돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

본 절차의 전체적인 목표는 돼지 피하 백색 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포를 분리하여, 이들이 중간엽 지방세포, 골세포 및 연골세포로 분화하는 능력을 평가하는 것입니다. 이 방법은 비만 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 지방 조직 발달 조절에 관여하는 분자적 기전을 밝히는 유용한 도구가 됩니다.

이 기술의 주요 장점은 다량의 기질혈관세포를 수확할 수 있어 지방세포 분화 및 생물학적 특성에 대한 심층적인 분석이 가능하다는 점입니다. 돼지 지방 유래 줄기세포는 여러 세포 계통으로의 전분화능을 나타내므로, 이 기술은 줄기세포 치료 연구에 중요한 시사점을 가집니다. 먼저 새끼 돼지를 깨끗한 수술대 위에 엎드린 자세로 눕히는 것으로 시작하십시오.

목에서 꼬리까지 정중선을 따라 모든 털을 깎고, 7.5% Povidone iodine으로 등쪽 피부를 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 요오드가 피부 표면에 약 10분 동안 머물게 합니다. 그런 다음, 피부에 70% ethanol을 분사합니다.

에탄올을 적신 거즈 패드를 사용하여 소독제가 더 이상 보이지 않을 때까지 피부를 한 방향으로 닦아냅니다. 다음으로, 목 부위에서 다리 방향으로 절개합니다. 그런 다음, 핀셋으로 지방과 피부를 들어 올린 상태에서 메스를 사용하여 피하 지방 조직의 돼지 등 지방층과 인접한 피부층을 근육으로부터 분리합니다.

피부 및 지방 조직을 무혈청 37°C DMEM이 담긴 멸균된 200mL 비커에 즉시 담그고, 비커 외부를 70% ethanol로 분무합니다. 그다음, 비커를 층류 세포 배양 후드(laminar flow cell culture hood) 내에 넣고 비커 옆에 40×30cm 크기의 멸균된 3중층 호일 커버를 배치합니다. 조직의 피부 면이 아래로 향하게 하여 호일 위로 옮깁니다.

그리고 핀셋과 가위를 사용하여 지방 조직에서 남은 근육 조직을 제거합니다. 지방을 7 by 7-centimeter 크기의 정사각형 조각으로 자른 후, serum-free, 37-degrees Celsius DMEM이 담긴 새로운 멸균 200-milliliter 비커로 지방 조각들을 옮깁니다. 이제 탄소강 슬라이서 칼날이 장착된 맞춤형 슬라이스 홀더를 커버 포일 위에 놓고, 지방층이 아래를 향하게 하여 지방 조각 하나를 슬라이서 위에 올립니다.

지방 조직을 피부를 절단하지 않으면서 최대한 가깝게 약 1mm 두께의 조각으로 자릅니다. 그다음 가위를 사용하여 지방 조직 조각을 가능한 한 잘게 다진 후, 콜라게나제가 첨가된 여과된 소화 배지가 들어 있는 250mL 삼각플라스크에 넣습니다. 이 플라스크를 37°C의 궤도 진탕기(orbital shaker)에서 45 RPM으로 90분 동안 흔들어 배양합니다.

조직 덩어리가 거의 없이 소화 배지가 슬러리 상태가 되면, 10% FBS가 함유된 DMEM F-12 배지를 동일한 부피로 첨가하여 소화를 중단시킵니다. 돼지 지방 유래 줄기세포를 수집하기 위해, 소화된 지방 조직 현탁액을 단층 시폰(chiffon)을 통해 멸균된 250mL 혈청학적 병(serological bottle)에 여과하며, 이때 핀셋으로 시폰의 중앙을 눌러 소화물이 잘 통과하도록 안내하고 도와줍니다. 핀셋으로 시폰을 짜내어 통과를 완료한 후, 배지를 4개의 50mL 원뿔형 원심분리 튜브에 나누어 담습니다.

원심분리를 통해 기질-혈관 세포를 수집합니다. 그 후, 성숙 지방세포가 포함된 상단의 지방층 대부분을 제거하기 위해 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 따라냅니다. 다음으로, 피펫팅과 가벼운 흔들기를 통해 펠렛을 10 milliliters의 DMEM에 다시 현탁합니다.

세포를 다시 원심 분리하고 펠렛을 10 milliliters의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다. 상온에서 7분 후, 각 튜브에 10 milliliters의 DMEM을 첨가하고 튜브를 부드럽게 흔들어 섞어 적혈구 용해를 중단합니다. 그런 다음, 세포를 다시 원심 분리합니다.

10 mL의 DMEM으로 세포를 두 번 더 세척한 후, 100 µm 스트레이너를 통해 상층액을 하나의 50 mL 원추형 튜브에 모읍니다. 세포 현탁액을 파이펫으로 여러 번 부드럽게 섞어 세포를 고르게 분산시킨 후, Trypan Blue 배제법으로 세포 수를 측정합니다. 마지막으로, 돼지 지방 유래 줄기세포를 6 × 10⁴/cm² 밀도로 적절한 크기의 배양 용기에 세포 배양 배지와 함께 분주합니다.

세포를 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하여 단일층 형성을 촉진합니다. 기질혈관분획 유래 돼지 지방 유래 줄기세포의 형태는 생쥐 또는 인간 지방 유래 줄기세포와 유사하며, 파종 24시간 후에는 확장된 섬유아세포 유사 형태가 관찰됩니다. 돼지 지방 유래 줄기세포는 72시간 이내에 합류 상태(confluent)가 되며, 이 시점에서 지방세포 또는 기타 중간엽 유형 분화를 진행할 수 있습니다.

이 세포들은 화학적 유도 후 강력한 지방 생성 잠재력을 나타내며, 분화 9일 후에는 성숙한 지방세포를 관찰할 수 있고, 돼지 지방 유래 줄기세포의 90% 이상이 지방 분화를 나타냅니다. CD 29, CD 44, CD 90 및 MHC 1을 포함한 중간엽 줄기세포 표면 마커는 돼지 지방 유래 줄기세포에서 높게 발현되는 반면, CD 4a, CD 31, CD 45 및 MHC II는 거의 검출되지 않아, 이 돼지 지방 유래 줄기세포가 유의미한 혈관 내피 또는 조혈 줄기세포 오염 없이 중간엽 유형의 특성을 나타냄을 보여줍니다. 또한, 분화된 돼지 지방 유래 줄기세포는 특정 조직 염색 염료를 통해 지방세포, 골세포 또는 연골세포로 식별될 수 있으며, 이는 이러한 기질 혈관 분획 유래 세포들이 중간엽 유형 전구세포의 전형적인 다분화 능력을 유지하고 있음을 입증합니다.

이 절차를 수행하는 동안 세포 배양을 위한 우수한 무균 기술을 유지하고, 세포의 생존력을 극대화하기 위해 모든 단계를 가능한 한 신속하게 진행하는 것이 중요합니다. 기술이 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 6시간 이내에 돼지 2~3마리로부터 세포를 수확할 수 있습니다.

이 표준 기술은 당뇨병 분야의 비만 연구자들이 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자와 같은 분자 스위치를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 돼지 지방 유래 줄기세포를 분리하는 방법과, 이 세포들이 지방세포, 골세포 및 연골세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.