깁니다.곤충 핀을 사용하여 난포를 해부합니다. 발달 단계 6 이후의 배아의 경우, 난포를 분리하는 것이 권장됩니다. 생식소와 처음 두 개의 난포의 경우, 분리 여부는 선택 사항입니다.유리 스포이드를 사용하여 해부한 난포를 깨끗한 슬라이드로 옮깁니다. 발생 단계 1에서 10 사이의 배아의 경우, 기포가 생기지 않도록 해부된 생식소 또는 난포 위에 커버 슬립을 천천히 덮습니다. 또는 발생 단계 11에서 18 사이의 배아의 경우, 한쪽 면에 커버 슬립 브리지를 만들어 난포를 슬라이드에 마운트한 다음 샘플 위에 또 다른 커버 슬립을 덮습니다.발달 단계 19단계 이후의 배아의 경우, 양면 커버슬립 브리지를 사용하여 난포(egg chambers)를 슬라이드에 고정하고, 시료 위에 다른 커버슬립을 덮습니다. 다음으로, 시료의 건조를 방지하기 위해 상단 커버슬립 아래의 공간을 마운팅 매질(mounting media)로 채웁니다. 상단 커버슬립을 살짝 굴려 관찰에 적합한 방향으로 조정합니다.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미지 분석을 수행하기 전에 브릿지 커버 슬립을 포함하여 커버 슬립의 가장자리를 네일 폴리시로 밀봉합니다. 여기에는 성체 암컷에서 적출한 한 쌍의 난소가 표시되어 있습니다. 난소 소관은 하나의 생식낭(germarium), 1~2개의 O-사이트, 그리고 5~7개의 배아로 구성되며, 이 모든 요소는 조립 라인 방식으로 난실(egg chambers) 내에 수용되어 있습니다.파라포름알데히드 고정 후, 1 µg/mL 농도의 Proteinase K 용액에서 10분 동안 난소를 소화시키는 것을 강력히 권장합니다. 염색 결과, Proteinase K로 소화시킨 배아에서 신호 강도가 유의미하게 증가하는 것으로 나타났습니다. DIG 기반 버퍼 세트의 블로킹 용액에 배아를 배양하는 것이 정상 염소 혈청 및 소 혈청 알부민을 사용했을 때보다 배경 염색을 더 많이 감소시킵니다.내인성 peroxidase 활성 또한 높은 배경 염색을 유발할 수 있습니다. 본 연구들은 진딧물 배아를 메탄올에 침지시키는 것이 과산화수소로 배아를 처리하는 것보다 peroxidase 활성을 훨씬 더 효율적으로 억제할 수 있음을 보여줍니다. 본 연구에서 밝혀진 핵심 조건들은 생식 세포와 체세포 모두의 신호 검출에 적용될 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 이틀 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 신호 강도를 높이고 배경 염색을 줄이는 방법을 포함하여 진딧물 배아에서 성공적으로 면역염색을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안, 배아의 형태를 잘 유지하기 위해 모든 배아를 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다.파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 DAPI를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 이 절차 이후에는 배아 세포 내에서 메신저 RNA가 해당 단백질 생성물과 함께 국소화되어 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 인시투 하이브리다이제이션(in situ hybridization)과 같은 다른 분석법을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 생식 세포가 어떻게 지정되는지, 그리고 진딧물의 서로 다른 생식 단계에서 난세포가 어떻게 결정되는지와 같이 곤충 환경 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 모든 마운트 immunohistochemistry, 항원의 공간 및 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 태아의 시각 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다.

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

Xenopus laevis 배아는 크기가 크고 조작이 용이하기 때문에 초기 발달 연구에 매우 유용합니다.   이 모델 시스템에서 특정 장기를 식별하는 데 사용할 수 있는 전체 마운트 in situ hybridization 프로토콜에 대한 단순화된 프로토콜이 제공됩니다.

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.

의 Permeabilization의 방법<em&gt; 초파리</em작은 분자 활동의 분석 실험을위한&gt; 태아

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

제브라 피쉬의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 teleostean 대응이다. 효소 활성 분석, 개발 제브라 피쉬에서 차별화 된 steroidogenic 세포를 감지,이 프로토콜은 3-β-하이드 록시 탈수소 효소 (3β-HSD Δ 5-4 이성화 효소)를 수행하는 방법을 소개합니다.

Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.

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이 프로토콜들은 대조군과 돌연변이 초파리 배아 상피에서 주름 격격 접합부의 조직 및 폐쇄 기능을 어떻게 특성화할 수 있는지 개괄합니다.

초파리 배아 상피에서 코어 주름 부분 격지 접합 단백질을 규명하기 위한 면역염색 및 염료 침투 실험

배우세요 완두콩 진딧물(Acyrthosiphon pisum) 태아의 전체 면역 염색법을 통해 조직 투과성을 높이고 배경 염색을 감소시키는 최적 조건을 확인하는 방법입니다. 이 기술은 단백질 발현 검출을 개선하여 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

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