Name: 지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리 높은 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 콜라게나아제 소화와 면역자기 분리를 이용하여 마우스 지방 조직에서 Sca1 양성 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법입니다. 이 기술은 지방 유래 줄기세포 연구와 재생의학에 활용됩니다.

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이 작품은 (THC에) NIH DK095137에 의해 지원됩니다. 우리는 기술 된 방법의 개발 및 고도화에 기여 현재 전 실험실 구성원 감사합니다.

윤리 정책 : 동물의 사용 및 관리에 미시간위원회의 대학 (UCUCA)은 (실험 동물 연구를위한 연구소, 국립 연구위원회)가 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서에 따라 모든 방법과 프로토콜을 승인했다. 마우스는 미시간 대학의 동식물 사육장 유지하고, 음식과 물을 무료로 액세스 권한을 부여하고, 12 시간 어두운 / 라이트 사이클에 보관됩니다. 1. 준비 <ol><li> DMEM, 10 % FBS, 1 배 P / S / G 및 1X 항생제 / 항진균제와 차 문화 미디어를 준비합니다. 이것은 이전 소화 조직을 유지하는 데 사용된다. 37 ºC 물을 욕조에 주식과 나누어 놓습니다. </li><li> 5 ㎎ / ㎖ (+ 칼슘 + 마그네슘) 지방 패드의 각 유형에 대한 다섯 마우스에 최대, 고립 된 HBSS에 용해에서 유형 III 콜라겐 솔루션의 다섯 밀리리터를 준비합니다. 하나의 유전자형에서 SQ와 VIS를 분리 할 때 야생형과 돌연변이 SQ와 VIS는, 20 ㎖을 예를 들어, 10 mL로합니다. 7.4 인트하여 pH를 조정필터를 화나게. 50 ㎖ 튜브로 나누어지는. 따로 떨어져 빛에서 설정합니다. </li><li> 수술 부위를 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용합니다. 닦아와 푸른 패드 커버. 블루 패드에 약간의 에탄올을 스프레이. </li><li> 스티로폼 보드에 흡수 패드를 고정하고 가위로 잘라하기 위해 22 G 바늘을 사용합니다. 다음 블루 패드에 보드를 설정하고 해부를 시작하기까지 또 다른 블루 패드 커버 에탄올 패드​​ 스프레이. </li><li> 수술 부위에 인접한 스탠드에서 에탄올과 장소이 50 ㎖ 튜브를 입력합니다. 에탄올에 가위와 집게를 놓습니다. </li><li> 수술 도구를 에탄올을 세척을 위해 PBS 플러스 1 배 안티 - 안티 또 다른 50 ML 튜브를 입력합니다. </li><li> 후드에서 각 조직 유형에 대한 라벨 60mm 요리와 37 ºC로 가온 문화 미디어로 채우십시오. 외과 영역에 인접한 플레이트를 놓습니다. </li></ol> 피하 (SQ) 지방 패드 2. 분리 <ol><li> 이소 플루 란과 기흉의 과다 복용으로 마우스를 안락사. </li><li> 부드럽게70 % 에탄올로 마우스 스프레이와 부정사 누워. 22 G 바늘 폼 보드에 발을 고정. </li><li> 하복부의 피부에 작은 상처를 확인합니다. 포셉과 컷의 상단을 잡고 가위를 가지고 복막에서 피부를 분리합니다. </li><li> 피부가 흉부의 복부 복막로부터 분리되면, 상기 몸체의 측면을 따라 피부 측 방향으로 절개함으로써 얻어 헤드쪽으로 복막으로부터 피부를 반영한​​다. </li><li> 떨어져 몸에서 사타구니 지방을 잡고 나머지 피부를 반영, 22 G 바늘 보드 아래로 핀. </li><li> 미세 가위와 집게로 전환합니다. 복막 근처 원점에서 집게로 사타구니 지방 패드를 잡고 피부와 SQ 오염 방지 사타구니쪽으로 진행 피부와 사타구니 지방 사이의 거리 싹둑. </li><li> 표지 60mm 접시에 단리 된 사타구니 지방 패드를 놓습니다. </li></ol> 내 장기 (VIS) 지방 패드 3. 분리 <ol><li> 유사한 방식으로, 2.5 단계 지방 패드와 장 본능적 노출 열려 복막을 잘라. </li><li> 멀리 가슴을 향해 창자를 이동합니다. </li><li> 말단부에서 VIS 지방 패드를 잡고 부드럽게 잡아 당깁니다. 조직 (암컷 마우스를 사용하는 경우, 또는 자궁) 부고환을 제외 할 조심하면서 VIS 지방 패드를 해부하다. </li><li> 라벨 요리와 나머지 VIS 패드 단계를 반복 3.3의 장소. </li></ol> 지방 패드의 4 콜라게나 소화 <ol><li> 조직 문화 후드에 60mm 요리를 이동하고 미디어를 대기음. </li><li> 곡선 가위는 다음 콜라겐 솔루션에 추가로 지방 패드를 말하다. 에탄올과 PBS와 조직 유형 사이에 가위와 집게를 씻어해야합니다. </li><li> 조직이 소화 될 때까지 300 rpm으로 10 ~ 20 분 동안 37 ºC에서 흔들어. SQ의 일부 조각 여전히 볼 수 있습니다 경우는 허용됩니다. 이것은 이후 단계에서 해결 될 것입니다. </li><li> collag을 중지 콜라게나 제 용액에 배양액 25 ㎖를 추가10 ㎖의 혈청 학적 피펫 enase 처리 및 피펫 위아래로 10 배는 소화 조직을 분산합니다. </li><li> 100 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 변형 세포. 300 × g으로 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하고 부드럽게 세포를 일시 중단 피펫을 펠렛에 멸균 물 5ml를 추가하지 미디어를 가만히 따르다. 적혈구를 용균 2 분을 기다립니다. </li><li> 새로운 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 10 % FBS와 변형 세포와 미디어의 25 ML을 추가합니다. </li><li> 300 × g으로 10 분 동안 원심 분리기. 캔트 미디어 및 배양 배지 1 ㎖에 재현 탁 펠렛. </li><li> 1 트리 판 블루 : 1을 사용하여 혈구와 세포를 계산합니다. </li><li> 6 잘 접시에 하나 잘 플레이트 1 × 10 6 세포. </li></ol> 5. 자기 세포 분리 <ol><li> 세포 부착의 약 4 내지 6 시간 후, HBSS (-CA, -mg)로 두 번 세포를 씻어. 0.05 % 트립신을 사용하여 접착 세포를 해리. 1 ml의 분리 버퍼와 스핀에서 트립신 세포 현탁액을 희석300 X g에서 5 분. </li><li> 기음 뜨는. 500 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 10 μL 나누어지는을 제거하고 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 300 X g에서 5 분 스핀 세포. </li><li> 대기음이 완전히 뜨는. 90 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 10 μl를 방지 SCA1-FITC 차 항체를 추가합니다. 잘 믹스와 어둠 속에서 4 ºC에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> ml의 버퍼와 원심 분리기 세포 300 X g에서 5 분 1 세포를 씻으십시오. 완전히 뜨는을 제거합니다. </li><li> 80 μL 버퍼를 Resuspend 세포. 20 μl를 방지 FITC 마이크로 비드를 추가합니다. 잘 믹스와 어둠 속에서 4 ºC에서 15 분 동안 품어. </li><li> ml의 버퍼와 원심 분리기 세포 300 X g에서 5 분 1 세포를 씻으십시오. </li><li> 500 ㎕의 버퍼에 뜨는 및에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 자기 홀더에 열을 배치하고 500 μL 버퍼 열을 씻어. </li><li> 칼럼에 세포 현탁액을 추가합니다. 피펫 팅하는 동안 거품을 피하십시오. </li><li> 레이블이없는 SCA1를 수집 - &lt;/ SUP&gt; 세포와 500 μL 버퍼로 열 세 번 씻는다. 저수지가 비어있는 경우에만 새로운 버퍼를 추가합니다. 피펫 팅하는 동안 거품을 피하십시오. </li><li> 자기 홀더에서 열을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. </li><li> 열 저수지를 통해 공급 플런저를 밀어 SCA1의 +를 컬럼에 버퍼 및 용출 ㎖로 1을 추가합니다. </li><li> 300 X g에서 5 분 동안 세포 분수를 스핀 다운. 1 ml의 배양 배지에 재현 탁 세포. </li><li> 레이블과 레이블이없는 분수에서 10 μL 나누어지는을 제거하고 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 6 웰 플레이트의 1도 각 세포 분획 플레이트. </li></ol> 유동 세포 계측법와 SCA1 높은 ACSS의 면역 자기 분리 6. 확인 <ol><li> HBSS (-ca, -mg)로 두 번 세포를 씻어 0.05 % 트립신을 사용하여 세포를 떼어 놓다. </li><li> 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. 1 ml의 배양 배지에 재현 탁 된 세포는 혈구를 사용하여 계산. </li><li> 구하는&gt; 10 (6) </SUP&gt; 1 ml의 배양액에서 세포 5 분 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는 단계를 반복 6.3 두 번 더 제거합니다. </li><li> 2 % 염소 혈청 1 ㎖ + 2 % BSA 및 RT에서 30 분 동안 재현 탁 블록 셀. </li><li> 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> 솔루션을 차단 제거합니다. </li><li> 4 ° C에서 2 % 염소 혈청과 2 % BSA + PBS와 PBS 100 ㎕에, : 또는 항 SCA1 알렉사 플 루어 647 (400 0.25 μg의 1) : 쥐 IgG2a의 알렉사 플 루어 647 (400 0.25 μg의 1) 추가 어둠 속에서 30 분 동안. </li><li> 세포에 차가운 PBS 1 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리기 300 XG. </li><li> 뜨는 단계를 반복에게 6.9 두 번 더 제거합니다. </li><li> 1 ml의 PBS에 재현 탁 세포. 유세포 분석을위한 준비 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li></ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
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<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
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<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에서 우리는 고립과 다른 지방 패드에서 쥐의 ASC의 면역 자기 세포 분리 및 체외 실험에 사용을 보여줍니다. 제시된 방법의 ASC 9,14의 기술적으로 복잡하고 비싼 FACS 매개 분리를 통해 유리하다 SCA1 양성의 ASC의 많은 수의 빠른 분리에 효과적이다. FACS 달리 면역 자기 세포 분리는 표적 세포 모집단의 확인을위한 여러 항원의 사용을 허용하지 않는다. 표면 항원은 잘 특성화되면 그럼에도, 면역 자기 분리의 이용은 주요 설비없이 여전히 작은 기관에서 많은 생물학적 연구에 쉽게 액세스 할 수없는 FACS 장치 (15)의 사용에 의존하지 않고 분석 될 세포의 수는 증가 . 성공적인 결과를 보장하기 위해 준수해야하는 절차의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. ADIP의 조달마우스 지방 조직 저장소의 분리 수술은 줄기 세포를 필요 OSE 유래. 따라서, 조직 복구의 속도와 정확도가 생세포의 높은 번호를 수득하는 ...

세포 항원 1 (SCA1 또는 Ly6A / E)를 줄기 제 조혈 및 중간 엽 줄기 세포, 6으로 표시되는 세포 표면 마커로 확인되었다. 마우스 지방 저장소에서 얻은 지방 조직의 기질 혈관 분획 (SVF)는 섬유 아 세포, 대 식세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포 및 지방 세포의 전구 세포 (7)의 포함하는 세포의 이종 인구입니다. 지방 세포 전구 세포 또는 지방 - 유래 줄기 세포 (ASC를)는 풍부한 혈관 주위 콜라겐이 세포 외 기질 (ECM) (8)에있는 비 지질 함유 세포이다. CD34 + : SCA1 + 9 CD29 + - 약 SVF의 50 %는 혈통 음 (린)와 같은 특징의 ASC,로 구성되어 있습니다. 시험관에서의 지방 세포 분화 할 수있는 지방 세포 전구 세포 - CD24 : 이들 세포의 대부분은 SCA1 + 아르 그러나, 세포의 일부만 (SVF 0.08 %)의 구성을 SCA1 <s최대&gt; + : 증식 및 생체 조건 9 지방 세포로 분화 완벽하게 할 수있는 CD24 + 세포. CD24에서 CD24 + 세포를 구별하지 않고 SCA1 + SVF를 사용한 전위주의에도 불구하고 - 면역 자기 세포 분리를 사용하여 지방 저장소로부터 SCA1 +의 ASC를 세포를 단리 차 지방 세포 전구 세포의 세포 자율 표현형을 결정하는 효율적이고 실용적인 접근 방식이다. 비만과 당뇨병, 조직의 섬유화와 염증의 분야에서 2 형 당뇨병 3의 개발과 유지에 중요한 역할을한다. 최근, 토쿠 나가 등. (VIS, 또는 내장) 서혜부 (또는 피하, SQ)과 perigonadal에서 분리 SCA1 높은 세포 C57BL6 / J 지방 저장소가 시험관 (10)의 서로 다른 유전자 서명과 ECM의 리모델링을 나타내는 것으로 나타났다. MMP14 (MT1-MMP), 막-t의 원형 회원YPE 매트릭스 메탈은 (MMP) 패밀리는 collagenolytic 활성 (1)을 백색 지방 조직 (WAT)의 개발을 매개한다. 다음 프로토콜을 통해 분리되고 농축 된 세포로 수행 될 수있다 실험 예는 삼차원 배양, 분화 연구, 콜라겐 분해 분석 및 RNA 서열 10, 11을 포함한다. 분해 분석은 텔로 펩타이드 (11, 12)의 보존을 보장하기 위해, 산 추출 콜라겐으로 수행되어야한다. 다음 프로토콜은 서로 다른 지방 저장소에서 주요 혈관 간질 세포를 분리 및 면역 자기 세포 분리를 이용하여 지방 세포의 전구 세포를 풍부하게하는 방법을 설명 할 것이다. 셀 정렬의 유효성은 유동 세포 계측법으로하고 SCA1 프로모터 (13)에 의해 구동 SCA1 + 세포에서 GFP를 표현 SCA1-GFP 마우스를 사용을 통해 평가한다.

<table><tbody><tr><td>Type 3 Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004182</td><td>Tissue digestion</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>High-glucose culture medium</td></tr><tr><td>Pen/Strep/Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Media antibiotic</td></tr><tr><td>Anti-anti (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Media antifungal</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>트립신 (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu; m 셀 스트레이너</td></tr><tr><td>60mm 플레이트</td><td>BD 팔콘</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>대형</td></tr><tr><td>가위</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>미세하고 구부러진 팁</td></tr><tr><td>대형 집게</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8 "바늘</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1.5" 바늘</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1 마이크로비드 키트 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm; Ab 및 anti-FITC 마이크로비즈 2&ordm; Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS 러닝 버퍼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>블루 chux 패드</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>흡수 패드</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>스티로폼 보드</td><td></td><td></td><td>50ml 튜브에서 사용</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td>, <td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>쥐, IgG2a, Alexa Fluor 647</td>, <td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr>, <tr><td>Rat IgG2a, 안티 마우스 Sca1, Alexa Fluor 647</td>, <td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr>, <tr><td>Rat IgG2a, R-PE</td><td>, Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr>, <tr><td>Rat IgG2a, 안티 마우스 F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>라운드 바텀 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash; 캘리포니아, &ndash; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>콜라겐분해효소 용액</td></tr><tr><td>I형 콜라겐(37mm 아세트산 중 2.7mg/ml</td>) <td>집에서 준비12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>집에서 준비</td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 카르복실산, 숙시니미딜 에스테르, 혼합 이성질체</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO3&nbsp; </td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

지방 창고 별 sca1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 asc)

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

지방 유래 줄기세포(ASC)의 분리는 지방 조직 생물학, 지방 형성 및 세포외 기질(ECM) 리모델링 분야에서 중요한 방법입니다. 생체 내에서, 섬유소 콜라겐으로 구성된 ECM이 풍부한 환경은 비만의 진행과 퇴행 동안 지방 조직에 구조적 지원을 제공합니다. 기질 금속단백분해효소(MMP)에 의해 매개되는 생리학적 ECM 리모델링은 지방 조직의 크기와 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다1,2. 생리학적 콜라겐 분해 ECM 리모델링의 손실은 과도한 콜라겐 축적(조직 섬유증), 대식세포 침투, 그리고 궁극적으로 인슐린 저항성을 포함한 대사 항상성의 상실로 이어질 수 있다3,4. 유전자 표적 마우스 모델에서 지방 조직의 표현형 변화가 관찰되는 경우, 체외 연구를 위해 지방 저장소에서 1차 ASC를 분리하는 것은 ASC의 기능을 조절하는 데 있어 특정 유전자의 역할을 정의하는 효과적인 접근 방식입니다. 다음에서는 Sca1높은 ASC의 면역자기 분리를 정의합니다.

다른 지방 패드에서 SCA1 고의 ASC의 농축. SQ 지방 디스플레이와 같은 섬유 아세포로부터 단리 혈관 간질 세포 SCA1 발현 수준 (도 1a)에 관계없이 셀 형상 뻗어있다. VIS 한편, (EWAT이 유래) 높은 ​​SCA1 및 SCA1 낮은 세포는 세포 형태에 뚜렷한 차이를 보여줍니다. VIS SQ (iWAT 유래) SCA1 높은 세포처럼 VIS SCA1 낮은 세포가 상피 모양을 보여 반면 SCA1 높은 세포, 섬유 아세포와 같은 세포 모양을 뻗어 디스플레이 (EWAT는 유래). SCA1-GFP 마우스에서 분리 SCA1 높은 세포는 쉽게 조직 배양 (그림 1B)에서</st...

우리는 유전자 발현 및 콜라겐 분해 활성을 평가하기 위해 쥐 서혜부(피하) 및 성선주위(내장) 지방 조직 저장소에서 기질 혈관 분획(SVF)을 분리하는 데 필요한 기술을 제시합니다. 이 방법에는 면역자기 세포 분리를 사용하여 Sca1고지방 유래 줄기세포(ASC)를 농축하는 것이 포함됩니다.

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 마우스 지방 패드에서 Sca1 양성 중간엽 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 면역 자성 비드 기반의 세포 분리를 통해 서로 다른 지방 저장소에서 유래한 지방 유래 줄기세포를 효율적으로 농축하여 후속 실험에 활용할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 분리에 필요한 충분한 수의 세포를 확보하기 위해 콜라게나제 매개 조직 소화의 강도와 시간을 최적화하는 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.피하 지방 패드를 분리하려면, 먼저 마우스를 폼 해부판 위에 배를 위로 향하게 놓은 다음 70% ethanol을 분사합니다. 발을 해부판에 고정한 후, 하복부 피부에 작은 절개창을 냅니다. 그런 다음, 핀셋으로 절개 부위의 상단을 잡고 가위로 복부에서 흉부까지 피부와 복막을 분리합니다.몸의 측면을 따라 피부에 외측 절개를 넣은 후, 피부를 복막에서 머리 방향으로 젖힙니다. 그런 다음, 서혜부 지방을 몸에서 떼어낸 상태로 유지하며 남은 피부를 뒤로 당기고, 22 gauge 바늘을 사용하여 피부를 보드에 고정합니다. 다음으로, 포셉을 사용하여 복막 근처의 서혜부 지방 패드 기시부를 잡고, 미세 가위를 사용하여 피부와 서혜부 지방 사이를 서혜부 방향으로 절개하며, 이때 피부가 피하 지방 패드를 오염시키지 않도록 주의합니다.그 다음, 분리한 서혜부 지방 패드를 37 °C 배지가 담긴 SQ 표기 60 mm 디시에 넣고, 동물의 반대편 서혜부 지방 패드도 동일한 방식으로 채취합니다. 내장 지방 패드를 분리하려면 복막을 절개하여 내장 지방 패드와 장을 노출시킵니다. 그런 다음 장을 흉부 쪽으로 밀어 옆으로 치웁니다.원위단에 있는 내장 지방 패드를 잡고 지방 조직을 부드럽게 끌어올려, 부고환 조직이 포함되지 않도록 주의하며 절제합니다. 그 다음, 37 °C의 배지가 들어 있는 VIS 라벨이 부착된 60 mm 디쉬에 지방 패드를 넣습니다. 모든 지방 패드가 수집되면, 디쉬를 조직 배양 후드로 옮기고 배지를 흡입하여 제거합니다.곡선 가위를 사용하여 지방 패드를 잘게 다집니다. 그런 다음, 다져진 지방 조각들을 갓 준비한 collagenase가 들어 있는 개별 50 milliliter 튜브에 넣습니다. 다음으로, 조직이 완전히 소화될 때까지 300 RPM, 37 degrees Celsius에서 10분에서 20분 동안 튜브를 흔들어 줍니다.피하 지방 패드 조직의 일부가 여전히 보일 수 있습니다. 소화를 중단시키기 위해 콜라게나아제 용액에 20 milliliters의 배양액을 추가하고, 10 milliliter 세롤로지컬 피펫을 사용하여 조직 슬러리를 10회 흡입 및 분사하여 소화된 조직을 완전히 분리합니다. 세포를 100 micron 세포 스트레이너로 여과한 후, 조직을 원심분리합니다.그 다음 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 배지를 조심스럽게 따라내고, 두 세포군 모두를 5 mL의 멸균수에 부드럽게 재현탁합니다. 적혈구가 용해될 때까지 2분 동안 기다립니다. 그런 다음 각 튜브에 FBS가 첨가된 배지 25 mL를 넣어 반응을 중지시킵니다.두 지방세포 집단을 새로운 100 micron 세포 스트레이너로 여과하고 다시 원심 분리한 후, 펠렛을 1~3 mL의 배지에 재현탁합니다. trypan blue 배제법으로 세포 수를 센 후, 1×10⁶개의 피하 지방패드 세포와 내장 지방 세포를 각각 6-well 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 분주합니다. 세포를 트립신 처리한 후, 트립신을 1 mL의 분리 버퍼로 희석하고 배양 플레이트를 원심 분리합니다.튜브당 500 µL의 분리 완충액으로 세포를 현탁한 후, 세포를 다시 원심 분리합니다. 이제 튜브당 90 µL의 분리 완충액으로 세포를 재현탁하고, 세포 현탁액에 10 µL의 anti-Sca1 FITC 1차 항체를 혼합합니다. 4 °C의 암소에서 10분간 배양한 후, 튜브당 1 mL의 분리 완충액으로 세포를 세척합니다.원심분리 후, 각 세포 현탁액당 80 µL의 분리 버퍼로 세포를 재현탁합니다. 그다음 각 웰에 20 µL의 Anti-FITC Microbeads를 혼합하고, 플레이트를 4 °C에서 빛 차단 상태로 15분 동안 둡니다. 배양이 끝나면, 1 mL의 분리 버퍼로 세포를 세척하고, 튜브당 500 µL의 신선한 버퍼로 세포를 재현탁합니다.이제 자석 홀더에 컬럼을 장착하고, 500 µL의 분리 버퍼로 컬럼을 헹굽니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 피하 지방 패드 조직 배양 세포를 컬럼으로 옮기고, 라벨이 붙지 않은 Sca1 음성 세포를 15 mL 원심 튜브에 수집합니다. 모든 세포가 통과하면, 500 µL의 분리 버퍼로 컬럼을 세 번 세척합니다.그런 다음 자석에서 컬럼을 분리하여 새로운 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮기고, 1 milliliter의 신선한 분리 버퍼를 컬럼에 통과시켜 Sca1 양성 세포를 용출합니다. 마지막으로 Sca1 양성 및 음성 세포 분획을 모두 원심 분리한 후, 펠렛을 1 milliliter의 배양 배지에 다시 현탁합니다. 그런 다음 각 분획의 세포 수를 측정하고, 새로운 6-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 각 분획을 분주합니다.피하 지방에서 분리된 혈관 기질 세포는 Sca1 발현 수준과 관계없이 섬유아세포와 유사한 신장된 세포 형태를 보입니다. 피하 서혜부 지방 유래 Sca1 high 세포와 마찬가지로, 내장 부고환 지방 유래 Sca1 high 세포 또한 신장된 섬유아세포 유사 세포 형태를 나타냅니다. 반면, VIS Sca1 low 세포는 상피세포 유사 형태를 보입니다.Sca1-GFP 마우스에서 분리된 Sca1 high 세포는 조직 배양 시 GFP 양성 세포로 쉽게 식별할 수 있습니다. 실제로, 이 세포들을 유세포 분석법으로 평가했을 때, GFP 양성 세포의 대부분이 anti-Sca1 항체로 검출되는 Sca1 단백질을 세포 표면에 발현하는 것으로 확인되었습니다. 실시간 PCR 분석과 결합하여, 서혜부 및 부고환 지방 유래 Sca1 high 지방 유래 줄기세포 간의 콜라겐 분해 매트릭스 메탈로프로테이나제의 차등 발현을 입증할 수 있습니다.또한, 세포 주변 분해 활성을 평가하기 위해 플루오레세인(fluorescein) 표지 type I collagen 겔을 사용하면, 내장 Sca1 high 지방 유래 줄기세포에 의해 매개되는 콜라겐 리모델링 활성이 현저히 증가하는 것이 관찰됩니다. 숙달되면, 적절히 수행했을 때 지방 패드 세포 분리를 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 효율적인 지방 패드 분리를 보장하기 위해 수술 부위를 깨끗하고 정돈된 상태로 유지하는 것이 중요합니다.이 절차를 마친 후, 콜라겐 분해 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여 지방 유래 줄기세포가 매개하는 조직 리모델링에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 비만 및 매트릭스 생물학 분야의 연구자들은 생쥐와 인간의 지방 조직 리모델링 및 기능에서 지방 유래 줄기세포의 역할을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 지방 조직 저장소로부터 일차 Sca1 양성 세포를 확보하고 농축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다.  우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

이 프로토콜은 배식물 방법을 사용하여 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 효소 없는 방법을 제공한다. 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계의 부재는 시험관 내 연구에 사용되거나 클리닉으로 다시 전송될 수 있는 임상적으로 관련된 줄기 세포를 제공합니다.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

세포 치료제 준비/조작 단계에 도입된 이종(화학적 또는 동물 유래) 제품은 숙주 환자에서 면역 반응성 및 병원성 전파의 위험 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 시험관내 확장을 위한 완전한 이종발생학적 무함유 방법이 기재되어 있다.

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

이 프로토콜은 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC) 배양 및 상층액 수집부터 초원심분리를 사용한 세포외 소포체(EV) 추출에 이르기까지 모든 절차를 설명합니다.

Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells의 세포외 소포체의 정제 및 특성 분석

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

배우세요 콜라게나아제 소화와 면역자기 분리를 이용하여 마우스 지방 조직에서 Sca1 양성 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법입니다. 이 기술은 지방 유래 줄기세포 연구와 재생의학에 활용됩니다.

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리

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