지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 마우스 지방 패드에서 Sca1 양성 중간엽 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 면역 자성 비드 기반의 세포 분리를 통해 서로 다른 지방 저장소에서 유래한 지방 유래 줄기세포를 효율적으로 농축하여 후속 실험에 활용할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 분리에 필요한 충분한 수의 세포를 확보하기 위해 콜라게나제 매개 조직 소화의 강도와 시간을 최적화하는 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.

피하 지방 패드를 분리하려면, 먼저 마우스를 폼 해부판 위에 배를 위로 향하게 놓은 다음 70% ethanol을 분사합니다. 발을 해부판에 고정한 후, 하복부 피부에 작은 절개창을 냅니다. 그런 다음, 핀셋으로 절개 부위의 상단을 잡고 가위로 복부에서 흉부까지 피부와 복막을 분리합니다.

몸의 측면을 따라 피부에 외측 절개를 넣은 후, 피부를 복막에서 머리 방향으로 젖힙니다. 그런 다음, 서혜부 지방을 몸에서 떼어낸 상태로 유지하며 남은 피부를 뒤로 당기고, 22 gauge 바늘을 사용하여 피부를 보드에 고정합니다. 다음으로, 포셉을 사용하여 복막 근처의 서혜부 지방 패드 기시부를 잡고, 미세 가위를 사용하여 피부와 서혜부 지방 사이를 서혜부 방향으로 절개하며, 이때 피부가 피하 지방 패드를 오염시키지 않도록 주의합니다.

그 다음, 분리한 서혜부 지방 패드를 37 °C 배지가 담긴 SQ 표기 60 mm 디시에 넣고, 동물의 반대편 서혜부 지방 패드도 동일한 방식으로 채취합니다. 내장 지방 패드를 분리하려면 복막을 절개하여 내장 지방 패드와 장을 노출시킵니다. 그런 다음 장을 흉부 쪽으로 밀어 옆으로 치웁니다.

원위단에 있는 내장 지방 패드를 잡고 지방 조직을 부드럽게 끌어올려, 부고환 조직이 포함되지 않도록 주의하며 절제합니다. 그 다음, 37 °C의 배지가 들어 있는 VIS 라벨이 부착된 60 mm 디쉬에 지방 패드를 넣습니다. 모든 지방 패드가 수집되면, 디쉬를 조직 배양 후드로 옮기고 배지를 흡입하여 제거합니다.

곡선 가위를 사용하여 지방 패드를 잘게 다집니다. 그런 다음, 다져진 지방 조각들을 갓 준비한 collagenase가 들어 있는 개별 50 milliliter 튜브에 넣습니다. 다음으로, 조직이 완전히 소화될 때까지 300 RPM, 37 degrees Celsius에서 10분에서 20분 동안 튜브를 흔들어 줍니다.

피하 지방 패드 조직의 일부가 여전히 보일 수 있습니다. 소화를 중단시키기 위해 콜라게나아제 용액에 20 milliliters의 배양액을 추가하고, 10 milliliter 세롤로지컬 피펫을 사용하여 조직 슬러리를 10회 흡입 및 분사하여 소화된 조직을 완전히 분리합니다. 세포를 100 micron 세포 스트레이너로 여과한 후, 조직을 원심분리합니다.

그 다음 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 배지를 조심스럽게 따라내고, 두 세포군 모두를 5 mL의 멸균수에 부드럽게 재현탁합니다. 적혈구가 용해될 때까지 2분 동안 기다립니다. 그런 다음 각 튜브에 FBS가 첨가된 배지 25 mL를 넣어 반응을 중지시킵니다.

두 지방세포 집단을 새로운 100 micron 세포 스트레이너로 여과하고 다시 원심 분리한 후, 펠렛을 1~3 mL의 배지에 재현탁합니다. trypan blue 배제법으로 세포 수를 센 후, 1×10⁶개의 피하 지방패드 세포와 내장 지방 세포를 각각 6-well 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 분주합니다. 세포를 트립신 처리한 후, 트립신을 1 mL의 분리 버퍼로 희석하고 배양 플레이트를 원심 분리합니다.

튜브당 500 µL의 분리 완충액으로 세포를 현탁한 후, 세포를 다시 원심 분리합니다. 이제 튜브당 90 µL의 분리 완충액으로 세포를 재현탁하고, 세포 현탁액에 10 µL의 anti-Sca1 FITC 1차 항체를 혼합합니다. 4 °C의 암소에서 10분간 배양한 후, 튜브당 1 mL의 분리 완충액으로 세포를 세척합니다.

원심분리 후, 각 세포 현탁액당 80 µL의 분리 버퍼로 세포를 재현탁합니다. 그다음 각 웰에 20 µL의 Anti-FITC Microbeads를 혼합하고, 플레이트를 4 °C에서 빛 차단 상태로 15분 동안 둡니다. 배양이 끝나면, 1 mL의 분리 버퍼로 세포를 세척하고, 튜브당 500 µL의 신선한 버퍼로 세포를 재현탁합니다.

이제 자석 홀더에 컬럼을 장착하고, 500 µL의 분리 버퍼로 컬럼을 헹굽니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 피하 지방 패드 조직 배양 세포를 컬럼으로 옮기고, 라벨이 붙지 않은 Sca1 음성 세포를 15 mL 원심 튜브에 수집합니다. 모든 세포가 통과하면, 500 µL의 분리 버퍼로 컬럼을 세 번 세척합니다.

그런 다음 자석에서 컬럼을 분리하여 새로운 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮기고, 1 milliliter의 신선한 분리 버퍼를 컬럼에 통과시켜 Sca1 양성 세포를 용출합니다. 마지막으로 Sca1 양성 및 음성 세포 분획을 모두 원심 분리한 후, 펠렛을 1 milliliter의 배양 배지에 다시 현탁합니다. 그런 다음 각 분획의 세포 수를 측정하고, 새로운 6-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 각 분획을 분주합니다.

피하 지방에서 분리된 혈관 기질 세포는 Sca1 발현 수준과 관계없이 섬유아세포와 유사한 신장된 세포 형태를 보입니다. 피하 서혜부 지방 유래 Sca1 high 세포와 마찬가지로, 내장 부고환 지방 유래 Sca1 high 세포 또한 신장된 섬유아세포 유사 세포 형태를 나타냅니다. 반면, VIS Sca1 low 세포는 상피세포 유사 형태를 보입니다.

Sca1-GFP 마우스에서 분리된 Sca1 high 세포는 조직 배양 시 GFP 양성 세포로 쉽게 식별할 수 있습니다. 실제로, 이 세포들을 유세포 분석법으로 평가했을 때, GFP 양성 세포의 대부분이 anti-Sca1 항체로 검출되는 Sca1 단백질을 세포 표면에 발현하는 것으로 확인되었습니다. 실시간 PCR 분석과 결합하여, 서혜부 및 부고환 지방 유래 Sca1 high 지방 유래 줄기세포 간의 콜라겐 분해 매트릭스 메탈로프로테이나제의 차등 발현을 입증할 수 있습니다.

또한, 세포 주변 분해 활성을 평가하기 위해 플루오레세인(fluorescein) 표지 type I collagen 겔을 사용하면, 내장 Sca1 high 지방 유래 줄기세포에 의해 매개되는 콜라겐 리모델링 활성이 현저히 증가하는 것이 관찰됩니다. 숙달되면, 적절히 수행했을 때 지방 패드 세포 분리를 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 효율적인 지방 패드 분리를 보장하기 위해 수술 부위를 깨끗하고 정돈된 상태로 유지하는 것이 중요합니다.

이 절차를 마친 후, 콜라겐 분해 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여 지방 유래 줄기세포가 매개하는 조직 리모델링에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 비만 및 매트릭스 생물학 분야의 연구자들은 생쥐와 인간의 지방 조직 리모델링 및 기능에서 지방 유래 줄기세포의 역할을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 지방 조직 저장소로부터 일차 Sca1 양성 세포를 확보하고 농축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.