지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리 ^높은 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 마우스 지방 패드에서 Sca1 양성 중간엽 줄기 세포를 분리하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 면역자기 비드 기반 세포를 사용하여 서로 다른 지방 저장소에서 지방 유래 줄기 세포를 효과적으로 농축할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 연구자는 콜라겐분해효소 매개 조직 소화의 강도와 지속 시간을 최적화하여 분류를 위한 적절한 수의 세포를 확보해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

피하 지방 패드를 분리하려면 먼저 누운 자세의 폼 해부 보드에 마우스를 놓고 동물에 70% 에탄올을 분사합니다. 발을 보드에 고정한 후 하복부 피부를 작게 절개합니다. 그런 다음 집게로 상처의 윗부분을 잡고 가위를 사용하여 복부에서 흉부까지 피부와 복막을 분리합니다.

몸의 측면을 따라 피부를 옆으로 자르면 피부가 복막에서 머리 쪽으로 반사됩니다. 그런 다음 남은 피부를 뒤로 당겨 서혜부 지방을 몸에서 멀리 유지하고 22게이지 바늘을 사용하여 피부를 보드에 고정합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 복막 근처의 원점에 있는 서혜부 지방 패드 하나를 잡고 가는 가위를 사용하여 피부와 서혜부 지방 사이를 자르고 사타구니 쪽으로 진행하면서 피하 지방 패드가 피부로 오염되지 않도록 합니다.

그런 다음 분리된 서혜부 지방 패드를 섭씨 37도의 배양 배지가 들어 있는 SQ 라벨이 부착된 60mm 접시에 넣고 같은 방식으로 동물의 다른 쪽에서 서혜부 지방 패드를 수확합니다. 내장 지방 패드를 분리하려면 복막을 잘라 내장 지방 패드와 장을 노출시킵니다. 그런 다음 장을 흉부 쪽으로 옆으로 움직입니다.

말단부의 내장 지방 패드를 잡고 지방 조직을 부드럽게 잡아당겨 해부하면서 부고환 조직을 배제하도록 주의하면서 해부합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 배양 배지가 들어 있는 VIS 라벨이 표시된 60mm 접시에 지방 패드를 놓습니다. 모든 지방 패드가 수집되면 접시를 조직 배양 후드로 옮기고 배지를 흡인합니다.

구부러진 가위를 사용하여 패드를 다집니다. 그런 다음 갓 준비한 콜라겐 분해 효소가 들어있는 개별 50 밀리리터 튜브에 지방 조각을 추가합니다. 그런 다음 조직이 소화될 때까지 300RPM과 37°C에서 10-20분 동안 튜브를 흔듭니다.

피하 지방 패드 조직의 일부 조각이 여전히 보일 수 있습니다. 콜라겐분해효소 용액에 20ml의 배양액을 첨가하여 분해를 중단하고, 10ml의 혈청학적 피펫을 사용하여 조직 슬러리를 10회 흡인 및 분주하여 분해된 조직을 완전히 분리합니다. 100미크론 세포 스트레이너를 통해 세포를 여과하고 조직을 원심분리합니다.

그런 다음 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 배지를 조심스럽게 디캔팅하고 두 그룹의 세포를 5ml의 멸균수에 부드럽게 재현탁시킵니다. 적혈구가 용해될 때까지 2분 동안 기다립니다. 그런 다음 FBS가 보충된 25ml의 배지로 각 튜브에서 반응을 정지시킵니다.

새로운 100 미크론 세포 여과기를 통해 두 지방 세포 집단을 모두 필터링하고 다시 스핀다운한 다음 펠릿을 1-3밀리리터의 배지로 재현탁합니다. 트리판 블루 배제에 의한 카운팅 후, 6번째 피하 지방 패드 세포와 내장 세포를 6웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 10번 별도로 플레이트합니다. 세포를 트립신화한 후 트립신을 1ml의 분리 완충액으로 희석한 다음 배양판을 원심분리합니다.

분리 완충액 튜브당 500마이크로리터에 세포를 현탁시키고 세포를 다시 원심분리합니다. 이제 분리 완충액 튜브당 90마이크로리터에 세포를 재현탁하고 10마이크로리터의 항-Sca1 FITC 1차 항체를 세포 현탁액에 혼합합니다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 10분 동안 배양한 후 튜브당 1ml의 분리 완충액으로 세포를 세척합니다.

방사 후, 세포는 세포 현탁액당 80마이크로리터의 분리 완충액에 재현탁됩니다. 그런 다음 20마이크로리터의 Anti-FITC 마이크로비즈를 각 웰에 혼합하고 플레이트를 섭씨 4도에 놓고 15분 동안 빛으로부터 보호합니다. 배양이 끝나면 1ml의 분리 완충액으로 세포를 세척하고 튜브당 500마이크로리터의 새 완충액에 세포를 재현탁합니다.

이제 마그네틱 홀더에 컬럼을 놓고 500마이크로리터의 분리톤 버퍼로 컬럼을 헹굽니다. 기포가 생기지 않도록 주의하면서 피하 지방 패드 조직 배양에서 세포를 컬럼으로 옮기고, 표지되지 않은 Sca1 음성 세포를 15ml 원추형 튜브에 수집합니다. 모든 세포가 통과하면 500마이크로리터의 분리 완충액으로 컬럼을 세 번 세척합니다.

그런 다음 자석에서 컬럼을 새로운 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 컬럼을 통해 1ml의 새로운 분리 버퍼를 주입하여 Sca1 양성 세포를 용리시킵니다. 마지막으로, Sca1 양성 및 음성 세포 분획을 모두 스핀다운하고 펠릿을 1ml의 배양 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 각 분획의 세포 수를 세고 새로운 6웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 분획을 플레이트화합니다.

피하 지방에서 분리된 혈관 기질 세포는 Sca1 발현 수준에 관계없이 섬유아세포와 같이 늘어난 세포 모양을 나타냅니다. 피하 서혜부 지방 유래 Sca1 고세포와 마찬가지로 내장 부고환 지방 유래 Sca1 고세포는 늘어난 섬유아세포와 같은 세포 모양을 나타냅니다. 반면 VIS Sca1 저세포는 상피(epithelioid) 모양을 나타냅니다.

분리된 Sca1-GFP 마우스에서 분리된 Sca1 고세포는 조직 배양에서 GFP 양성 세포로 쉽게 식별됩니다. 실제로, 이러한 세포를 유세포 분석으로 평가할 때, 대부분의 GFP 양성 세포는 항 Sca1 항체에 의해 검출된 바와 같이 세포 표면에서 Sca1 단백질을 발현하는 것으로 확인되었습니다. Real-Time PCR 분석과 결합하여 서혜부 및 부고환 지방 유래 Sca1 고지방 유래 줄기세포 간의 콜라겐 분해 기질 금속단백분해효소의 차등 발현을 입증할 수 있습니다.

또한, 플루오레세인(fluorescein)으로 표지된 I형 콜라겐 겔을 사용하여 세포주위 분해 활성을 평가하면 내장 Sca1 고지방 유래 줄기세포를 매개하는 콜라겐 리모델링 활성이 현저히 증가하는 것이 관찰됩니다. 일단 숙달되면 지방 패드 세포 분리가 제대로 수행되면 2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 효율적인 지방 패드 격리를 보장하기 위해 깨끗하고 체계적인 수술 부위를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 콜라겐 분해 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 지방 유래 줄기세포 매개 조직 리모델링에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 비만 및 기질 생물학 분야의 연구자들이 생쥐와 인간의 지방 조직 리모델링 및 기능에서 지방 유래 줄기세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 지방 조직 저장소에서 1차 Sca1 양성 세포를 조달하고 농축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.