Name: 실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 배우세요 기관지 발달 중 Wnt 신호 전달을 연구하는 방법을 배우세요. 유전자 변형 마우스 모델과 염색 기술을 사용하여 호흡기 패턴 형성과 연골 발생을 분석하는 이 기법은 폐 생물학 연구에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 조직 학적 절차에 마이크 Muntifering 및 공 초점 이미지와 매트 코프 론 (Kofron)와 게일 Macke의 도움을 인정합니다. 이 작품은 부분적으로 건강 NHLBI의 국립 연구소 (DS에 K01HL115447)에 의해 지원되었다.

동물은 무균 상태에서 보관 하였다. 마우스는 CCHMC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (신시내티, OH USA)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 처리 하였다. 이러한 연구를 통해 이용 마우스가 혼합 된 배경에서 유지 하였다. 1. 전체 마운트 X - 갈 락토시다 제 염색 <ol><li> CO 2 흡입에 의해, E14.5에 E11.5에서 임신 여성을 안락사. , CO 2 챔버에서 동물을 배치 CO 2 챔버를 부과합니다. 5 분의 최소 챔버에서 동물을 유지한다. 자궁 전위에 의해 안락사의 보조 방법을 수행합니다. </li><li> 에탄올 (EtOH로) 70 % 단일 복부 정중선 절개 개복술을 수행 청소 복부 영역입니다. 수술 가위 및 표준 패턴 (직선 톱니) 집게를 활용합니다. </li><li> 페트리 접시에 배치 즉시 집게 및 미세 가위를 사용하여 자궁 뿔을 분리하고 조직을 PBS 용액을 냉각 함유. 진행까지 얼음에 조직을 유지배아의 분리합니다. </li><li> 자궁 뿔에서 배아를 분리합니다. 해부 현미경을 사용하여 배아 기관 폐 조직을 해부하다. 상태에서 자궁 조직에 구멍과 배아를 해제 concepti하기 좋은 팁 집게와 가위를 사용한다. <ol><li> 배아 세포막을 나머지 제거합니다. 배아의 바늘 블레이드의 도움을 잘라 머리와 횡격막 아래의 하체 부분. 랜드 마크로 간을 찾습니다. </li><li> 배아의 흉부 영역의 분리 후, 몸 벽, 척추, 심장 사용 바늘 블레이드의 측면을 제거하기 위해 진행합니다. 기관 조직 부상을 방지하기 위해 심장을 제거하는 동안주의하십시오. 마지막으로, 조심스럽게 바늘 블레이드의 도움으로 식도를 잡아 당겨 기관에서 식도를 구분합니다. 얼음에 PBS 용액에 조직을 유지한다. </li></ol></li><li> 4 용액에 장소 조직은 유리 또는 전송 피펫을 사용하여 캡 튜브를 나사. 30 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 기관 폐 조직을 고정한다. 고정 후,PBS로 조직을 씻어. 세정하는 동안, X-여자 염색 용액 (5 mM의 K 3의 Fe (CN 추가) (6), (100 ㎕의 0.5 M 주식) 5 mM의 K 4의 Fe (CN) 6 (100 ㎕의 0.5 M 주) 2 밀리미터의 MgCl 2, (준비 20 ㎕의 1 M 주식) 0.01 %의 NaDOC (50 μl의 2 % 주), 0.02 % NP 4 O (100 ㎕를 2 % 주), 1 ㎎ / ㎖ X-여자 (20 mg을 500 μL / ㎖ 주) 및 9.13 ml의 10 ㎖의 최종 부피)으로 가져다 증류수. </li><li> 나머지 PBS를 제거하고 유리 바이알에 X-여자 염색 용액 2 ㎖를 추가합니다. 통에 트레이에 튜브를 놓습니다. 얼룩 조직 한 X-여자의 염색 액의 시간 2. 추가 처리 및 매립에 대한 4 시간 동안 X-여자 솔루션의 조직을 품어. </li><li> 3 % 디메틸 술폭 시드-PBS에서 세척 조직에 의해 반응을 정지. 5 분 동안 PBS에서 70 % 에탄올에서 각각 세척하고 저장을 3 회 헹군다. </li><li> 1 % 아가로 오스 / PBS 용액으로 배양 접시를 입력합니다. 아가로 오스 공고히 할 수 있습니다. 유리 전달 피펫을 사용하여, 아가로 공동의 조직을 올려PBS 용액으로 가득 ated 판. 해부 현미경을 사용하여 전체 마운트 사진. 시야에 적합한 필터를 선택합니다. </li><li> 더 나은 파라핀 삽입 및 절편에 대한 X-여자 염색 과정 샘플 사이트를 구별합니다. 미세 스크린 카세트에 넣어 샘플. <ol><li> 여섯 알코올의 변경 : 5 분 첫번째 변화와 나머지 각 변경 당 3 분 파라핀 삽입에 대한 샘플은 자동화 된 프로세서를 사용하여 다음과 같이 짧은주기를 설정 처리합니다. 크실렌의 세 가지 변화 : 5 분 첫번째 변화와 3 분 다음이 변경됩니다. 이전 단계는 30 ° C에서 수행됩니다. 25 분, 8 분, 5 분 : 마지막으로, 62 ° C에서 파라핀의 세 가지 변화를 수행합니다. </li></ol></li><li> 조직이 보트를 삽입의 바닥에 평평하게 누워 삽입하는 동양 샘플. 조심스럽게 삽입 배를 채우기 위해 파라핀을 추가합니다. 파라핀 응고 될 때까지 역을 내장의 냉각 판에 즉시 쿨. 보트를 삽입에서 블록을 제거합니다. 마이크로톰을 사용하여, 6 μm의 S를 생성ections. 전처리 - 슬라이드와 1 시간 동안 42 ° C에서 슬라이드 따뜻한 설정에 건조 슬라이드 마운트 부분. </li><li> 구워는 56 ºC에서 오븐에서 하룻밤 슬라이드. 랙에 슬라이드를 놓습니다. Deparaffinize 100 % 크실렌 세 변경, 10 분에 각각 슬라이드. 자일 렌 200 ㎖로 가득 요리를 염색 사용합니다. </li><li> 10 내지 30 초 동안 핵 패스트 레드 대조 염색 전에 PBS로 등급을 EtOH 시리즈 (100 %, 70 %, 50 % 및 30 %, 단계 당 1 분)을 사용하여 슬라이드를 재수. 수돗물로 5 분 핵 고속 레드 초과를 제거 할 때마다 세 번 슬라이드를 씻어. </li><li> 크실렌 기반 설치 미디어 미끄러지는 크실렌의 세 가지 변화 세척하기 전에 등급을 EtOH 시리즈의 슬라이드 (50 %, 70 % 및 100 %의 EtOH) (20 저러나 각 변경) 및 덮개를 탈수. </li></ol> 2. 렉틴 염색 <ol><li> 단계 1.4-1.1에 설명 된대로 E13.5 및 E14.5의 기관 폐 조직을 해부하다. 스크류 캡 바이알에 유리 전송 피펫에게 장소 조직을 사용. 2 ml의 기관 폐 조직 해결4 ℃에서 하룻밤 2 % PFA 솔루션입니다. 고정 후, PBS에서 10 분마다 세척을 위해 세 번 샘플을 씻어. </li><li> 완충 용액 10 ㎖의 최종 부피 보통 차단 준비한다. PBS의 8 ml의 BSA (1 %) 0.1 g을 추가합니다. BSA는 용해 할 수 있습니다. 염소 혈청 (2 %) 트리톤 X-100 (0.3 %)의 0.03ml의 0.2 ML을 추가합니다. PBS 10 ml의 최종 볼륨을 가져와. 실온에서 차단 완충액 0.5 ml를 1 시간 동안 차단 샘플. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 차단 버퍼를 제거하고 렉틴의 50 μg의 / μL, 10 % 염소 혈청과 PBS로 구성 렉틴 용액으로 교체합니다. 샘플 당 렉틴 용액 250 μl를 사용합니다. 4 ℃에서 밤새 품어. 알루미늄 호일과 조직을 포함하는 유리 병을 포함해야합니다. 렉틴 용액으로 배양 한 후, 10 분 동안 PBS로 세 번 샘플을 헹군다. </li><li> 샘플을 충당하기 위해 충분한 PBS를 포함하는 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에 장소 외식. 형광 - 해부 현미경을 사용하여 전체 마운트 사진. approp를 선택riate 필터는 형광을 검출한다. 렉틴 PNA 보통 GFP에 연결된다. </li></ol> 3. 전체 마운트 면역 형광 염색 및 공 초점 현미경 <ol><li> 4 ml의 유리 스크류 캡 바이알에 전송하고 4 % PFA에서 하룻밤 수정, 기관 폐 조직을 분리합니다. E11.5 조직은 2 % PFA에서 수정 될 수 있습니다. 메탄올 스토어 100 %. 시료는 -20 ° C에서 몇 개월까지 저장할 수있다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 메탄올을 제거하고 2 시간 동안 덴트의 블리치 (4 부 메탄올, 1 부 DMSO 1 부 30 % H 2 O 2)를 사용하여 샘플을 Permeabilize 하시려면. 다음 PBS에 희석 메탄올 등급 시리즈 하이드레이트 조직 : 100 % 메탄올, 75 % 메탄올, 50 % 메탄올, 25 % 메탄올, 100 % PBS. 수화의 각 단계에서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. </li><li> PBS로 희석 한 0.5 % 차단 시약 블럭 조직 교반하면서 실온에서 2 시간 (상세한 재료 참조). </li><li> 차단에 차 항체를 희석솔루션 (Sox9 1 : 100, Nkx2.1 1 : 200, αSMA 1 : 250), 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어. 실온에서 PBS 다섯 번 씻을 샘플. 1 시간 동안 각 세척을 수행합니다. </li><li> 0.5 % 차단 솔루션 (500) 희석 : 1에서 차 항체를 적용합니다. 조심스럽게 차 항체 간의 결합을 방지하기 위해 이차 항체를 선택합니다. 어두운 방에 4 ° C에서 밤새 품어. 세척 된 샘플을 실온에서 20 분간 3 회. 다음 PBS에 희석 메탄올 등급 직렬 샘플 탈수 : 25 % 메탄올, 50 % 메탄올을 75 % 메탄올, 100 % 메탄올, 10 분마다 단계. 참고 : 시료를 알루미늄 호일로 덮여 남아 있는지 확인하고 빛에 노출을 최소화 할 수 있습니다. 촬영까지 조직을 지금 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 전송 샘플은 사용자 정의 머레이의 맑은 용액의 약 200 μl를 19, 20 (2 부 벤질 벤조 에이트, 1 부 벤질 알코올) 즉시 BEF 메탄올과 맑은 제거, 무대 판을 제작하기광석 영상. 공 초점 현미경을 사용하여 사진. 프로세스 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석한다. </li></ol> 4. 세포 증식 <ol><li> 체중 100 μg의 BrdU의 / g 농도의 BrdU의 용액으로 복강 내 E11.5 임신 마우스를 주사. E12.5 또는 E13.5에서 배아를 프로토콜의 섹션 1에서 설명하고 분리로 여성을 희생. 칼 블레이드, 소비세 머리와 흉강 아래 신체의 아래 부분을 사용. </li><li> 4 ml의 캡 튜브를 나사에 가슴 조직을 놓고 하룻밤 4 % PFA 1 ㎖에 고정합니다. 30 %, 50 % 및 70 % 에탄올을 5 분마다 단계 : 세척에서 5 분 동안 PBS로 2 번 샘플은 다음과 같이 70 % 에탄올에 증류수까지 희석 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수. <ol><li> 중간 크기의 화면 카세트에 넣어 샘플. 사용 파라핀 삽입 및 자동 프로세서에 대한 프로세스 조직. 8 분 동안 알코올의 여섯 변화 각각 6 분 각각 세 가지 C에 대한 크실렌의 세 가지 변화를 다음과 같이주기를 설정25 분, 9 분, 8 분 동안 파라핀의 hanges. </li></ol></li><li> 1 시간 동안 42 ° C에서 슬라이드 따뜻한 설정에 슬라이드 준수 조직을 슬라이드에 섹션 1. 섹션에 설명 된대로 6 μm의 가로 또는 세로 섹션을 생성 할 수 있도록 원하는 위치에서 조직을 배향 파라핀에 포함. </li><li> 구워 슬라이드, 자신의 옆에, 하룻밤 56 ° C에서 오븐한다. 플라스틱 랙에 슬라이드를 놓습니다. 100 % 크실렌의 세 가지 변화, 변화 당 10 분 침지하여 탈 paraffinize 슬라이드. 완전히 슬라이드를 잠수함에 크실렌 200 ㎖를 사용합니다. PBS (5 분)로 등급을 EtOH 시리즈 (100 %, 70 %, 50 % 및 30 %, 교반 단계 당 5 분)를 이용하여 슬라이드를 재수. </li><li> 0.1 M 시트르산 18 ㎖의 시트르산 완충 monohydrated 혼합물을 100 ml의 0.1 M 시트르산 나트륨 용액 (82)을 준비하기 위해 10 mM의 시트르산을 완충액, pH가 6을 사용하여 항원 검색을 수행한다. <ol><li> 높은 전력에서 6.5 분 동안 항원 검색 솔루션과 전자 레인지로 가득 플라스틱 코 플린 항아리에 넣어 샘플. DIS 추가6 분 동안 40 % 전력에서 증발 - 시트 레이트 완충액 재가열을 보상하기 위해 코 플린 병에 물을 경작. </li><li> 물 위로, 6 분 동안 40 %의 전력으로 다시 재가열 코 플린 항아리를 채우십시오. 전자 레인지 시간은 사용하는 전자 레인지에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 슬라이드를 5 분 동안 PBS 다음 1 분, 증류수로 세척 슬라이드 전에 실온에서 20 분 동안 냉각시킵니다. PBS를 후 TBS를 함유하는 용액 (트리스 염기 2.425 g 및 1- 증류수 L로 희석 염화나트륨 8.765 g) 10 % 당나귀 혈청과 1 % BSA를 차단에서 2 시간 동안, 블록 슬라이드를 세척한다. </li></ol></li><li> 용액 (10 % 당나귀 혈청과 1 % BSA를 포함하는 TBS)를 차단에 희석 일차 항체를 추가합니다. BrdU의 (유사 분열 마커), Nkx2.1 (호흡기 상피) Sox9 및 αSMA (평활근 세포) (연골 세포를 야기 할 것이다). 4 ° C에서 밤새 슬라이드를 품어. 항체를 보존하기 위해 오버레이 방법을 사용합니다. 가스켓에 항체의 180 μl를 적용하고 커버 슬립 것처럼 슬라이드를 첨부핑. </li><li> 증류수로 슬라이드를 찍기로 가스켓을 분리합니다. 개스킷 제거한 후, TBS는 0.1 % 트윈 -20을 함유하는 여섯 5 분간 세척을 행하여 언 바운드 차 항체를 세척한다. <ol><li> 실온에서 1 시간 동안, 200 : 1의 희석 용액을 차단 희석 이차 항체로 슬라이드 부화. 그 중 원하지 않는 바인딩을 방지하기 위해주의 깊게 이차 항체를 선택합니다. 0.1 % 트윈을 포함하는 TBS로 3 ~ 5 분 세척을 수행하여 언 바운드 차 항체를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 두 번 0.1 M 트리스베이스에 슬라이드를 세척하고 5 분 동안 두 번 다음 0.05 M 트리스베이스. 또는 DAPI (1.5 μg의 / ㎖)없이 설치 미디어를 사용 coversliping 동안 슬라이드는 0.05 M 트리스베이스에 남아있을 수 있습니다. 저장 4 ° C에서 슬라이드 폴더에서 슬라이드와 알루미늄 호일로 폴더를 덮어 빛으로부터 보호합니다. </li></ol></li><li> 염색 및 사진 자동화 된 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다. 촬영 표지 세포 및 필드 당 총 세포 수를 계산20X 및 40X 총 세포에 세포 증식의 비율을 결정합니다. </li></ol>

<ol><li>Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of lung morphogenesis.</a> Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).</li>
<li>Morrisey, E. E., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+for+the+first+breath%3A+genetic+and+cellular+mechanisms+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development.</a> Dev Cell. 18, 8-23 (2010).</li>
<li>Fausett, S. R., Klingensmith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+the+foregut+tube%3A+developmental+origins+of+the+trachea+and+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2%2F2b+and+beta-catenin+signaling+are+necessary+and+sufficient+to+specify+lung+progenitors+in+the+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut.</a> Dev Cell. 17, 290-298 (2009).</li>
<li>Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+promotes+respiratory+progenitor+identity+in+mouse+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).</li>
<li>Cornett, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wntless+is+required+for+peripheral+lung+differentiation+and+pulmonary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development.</a> Dev Biol. 379, 38-52 (2013).</li>
<li>Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BEndodermal+Wnt+signaling+is+required+for+tracheal+cartilage+formation%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation&#34;.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Shannon, J. M., Hyatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+interactions+in+the+developing+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung.</a> Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).</li>
<li>Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme+specifies+epithelial+differentiation+in+reciprocal+recombinants+of+embryonic+lung+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea.</a> Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+regulates+Shh+and+Fgf10+signaling+during+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development.</a> Dev Biol. 287, 86-97 (2005).</li>
<li>Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+pulmonary+Wnt5a+directs+airway+and+vascular+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis.</a> Development. 135, 1365-1376 (2008).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+FGF-WNT+gene+regulatory+network+controls+lung+mesenchyme+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development.</a> Dev Biol. 319, 426-436 (2008).</li>
<li>Shu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+acts+upstream+of+N-myc%2C+BMP4%2C+and+FGF+signaling+to+regulate+proximal-distal+patterning+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung.</a> Dev Biol. 283, 226-239 (2005).</li>
<li>Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+OpdA+in+rat+models+of+organic+phosphorus+%28OP%29+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning.</a> Toxicology. 257, (2009).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2+signaling+is+necessary+and+sufficient+to+activate+the+airway+smooth+muscle+program+in+the+lung+by+regulating+myocardin%2FMrtf-B+and+Fgf10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression.</a> Dev Biol. 356, 541-552 (2011).</li>
<li>Mucenski, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+is+required+for+specification+of+proximal%2Fdistal+cell+fate+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).</li>
<li>Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-10+induces+SP-C+and+Bmp4+and+regulates+proximal-distal+patterning+in+embryonic+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).</li>
<li>Del Moral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Ott, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+in+large+insect+brains%3A+zinc-formaldehyde+fixation+improves+synapsin+immunostaining+and+preservation+of+morphology+in+whole-mounts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts.</a> J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sox9+by+Sonic+Hedgehog+%28Shh%29+is+essential+for+patterning+and+formation+of+tracheal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage.</a> Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).</li>
<li>Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+18+gives+growth+and+directional+cues+to+airway+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage.</a> Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).</li>
<li>Ahnfelt-Ronne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+protein+expression+patterns+in+intact+mouse+and+chicken+embryos+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs.</a> J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+analysis+of+chondrogenesis+in+limb+mesenchyme+from+individual+transgenic+%28hdf%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos.</a> Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).</li>
<li>Cohen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C%2FPDGFR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li>
<li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li>
</ol>

&quot;저자는 공개 아무것도 없어.&quot;

호흡 기관의 형태 형성의 기초 이벤트 완전히 도통기도의 패터닝에 필요한 공정, 특히 이해되지 않는다. 이전의 연구 개발 이식편 공기 - 액체 계면에서의 배양이나 마트 리겔 (21, 22)에 포함 된 상기 생체 외 기법을 이용 하였다. 성장 인자가 개발 기관의 패터닝 및 기관 연골의 형성에 미치는 영향이 연구에서 나타났다. 이러한 연구에 대한 제한은 상기 조직의 구조가 적절하게 유지되지 않기 때문에, 그들은 매우 연골의 생체 프로세스 요점을 되풀이하지 않을 수 있다는 것이다. 우리는기도를 행하는 과정에서 Wnt 신호의 역할을 연구 착수 접근은 전체 산 염색 기법, 면역 형광 이미징 결합 생체 연구에 포함 된 패터닝을. 전체 마운트 조직의 X-여자 염색은 그 자체로 다음ctioning 및 카운터 - 염색, 파라핀 섹션의 염색을 통해 이점을 제공합니다. 전체 마운트 염색의 Wnt / β-cateni...

호흡 기계의 개발은 복부 내배엽 foregut 1, 2에서 Nkx2.1 양성 세포의 모양과 배아 일 9 (E9)에 의해 시작된다. 튜브가 별개의 실체로 구별 할 수있는 경우 식도 - 기관 튜브 분리, E11.5에 의해 중간 엽 조직 (3)에 의해 둘러싸인 해결됩니다. Wnt 신호는 폐 무 발생 4,5가 발생합니다 내배엽 호흡기 상피 세포에서 내장의 중간 엽과 β-catenin의 삭제로 표현 subtype 중 Wnt2 및 Wnt2b의 삭제와 호흡기의 사양에 중요한 역할을한다. 우리의 이전 연구는 폐 형성 부전에서 내배엽 호흡기 결과에서, WLS, 모두의 Wnt 리간드의화물 수용체 매개 분비의 삭제를 결정, 폐 혈관 개발 및 기관 간엽 6,7의 잘못된 패턴의 결함. 이러한 데이터는 상피 간엽 CRO의 중요성을 지원그것은 또한 다른 연구 8,9에 도시 된 바와 같이, SS는, 세포 분화 및 명세서에 말한다. 폐 개발의 초기 단계의 연구는 우리가 더 나은 호흡 정체성 10-16 구동 메커니즘을 이해 할 수있는 생체 외 및 생체 기법, 유전자에 의존한다. 공기 액체 계면에서 전체 폐 이식편 배양 널리 형태 형성 10,17,18 분기 폐의 초기 단계에서 성장 인자의 효과를 연구하는데 이용되고있다. 이 방법 형태와 같은 분지 형태 형성과 같은 변경 및 유전자 발현 조절의 리드로서 사용되는 반면, 배양 자체가 혈관 (17)의 개발을 지원하지 않으므로, 발달 과정의 초기 연구에 제한되어있다. 기관 연골의 개발이 문화 기술과 호환되지 수 있습니다 이상 배양 시간이 필요합니다. analyz하려면호흡기 형성시 Wnt 신호의 역할 즉, 우리는 배아 연구의 요구를 충족하기 위해 표준 기술을 채택했다. 우리는 볼륨, 염색 시간, 기관 - 폐 조직의 청산을위한 파라핀 삽입 및 타이밍에 대한 처리 사이클을 수정했습니다. 본 연구에 기재된 기술을 최적화의 주요 목표는 E14.5로 E11에서 일어나는 생쥐 기관 발달의 초기 단계를 분석 하였다. 기자 마우스 라인 Axin2LacZ 개발 기관의 중간 엽에서의 Wnt / β-catenin이 활동의 우리 정확하게 결정된 사이트를 사용. 우리는 또한 전체 마운트 기관 조직에 대한 렉틴 염색 절차를 적용했다. 따라서, 우리는 중간 엽 응축을 시각화하고 연골이 일어날 사이트를 예측할 수 있었다. 전체 마운트 및 고급 현미경 기술과 결합 WlsShhCre 마우스에서 얻은 배아 조직의 섹션의 염색은 TRA에 의해 생산의 Wnt 리간드의 역할을 공개 할 우리에게 허용기관 패터닝에 cheal 상피.

<table><tbody><tr><td>안티 Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , 토끼</td></tr><tr><td>안티 Sox9 ab.</td><td>산타 크루즈</td><td>사우스 캐롤라이나 - 20095</td><td>1시 50분, 토끼</td></tr><tr><td>안티 평활 근육 Actin ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, 마우스</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>세븐 힐스</td><td>n / a</td><td>1:100, 기니피</td></tr>그 <tr><td>안티 NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:400, 마우스</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, 양</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, mouse</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>Life technologies</td><td></td><td>Alexa fluor Molecular probes</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP4O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher 브랜드 슈퍼 프로스트 플러스</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 세럼</td><td>시그마</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>차단 시약</td><td>TSA</td> 키트 #2의 생체 <td></td><td>성분; &nbsp; &nbsp; (T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 미디엄</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-loc 카세트 Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>생검 카세트</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>다양한 색상으로 사용 가능</td></tr><tr><td>핵 빠른 빨강&nbsp; Kernechtrot 0.1%</td><td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 삼염기성 이수화물</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>시그마</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 나이프</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 세라믹 코팅</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont</td><td>#5CO FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>니콘</td><td></td><td>광시야 현미경</td></tr><tr><td>NikonA1Rsi</td><td>니콘</td><td></td><td>컨포칼 현미경. 설정: NikonA1 plus 카메라, 스캐너: Galvano, 감지기: DU4. 광학 계획 Apo lambda 10X. 양식: 광시야 형광 레이저 컨포칼.&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Leica</td><td></td><td>형광 해부 현미경</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>Zeiss 자동</td><td></td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Leica 어플리케이션 제품군</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>이미징 처리 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

실시 항공의 패터닝 동안 wnt 신호를 공부

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt 신호 경로는 호흡기 발달 과정에서 중요한 역할을 합니다. Wnt 신호에 의해 제어되는 분화 및 형태 형성의 정확한 메커니즘을 정의하는 것은 정상적인 발달 중에 조직이 어떻게 패턴화되는지 이해하는 데 필요합니다. 이 지식은 또한 폐 형성 부전증(lung hypoplasia) 및 기관기관연화증(tracheobronchomalacia)과 같은 선천적 결함의 원인을 결정하는 데 중요합니다. 호흡기 발달의 초기 단계에 대한 분석은 조직의 양이 제한되어 산후 연구에 더 적합한 표준 프로토콜의 수행을 방해하기 때문에 어려움을 겪습니다. 이 논문에서는 호흡기에서의 세포 분화와 증식을 연구하는 방법론에 대해 논의합니다. 우리는 전체 마운트 염색, 컨포칼 현미경 검사를 위한 조직 처리 및 기관 폐 발달에 적용되는 파라핀 절편에서의 면역 형광과 같은 기술에 대해 설명합니다. 또한 기관 간엽 분화, 특히 연골 형성 연구를 위한 방법론에 대해서도 논의합니다. 본 논문에서 논의된 접근 방식과 기술은 배아 조직으로 작업하는 동안 재료의 한계를 우회하여 전도 기도 발달의 패터닝 과정을 더 잘 이해할 수 있도록 합니다.

이 Wnt / β-catenin의 활동 전체 마운트 락-Z 염색은 기자 Axin2 락 -Z 마우스 (11)에서 분리 된 배아의 기관 - 폐 조직에서 검출되었다. 염색 사이트의 Wnt / β-catenin의 활성을 나타냅니다. 전체 마운트 염색 부분의 분석의 Wnt / β-catenin의 활동이 기관의 중간 엽에서 개발 폐의 주변 영역의 중간 엽에 존재하는 것을 결정했다. (호흡기의 상피 세포에서의 Wnt 리간드의 분비가 폐지 된 것을 특징) WlsShhCre 배아에서 락-Z 염색 거의없는 (그림 1)이었다. 기관 중간 엽에서 중간 ...

전체 마운트에 연결된 리포터 생쥐 부 염색 현미경 및 생체 내 분석에 사용은 호흡기 정상 패터닝 기전의 분석을 용이하게한다. 여기에서 우리는 이러한 기술이 기관 개발하는 동안 Wnt 신호의 분석에 기여하는 방법에 대해 설명합니다.

실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

염색 절차의 전반적인 목표는 유전자 변형 마우스 모델의 배아 조직을 사용하여 상기도의 초기 발달 단계에서 Wnt 신호 전달 경로의 역할을 입증하는 것입니다. 이러한 방법은 전도성 기도의 지지 구조가 어떻게 패턴화되는지와 같이 폐 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.여기서 소개할 기술들은 기관 연골 형성의 핵심 사건인 세포 증식 또는 중간엽 응집 과정을 연구할 수 있게 해줍니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 양의 조직에도 사용할 수 있다는 점입니다. 여기에는 폐 외식편과 E11 배아에서 분리한 기관이 포함됩니다.일반적으로 이 절차를 처음 접하는 연구자는 샘플의 크기가 작고 사용 가능한 조직의 양이 제한적이기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 배아 조직을 다루는 데 익숙해져야 하며, 이를 위해 모든 단계에서 주의를 기울이고 단계별로 동일한 양의 조직이 확보되도록 해야 합니다. E11.5에서 E14.5 사이의 임신한 암컷 생쥐를 안락사시킨 후, 텍스트 프로토콜에 따라 개복술을 시행하고, 핀셋과 미세 가위로 자궁각을 분리하여 즉시 냉각된 PBS 용액이 담긴 페트리 접시에 넣으십시오.그 다음 디쉬를 얼음 위에 놓습니다. 자궁각에서 배아를 분리하기 위해, 미세 핀셋을 사용하여 자궁 조직을 잡습니다. 그리고 가위로 자궁 조직과 배아를 천자하여 배아를 방출시킵니다.다음으로, 남아 있는 배아 막을 모두 제거합니다. 그런 다음 해부 현미경 하에서 니들 블레이드를 사용하여 머리와 횡격막 아래의 하반신을 절단하고, 간을 지표로 삼아 위치를 확인합니다. 니들 블레이드를 사용하여 체벽의 측면, 척추 및 심장을 제거합니다.기관 조직이 손상되지 않도록 주의합니다. 배아 기관 폐 조직을 적출하기 위해, 니들 블레이드(needle blades)를 사용하여 식도를 당겨 기관에서 조심스럽게 분리합니다. 조직을 얼음 위의 PBS에 둔 후, 유리 피펫이나 전이 피펫을 사용하여 조직을 4 mm 스크루 캡 유리 바이알로 옮깁니다.PBS에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)를 첨가하고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 조직을 헹굽니다. 시료에서 PBS를 제거한 후, X-gal 염색 용액 2mm를 첨가하고 1~2시간 동안 배양하거나, 추가 처리 및 임베딩을 위해 4시간 동안 배양합니다.PBS에 3% DMSO를 첨가하여 조직을 5분씩 3회 세척함으로써 반응을 중단시킵니다. 그 다음 조직을 70% ethanol에 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 자동 조직 처리기를 사용하여 시료를 파라핀 매립 처리한 후, 매립 보트 바닥에 조직이 평평하게 놓이도록 시료의 방향을 잡습니다.파라핀을 조심스럽게 부어 임베딩 보트를 채우고, 파라핀이 응고될 때까지 즉시 임베딩 스테이션의 콜드 플레이트에 둡니다. 다음으로, 임베딩 보트에서 블록을 꺼내 마이크로톰을 사용하여 6 µm 두께의 절편을 제작합니다. 그런 다음 절편을 슬라이드에 부착합니다.절편들을 42 °C의 슬라이드 워머에 1 시간 동안 둡니다. 슬라이드를 56 °C 오븐에서 하룻밤 동안 굽습니다. 그런 다음, 시료의 파라핀을 제거하기 위해 구운 슬라이드를 랙에 넣고 100% xylene 200 mL가 채워진 염색 접시에 옮겨 10분씩 3회 반복합니다.슬라이드를 재수화하기 위해 단계별 에탄올 시리즈에 각각 1분씩 처리합니다. 그런 다음 Nuclear Fast Red를 사용하여 시료를 10~30초 동안 대조 염색합니다. 수돗물로 슬라이드를 5분씩 3회 헹굽니다.슬라이드를 탈수시키려면 단계별 에탄올 시리즈를 사용한 후, 자일렌을 세 번 교체하며 샘플을 세척하십시오. 그런 다음 자일렌 기반의 마운팅 매질과 커버 슬립을 사용하여 샘플을 마운팅합니다. 렉틴 염색을 수행하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 기관지 폐 조직을 고정하고 블로킹 버퍼를 준비한 후, 샘플을 0.5 milliliters의 블로킹 버퍼로 옮겨 실온에서 1시간 동안 배양하십시오.트랜스퍼 피펫을 사용하여 블로킹 버퍼를 제거하고, 샘플당 250 µL의 렉틴 용액으로 교체합니다. 그런 다음 알루미늄 호일로 유리 바이알을 덮고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 샘플을 헹군 후, 샘플이 충분히 잠길 정도의 PBS가 들어 있는 아가로스 코팅 페트리 접시에 외식물을 넣습니다.그 다음 형광 해부 현미경을 사용하여 전체 마운트 표본을 촬영합니다. 전체 마운트 표본에 면역형광 염색을 수행하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 고정한 후 전이 피펫을 사용하여 메탄올을 제거하고, 고농도 표백제를 첨가하여 2시간 동안 조직을 배양함으로써 샘플을 투과성 있게 만듭니다. PBS로 희석한 단계별 메탄올 시리즈를 사용하여, 각 단계에서 실온으로 10분씩 배양하여 조직을 수화시킵니다.텍스트 프로토콜에 따라 조직을 블로킹한 후, 1차 항체와 블로킹 용액을 첨가하고 시료를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 시료를 PBS로 세척한 후, PBS로 1:500로 희석한 2차 항체를 첨가하고 4°C의 암소에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 시료를 PBS로 20분씩 3회 세척한 후, PBS 내의 단계별 메탄올 시리즈를 사용하여 각 단계당 10분 동안 시료를 탈수합니다.샘플을 맞춤 제작된 스테이지 플레이트로 옮깁니다. 메탄올을 제거합니다. 그 다음 200 µL의 Murray's clear solution을 사용하여 샘플을 투명화합니다.공초점 현미경을 사용하여 즉시 촬영하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 E11.5 임신 마우스에 BrdU를 주입하고 E12.5 또는 E13.5에 배아를 분리한 후, 칼날을 사용하여 배아의 머리와 흉강 아래의 신체 하단부를 절제하십시오. 흉부 조직을 4 mL 스크류 캡 바이알에 넣고 4% PFA 1 mL를 추가하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 임베딩, 섹셔닝 및 재수화한 후, 슬라이드를 Coplin jar에 넣고 pH 6의 10 millimolar citrate buffer로 채웁니다. 샘플을 고출력으로 6분 30초 동안 전자레인지로 가열한 후, 증발한 citrate buffer를 증류수로 보충하고 다시 가열합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 슬라이드를 냉각, 세척 및 블로킹한 후, 블로킹 용액에 희석한 1차 항체 180 µL를 가스켓에 도포하고 커버 슬립을 덮는 것처럼 슬라이드를 부착합니다.다음 날, 슬라이드를 증류수에 담가 가스켓을 분리합니다. 그다음 0.1% Tween 20이 포함된 TBS를 사용하여 슬라이드를 5분씩 6회 세척합니다. 2차 항체로 슬라이드를 배양한 후, 0.1 molar Tris Base로 슬라이드를 5분씩 2회 세척하고, 이어서 0.5 molar Tris Base로 2회 세척합니다.마운팅 매질(DAPI 포함 또는 제외)을 추가하는 동안 슬라이드를 0.5 M Tris Base에 유지하고 커버 슬립을 덮습니다. 마지막으로, 자동 형광 현미경을 사용하여 샘플을 촬영하고 텍스트 프로토콜에 따라 분석합니다. Reporter 및 두 마리의 lacZ 마우스에서 분리한 기관-폐 조직의 전체 마운트 이미지에서, 기관의 중간엽과 발달 중인 폐의 주변부 영역에서 lacZ 염색이 검출되었으며, 이는 Wnt beta catenin 활성을 나타냅니다.본 실험에서는 E12.5에서 E14.5 단계의 기관지 폐 조직을 PNA 렉틴으로 염색하였습니다. 대조군 동물에서는 연골이 형성되는 중간엽에서 주기적인 밴드 형태의 형광이 검출되었습니다. 그러나 Wntless sonic hedgehog Cree 배아에서는 염색이 나타나지 않았으며, 이는 중간엽 응집에 Wnt 신호 전달이 필수적임을 나타냅니다.E11.5 배아의 기관 조직 전체 마운트(whole mount)에서 SOX9 발현은 중간엽에 연속적인 띠 형태로 제한되어 나타나는 반면, 발달 중인 폐에서는 호흡 상피의 주변부에서 SOX9이 관찰됩니다. 여기에서 보여지는 바와 같이, NKX2.1은 기관의 상피로 국한되어 나타납니다. 상피로부터 Wnt 리간드의 분비를 억제하면 중간엽에서의 SOX9 발현은 감소하지만, 폐 주변부 상피의 SOX9 발현에는 영향을 미치지 않습니다.알파 평활근 액틴(Alpha smooth muscle actin) 염색은 기관 조직에서 낮은 수준으로 검출되지만, 후두와 위에서는 뚜렷하게 관찰됩니다. 마지막으로, 이 그림에서 나타난 바와 같이, BrdU, SOX9 및 알파 평활근 액틴을 이용한 기관 조직의 in vivo 표시는 SOX9 염색 세포가 알파 평활근 액틴 염색 세포보다 더 높은 수준으로 증식함을 보여줍니다. 이러한 증식 패턴은 Wntless sonic hedgehog Cree 기관 조직에서 역전됩니다.숙달되면, 대부분의 기술은 올바르게 수행했을 때 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 2차 항체를 선택할 때 1차 항체의 기원을 기억하는 것이 중요합니다. 이는 모든 면역 염색에서 중요하지만, 특히 두 개 이상의 1차 항체를 사용할 때 더욱 중요합니다.X-galactosidase 염색 이후, Wnt 신호 전달 중에 특정 표적 유전자가 발현되는지 여부와 같은 추가적인 질문에 답하고 더 많은 정보를 얻기 위해 in situ hybridization과 같은 추가 기술을 수행할 수 있습니다. 여기서 제시하는 기술들은 Wnt 신호 전달이나 발달에 중요한 다른 핵심 신호 전달 경로에 의해 매개되는 조용한 패턴 형성 메커니즘에 관심이 있는 연구자들에게 유용할 것입니다. 이 영상을 시청하고 나면 호흡기 계통의 발달 과정 중 분화 과정을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.또한 전도성 기도의 패턴 형성에서 Wnt 신호 전달의 역할에 대해 더 깊이 이해하시기 바랍니다. paraformaldehyde 및 benzyl benzoate를 사용할 때는 장갑 착용, 후드 내에서의 용액 조제, 그리고 지역 법규 및 규정에 따른 폐액 처리와 같은 적절한 예방 조치를 취하는 것을 잊지 마십시오.

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

원고는 여기 Xenopus의에서 찬란 태그 리간드의 분비 및 확산을 분석하는 방법의 간단한 세트를 제공합니다. 이는 리간드 분포를 수정하는 다른 단백질의 능력을 시험하고 morphogen 기울기 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있도록 실험을위한 컨텍스트를 제공한다.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

여기, 선물이 시각화 4 차원 (4d)에서 zebrafish에 마음을 개발 하는 프로토콜. 빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)를 통해 4 차원 영상, 3 차원 (3 차원) 이미지 개발 마음을 재구성 하는 시간 걸립니다. 우리 그 전단 응력 활성화 endocardial 노치 신호 챔버 개발, 심장 trabeculation를 승진 시키는 동안 질적 및 양적 보여줍니다.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

미세유동 칩 상에서 마우스 배아 조직의 배양 및 조작을 위한 프로토콜이 제공된다. 경로 조절제의 펄스를 적용함으로써, 이 시스템은 마우스 소미토제네시스의 기능적 조사를 위해 신호전달 진동을 외부적으로 제어하는데 사용될 수 있다.

Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법

본 연구는 시험관 내에서  파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 사건을 연구하기 위한 매우 재현성 있고 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 쥐 신경 볏 세포 및 근모세포에서 파라크린 Wnt5a 신호 전달의 영향을 평가하기 위해 적용되었습니다.

체외에서 파라크린 비정규 Wnt 신호 전달 모델링

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

여기에서는 조직 상호 작용, 4D 이미징 타임랩스 동영상(3D 플러스 타임), 분자 기능의 전역 또는 국소 섭동 및 시스템 생물학 특성화를 검사하는 데 사용할 수 있는 세 가지 유형의 조류 배아 피부 이식 배양에 대한 프로토콜을 설명합니다.

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

이 기사는 T 세포 자손의 생성, 표현형 및 수의 동역학을 분석하여 흉선 침전 전구 세포를 특성화하는 생체 내 및 시험관 내 방법론에 대해 설명합니다.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

배우세요 기관지 발달 중 Wnt 신호 전달을 연구하는 방법을 배우세요. 유전자 변형 마우스 모델과 염색 기술을 사용하여 호흡기 패턴 형성과 연골 발생을 분석하는 이 기법은 폐 생물학 연구에 필수적입니다.

실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부

더 많은 동영상 탐색