그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

이 속도 구배 원심분리의 전반적인 목표는 유입된 바이러스가 세포 진입 중에 만나는 내포성 환경을 모방한 조건에서 인플루엔자 A 바이러스 캡시드를 분석하는 것입니다. 이 방법은 인플루엔자 A 바이러스 캡시드가 세포 진입 중에 어떻게 분해되는지에 대한 주요 질문(예: 약산성 pH가 캡시드 안정성에 미치는 특정 영향)에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정의된 실험 조건에서 인플루엔자 A 바이러스 코팅 제거 공정의 정량 분석이 가능하다는 것입니다.

인플루엔자 A 바이러스 언코팅이 시작되는 방법에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 이 방법은 관련 코팅 해제 메커니즘이 있는 다른 외피 바이러스 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 전 학생인 Firat Nebloglu입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 스톡 버퍼와 시약을 준비한 후, 테스트할 각 pH 조건에 대해 9ml의 1몰 염화나트륨, 6ml의 10%NP40, 2.4ml의 25X 프로테아제 억제제 스톡, 9ml의 이중 증류수를 혼합하여 세제 버퍼 마스터 믹스를 준비합니다.

그런 다음 각 pH 조건에 대해 마스터 믹스 4.4ml를 50ml 원뿔형 튜브에 피펫팅합니다. pH 값이 5.8 이상인 경우 각 pH 조정 500milliMolar Tris 스톡 용액을 튜브에 0.6ml를 추가합니다. pH 값이 5.8 이하인 경우 각 pH 조정 500milliMolar MES 원액을 0.6ml씩 추가합니다.

300 milliMolar sodium chloride, 2X 프로테아제 억제제, pH 7.4로 조정된 60 milliMolar Tris 및 이중 증류수를 포함하는 5ml의 완충 용액을 만듭니다. 이것은 세제가 없는 제어 그라디언트 버퍼 역할을 합니다. 다음으로, 50% 글리세롤 스톡을 5ml의 세제 함유 및 무세제 완충액 혼합물 5ml에 첨가하여 6개의 서로 다른 25% 글리세롤 용액을 생성합니다.

pH 스트립을 사용하여 pH 값을 확인합니다. 50% 글리세롤 스톡을 3-7 비율로 혼합하여 15% 글리세롤 용액을 증류수와 혼합하여 준비합니다. 5ml 주사기와 바늘을 사용하여 6개의 초투명 원심분리 튜브에 15% 글리세롤 용액 3ml를 추가합니다.

매 단계 후에 이중 증류수로 바늘을 씻으십시오. 5ml 주사기와 긴 바늘을 사용하여 15% 글리세롤 층 아래에 3.4ml의 25% 글리세롤 용액을 조심스럽게 주입하고 두 층이 섞이지 않도록 주의하십시오. 두 레이어 간의 인터페이스를 명확하게 볼 수 있습니다.

6가지 조건 모두에 대해 이 작업을 반복하여 각각의 pH 조정 글리세롤 용액으로 테스트합니다. 다음으로, Class II 생물 안전 캐비닛에서 인플루엔자 A 바이러스가 포함된 정제되고 희석된 알란토산 유체 1ml를 사용하여 글리세롤 구배를 부드럽게 오버레이합니다. 튜브를 로터 버킷으로 옮기고, 반대쪽 튜브의 균형을 맞추고, 예냉각된 SW-41 초원심분리 로터에 조심스럽게 넣습니다.

2100rpm 및 섭씨 12도에서 150분 동안 원심분리기. 원심분리 후 깨끗한 파스퇴르 피펫과 흡인기를 사용하여 두 글리세롤 층을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 40mL의 1X 비환원 LDS 시료 버퍼를 사용하여 시료를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기기 전에 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 완전히 재현탁합니다.

SDS-PAGE를 수행하려면 모든 샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열합니다. 용해된 펠릿 20마이크로리터를 프리캐스트 그래디언트 Bis-Tris 미니 젤에 로드하고 200X MOPS SDS 러닝 버퍼에서 1시간 동안 볼트로 실행합니다. 고정 용액에서 젤을 1시간 동안 배양합니다.

물로 1-2회 헹구고 15cm 세포 배양 접시에 충분한 양의 콜로이드 Coomassie 용액을 넣고 실온에서 부드럽게 흔들면서 밤새 염색합니다. 겔을 이중 증류수로 제거하고 겔 배경이 깨끗해질 때까지 15-20분마다 액체를 교체합니다. 밴드 정량화를 위해 스캔할 때까지 섭씨 4도의 이중 증류수에 겔을 보관하십시오.

마지막으로, 고해상도로 겔을 스캔하고 단백질 밴드 강도의 정량화를 위해 상업적으로 이용 가능한 맞춤형 소프트웨어를 사용합니다. 각 대역에 가까운 영역에서 배경 신호를 빼고 값을 세제가 없는 제어 값으로 정규화합니다. 이 실험에서, 정화된 알란토산 유체에서 파생된 X31을 7.4 및 5.0 사이의 pH 수준에서 속도 구배 원심분리를 실시하고 SDS-PAGE로 분석했습니다.

구배에 세제가 존재하지 않으면, 온전한 비리온은 쿠마시(Coomassie) 염색 겔에서 HA, NP 및 M1을 나타내는 밴드의 특징적인 패턴에 의해 반영된 것처럼 펠릿화됩니다. 하단 글리세롤 층에 NP40을 첨가하면 HA, NA 및 M2를 포함한 바이러스 외피가 가용화되고 초원심분리 중에 바이러스 코어만 펠릿에 침전되었습니다. 6.5 미만의 pH에서 시작하여 펠릿 분획에서 M1이 점차 손실되어 pH 5.8과 pH 5.4 사이의 최소값에 도달합니다.

pH 5.8 이하에서는 vRNP가 해리되어 펠릿에서 손실되었습니다. 분석된 단백질 밴드에서 pH 6.5 및 pH 5.8을 포함하여 M1 층의 분해와 vRNP 다발의 해리에 대한 두 가지 뚜렷한 pH 임계값이 밝혀졌습니다. 이 절차를 시도하는 동안 특정 인플루엔자 A 바이러스 균주 또는 돌연변이에 따라 다른 분해 특성이 관찰될 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 전자 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 분리된 인플루엔자 바이러스 캡시드의 구조와 같은 추가 통찰력을 얻을 수 있습니다.