완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

본 면역염색 프로토콜의 전반적인 목표는 진딧물 배아 내의 단백질 발현을 검출하는 것입니다. 진딧물의 배아 조직을 염색할 때 오랫동안 문제되었던 조직 투과성 증가 및 배경 염색 감소를 위한 핵심 조건들이 확인되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 면역염색 프로토콜에서는 일반적으로 설명되지 않는, 항체의 효과적인 침투와 배경 염색 감소를 위한 특이적 조건을 제공한다는 점입니다.

우리는 유전체학 및 환경 연구를 위한 다양한 곤충 모델인 완두진딧물에서 생식세포가 어떻게 지정되는지 연구하던 중 처음으로 이 측정 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 완두진딧물(A. pisum)의 실험실 계통은 원래 대만 중부에서 수집되었으며, 300세대 이상 기주 식물에서 사육되었습니다.

발아를 위해 호스트 식물의 종자를 실온의 수돗물에 3~5일 동안 담가 둡니다. 매일 한 번씩 깨끗한 물로 교체하십시오. 발아된 종자 10립을 흙이 담긴 작은 화분에 심어, 20 °C의 배양기 내 광주기 16시간 명기 및 8시간 암기 조건에서 성장시킵니다.

성장이 시작된 후 약 10일이 지나면 식물의 높이는 보통 8cm 이상이 됩니다. 각 식물 화분을 1L 유리 비커 안에 넣고, 붓을 사용하여 성체 진딧물을 식물 위로 옮깁니다. 그런 다음, 진딧물이 탈출하는 것을 방지하기 위해 거즈 망과 같이 공기가 통하는 덮개로 비커를 밀봉합니다.

광주기 16시간 명기, 8시간 암기, 온도 20 °C 조건의 생장실에서 진딧물을 배양하며, 각 식물 화분에 매일 한 번씩 물을 줍니다. 스팟 플레이트의 웰 하나에 약 500 µL의 4 % 파라포름알데히드를 채웁니다. 플레이트를 저배율 실체현미경 아래에 두고, 해부를 위해 성체 진딧물 한 마리를 파라포름알데히드에 담급니다.

한 쌍의 핀셋으로 머리와 복부를 잡고, 복부의 등쪽 큐티클을 절개한 뒤 난소를 복강에서 끌어내어 적출합니다. 다음으로, 1 mL의 파라포름알데히드가 들어 있는 1.5 mL 튜브에 난소 세 쌍을 넣고, 믹서로 가볍게 흔들어주며 상온에서 20분 동안 고정합니다. 유리 스포이드로 고정액을 제거한 후, PBST를 사용하여 10분씩 세 번, 가볍게 흔들어주며 난소를 세척합니다.

난소를 처리하려면, 먼저 배아 조직의 투과성을 높이기 위해 Proteinase K와 함께 10분 동안 가볍게 흔들어 배양합니다. 배양 후 Proteinase K 용액을 버리고, 700 µL의 glycine으로 난소를 5분씩 세 번 세척합니다. 다음으로, PBST를 사용하여 난소를 10분씩 두 번 세척합니다.

완만한 흔들림과 함께 실온에서 15분 동안 고정 버퍼를 사용하여 난소를 다시 고정합니다. 내인성 peroxidase 활성을 억제하기 위해, 0.2% PBST 내 메탄올의 부피 비율을 1:3, 1:1, 3:1 순으로 하여 난소를 단계적으로 탈수시킨 후, 완만한 흔들림과 함께 실온에서 100% 메탄올로 1시간 동안 추가 배양합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 난소를 단계적으로 재수화합니다.

1.5 mL 튜브에 담긴 3쌍의 난소의 경우, 샘플 블로킹 및 항체 염색을 위한 최소 부피는 200 µL입니다. 난소를 1x DIG-B 블로킹 용액과 함께 실온에서 4시간 동안, 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 가볍게 흔들어주며 배양합니다. 배양 후 상층액을 제거하고, 적절한 희석 비율로 1차 항체가 포함된 신선한 1x DIG-B 블로킹 용액으로 교체합니다.

난소를 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 완만한 진동과 함께 하룻밤 동안 염색합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 난소를 세척한 후, 상층액을 제거하고 적절한 희석 비율로 2차 항체가 포함된 신선한 1x DIG-B 블로킹 용액으로 교체하여 이전과 동일하게 난소를 염색합니다. 면역형광 염색의 경우, 2차 항체는 빛에 민감하므로 암실에서 염색을 수행하십시오.

진딧물 배아의 두께는 발달 단계에 따라 다릅니다. 따라서 초기, 중기 및 후기 배아에 맞게 마운팅 전략을 수정해야 합니다. 플라스틱 스포이드를 사용하여 마운팅 매질과 함께 난소를 셀 트레이로 옮긴 후, 실체 현미경의 저배율에서 시료를 관찰하십시오.

곤충 핀을 사용하여 측면 수란관과 연결된 굳은살 부위를 절단한 다음, 분리된 난소 소관을 드로퍼를 이용해 빈 유리 웰로 옮깁니다. 마운팅 용액을 사용하여 최종 부피를 50에서 100 µL 사이로 맞춥니다. 그런 다음, 유리 드로퍼를 사용하여 난소 소관을 슬라이드 위로 옮깁니다.

곤충 핀을 사용하여 난포를 해부합니다. 발달 단계 6 이후의 배아의 경우, 난포를 분리하는 것이 권장됩니다. 생식소와 처음 두 개의 난포의 경우, 분리 여부는 선택 사항입니다.

유리 스포이드를 사용하여 해부한 난포를 깨끗한 슬라이드로 옮깁니다. 발생 단계 1에서 10 사이의 배아의 경우, 기포가 생기지 않도록 해부된 생식소 또는 난포 위에 커버 슬립을 천천히 덮습니다. 또는 발생 단계 11에서 18 사이의 배아의 경우, 한쪽 면에 커버 슬립 브리지를 만들어 난포를 슬라이드에 마운트한 다음 샘플 위에 또 다른 커버 슬립을 덮습니다.

발달 단계 19단계 이후의 배아의 경우, 양면 커버슬립 브리지를 사용하여 난포(egg chambers)를 슬라이드에 고정하고, 시료 위에 다른 커버슬립을 덮습니다. 다음으로, 시료의 건조를 방지하기 위해 상단 커버슬립 아래의 공간을 마운팅 매질(mounting media)로 채웁니다. 상단 커버슬립을 살짝 굴려 관찰에 적합한 방향으로 조정합니다.

마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미지 분석을 수행하기 전에 브릿지 커버 슬립을 포함하여 커버 슬립의 가장자리를 네일 폴리시로 밀봉합니다. 여기에는 성체 암컷에서 적출한 한 쌍의 난소가 표시되어 있습니다. 난소 소관은 하나의 생식낭(germarium), 1~2개의 O-사이트, 그리고 5~7개의 배아로 구성되며, 이 모든 요소는 조립 라인 방식으로 난실(egg chambers) 내에 수용되어 있습니다.

파라포름알데히드 고정 후, 1 µg/mL 농도의 Proteinase K 용액에서 10분 동안 난소를 소화시키는 것을 강력히 권장합니다. 염색 결과, Proteinase K로 소화시킨 배아에서 신호 강도가 유의미하게 증가하는 것으로 나타났습니다. DIG 기반 버퍼 세트의 블로킹 용액에 배아를 배양하는 것이 정상 염소 혈청 및 소 혈청 알부민을 사용했을 때보다 배경 염색을 더 많이 감소시킵니다.

내인성 peroxidase 활성 또한 높은 배경 염색을 유발할 수 있습니다. 본 연구들은 진딧물 배아를 메탄올에 침지시키는 것이 과산화수소로 배아를 처리하는 것보다 peroxidase 활성을 훨씬 더 효율적으로 억제할 수 있음을 보여줍니다. 본 연구에서 밝혀진 핵심 조건들은 생식 세포와 체세포 모두의 신호 검출에 적용될 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 이틀 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 신호 강도를 높이고 배경 염색을 줄이는 방법을 포함하여 진딧물 배아에서 성공적으로 면역염색을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안, 배아의 형태를 잘 유지하기 위해 모든 배아를 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다.

파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 DAPI를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 이 절차 이후에는 배아 세포 내에서 메신저 RNA가 해당 단백질 생성물과 함께 국소화되어 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 인시투 하이브리다이제이션(in situ hybridization)과 같은 다른 분석법을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 생식 세포가 어떻게 지정되는지, 그리고 진딧물의 서로 다른 생식 단계에서 난세포가 어떻게 결정되는지와 같이 곤충 환경 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.