단일 프로브의 응용 프로그램 : 주변 조건에서 질량 분석 이미징 및 단일 세포 분석

이 방법의 전반적인 목표는 마이크로 스케일 샘플링 장치인 Single-probe를 만들어 주변 조건에서 질량 분석법을 사용하여 살아있는 단일 세포를 분석하는 것입니다. 또한 높은 공간 분해능으로 생물학적 조직의 주변 질량 분석 이미징을 수행합니다. 이 방법은 생물학 및 제약 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 살아있는 단세포에 존재하는 분자는 무엇이며 조직에 어떻게 분포되어 있습니까? 이 기술의 주요 장점은 단일 프로브가 살아있는 단일 세포 분석과 고해상도 주변 질량 분석 이미징 실험 모두에 사용할 수 있는 다기능 장치라는 것입니다. 이 방법은 단일 세포 및 조직을 분석할 수 있지만, 화학 물질 및 살아있는 마이크로 콜로니 및 생물막의 스파 분석과 같이 마이크로 샘플링이 필요한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

저와 함께 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Wei Rao입니다. 관심 있는 전체 마우스 기관을 작은 플라스틱 우물의 중앙에 놓습니다. 장기를 약 10mm 높이까지 조직 포매 화합물에 담그십시오.

즉시 조직을 액체 질소에 넣어 급속 냉동하십시오. 생쥐 조직 절편을 준비하기 위해 냉동된 생쥐 장기를 채취하여 온도 조절이 가능한 극저온 절편절편으로 섭씨 15도까지 해동합니다. 약 500마이크로리터의 조직 매립 화합물이 있는 강철 베이스에 조직을 고정하고 원하는 절편 방향이 칼에 표시되도록 극저온 마이크로톰 절편 마운트에 놓습니다.

조직을 12미크론 두께로 절단합니다. 그런 다음 절편화된 조직 조각을 폴리카보네이트 현미경 슬라이드에 놓고 실온에서 30분 동안 건조시킵니다. 1ml의 HeLa 세포 현탁액과 같은 세포 샘플을 얻어 표준 10cm 세포 배양 플레이트에 있는 9mL의 완전한 세포 배양 배지에 추가합니다.

성장 표면이 세포 배양 플레이트에서 70-80%로 덮일 때까지 2-3일 동안 5% CO2로 세포를 섭씨 37도에서 배양하십시오. 세포 배양 플레이트에서 세포 계대를 수행합니다. 이를 위해 성장 배지를 흡인하고 5mL의 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 헹굽니다.

멸균 흡인 팁을 사용하여 PBS를 제거하고 섭씨 37도에서 약 5분 동안 2.5mL의 트립신으로 세포를 배양하여 배양 플레이트에서 세포를 분리합니다. 7.5mL의 완전한 세포 배양 배지를 첨가하여 트립신 활성을 중지한 다음 세포를 균일하게 재현탁합니다. 단일 세포 질량 분석 또는 SCMS 실험을 위해 세포 샘플을 준비하려면 먼저 개별 마이크로 커버 슬라이드를 12웰 플레이트의 웰에 배치합니다.

그런 다음 1.8mL의 세포 배양 배지와 0.2mL의 세포 현탁액을 웰에 추가합니다. 플레이트를 약간 교반하여 세포를 부드럽게 혼합한 후 섭씨 37도의 5%CO2 환경에서 약 24시간 동안 배양합니다. 배양된 세포의 약물 처리를 수행하기 위해 12웰 세포 배양 플레이트에 약물 화합물 용액을 첨가합니다.

이중 보어 석영 튜브를 레이저 마이크로 피펫 풀러에 넣고 이중 보어 석영 바늘을 당깁니다. 시작점으로 열을 400으로, 필라멘트를 3으로, 속도를 80으로, 지연을 150으로, 당김을 250으로 설정합니다. 다른 쪽 끝에 약 5mm의 당기지 않은 이중 보어 석영 모세관이 남도록 당김 팁을 자릅니다.

용제 제공 모세관으로 용융 실리카 모세관의 80mm 섹션을 자릅니다. 그런 다음 이중 보어 석영 바늘의 평평한 끝에 있는 한 구멍에 모세관을 삽입합니다. 화염을 사용하여 용융 실리카 모세관을 나노 ESI 이미터로 당기고 7-10mm 길이로 자르고 이중 보어 석영 바늘의 평평한 끝에있는 다른 구멍에 삽입합니다.

이중 보어 석영 바늘의 평평한 끝에 최소한의 UV 경화 수지를 도포합니다. LED UV 램프를 사용하여 약 20초 동안 수지를 응고시켜 용매 제공 모세관과 나노ESI 이미터를 고정합니다. 다음으로, 표준 현미경 유리 슬라이드를 세로로 반으로 자릅니다.

그런 다음 nanoESI 이미터가 바깥쪽을 향하도록 유리 슬라이드의 한쪽 끝에 단일 프로브를 놓습니다. 단일 프로브의 본체에 일반 에폭시를 적용하여 경화를 위해 밤새 방치하기 전에 유리 슬라이드에 고정되도록 합니다. 이 시스템에는 질량 분석기의 맞춤형 이온 소스 인터페이스 플랜지와 USB 디지털 현미경이 부착된 알루미늄 광학 보드, 소형 수동 XYZ 변환 스테이지 및 전동 XYZ 변환 스테이지 시스템이 포함되어 있습니다.

질량 분석기의 이온 소스 인터페이스 플랜지를 수정하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 디지털 실체 현미경의 스탠드를 제작합니다. 변형된 디지털 실체 현미경, USB 디지털 현미경, 유연한 클램프 홀더가 있는 소형 수동 XYZ 변환 스테이지 및 전동 XYZ 변환 스테이지 시스템을 알루미늄 광학 보드에 부착합니다. 플렉시블 cl 사용amp 홀더를 사용하여 단일 프로브로 부착된 유리 슬라이드를 고정합니다.

그런 다음 단일 프로브 설정을 질량 분석기에 연결합니다. 유연한 클램프 홀더와 소형 XYZ 스테이지를 조정하여 단일 프로브의 이미터를 질량 분석기의 입구 앞에 배치합니다. 실온에서 샘플 섹션을 해동하고 단일 프로브 아래의 전동 XYZ 변환 스테이지 시스템에 놓습니다.

제어 소프트웨어에서 좌표를 변경하여 샘플 위치를 조정하십시오. 주사기를 사용하여 샘플링 용매를 적절한 속도로 펌핑합니다. 그런 다음 이온화 전압을 가합니다.

단일 프로브의 높이를 조정하여 샘플 표면 바로 위에 놓이고 대사 산물의 표면 추출을 수행할 수 있도록 합니다. Z 스테이지를 조심스럽게 들어 올린 다음 USB 디지털 현미경을 사용하여 단일 프로브 팁과 조직 표면 사이의 거리 변화를 모니터링합니다. 샘플 내의 관심 섹션을 가로질러 래스터링하기 위한 매개변수를 설정합니다.

여기에 제시된 마우스 신장 절편의 경우 초당 10마이크로미터의 래스터링 속도와 선 간 20마이크로미터 거리를 사용합니다. 샘플 내의 관심 섹션을 가로질러 래스터링하기 위한 매개변수를 설정합니다. 여기에 제시된 마우스 신장 절편의 경우 초당 10.0마이크로미터의 래스터링 속도와 줄 사이의 거리를 20마이크로미터로 사용합니다.

질량분석기에서 MS 스펙트럼을 자동으로 획득하기 위한 방법을 설정합니다. 마우스 신장 샘플의 높은 질량 분해능 MSI의 경우 60, 000의 질량 분해능, 5kV 포지티브 모드, 1 마이크로 스캔, 150 밀리 초 최대 주입 시간 및 자동 이득 제어 켜기를 사용하십시오. MSI 데이터 수집을 시작한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원시 MS 파일에서 MS 이미지를 구성합니다.

MSI의 지침에 따라 단일 프로브 시스템을 설정하고 용매 유량을 조정합니다. 마이크로커버 유리 슬라이드에 부착된 배양된 세포를 PBS로 세척하여 배양 배지 및 세포 외 약물 성분을 제거합니다. 그런 다음 실험을 위해 세포가 포함된 유리 슬라이드를 전동 XYZ 번역 스테이지 시스템에 놓습니다.

디지털 실체 현미경을 샘플 위의 단일 프로브 팁에 초점을 맞춰 분석 중 세포 침투를 모니터링합니다. 단일 프로브 측면에 있는 USB 디지털 현미경을 사용하여 단일 프로브에서 nanoESI 이미터의 작동 상태를 모니터링합니다. 전동식 XYZ 스테이지 제어 프로그램과 디지털 실체 현미경을 사용하여 관심 세포를 찾고 샘플 위에 단일 프로브 팁을 정확하게 배치합니다.

단일 프로브 팁을 셀에 삽입하기 전에 MS 데이터 수집을 시작합니다. 세포 포함 플레이트를 내려 단일 프로브 팁을 세포 밖으로 당겨 빼냅니다. 마지막으로, 용매를 약 3분 동안 흐르게 하여 단일 프로브를 완전히 플러시합니다.

마우스 신장 절편에 대한 주변 질량 분석 이미징을 수행했으며 조직 표면에 존재하는 많은 수의 분자를 검출할 수 있습니다. 조직 표면에 있는 여러 분자의 공간적 분포와 상대적 풍부도를 표시했습니다. 8.5 미크론의 공간 해상도는 질량 분석 데이터 내에 존재하는 특징의 급격한 전이 관찰을 통해 달성되었습니다.

날카로운 팁과 열린 채널이 있는 단일 프로브를 제작하는 것은 단일 세포 분석에 매우 중요합니다. 표적 세포를 찾고 세포 침투 과정을 모니터링하기 위해 현미경이 필요합니다. 질량 스펙트럼의 신호 변화는 또한 세포 침투를 확인하기 위한 추가 정보를 제공합니다.

살아있는 단일 세포에서 많은 수의 분자가 검출되었습니다. 항암제 연구에 사용되는 경우, 대조군 세포 실험을 통해 항암제 치료의 차이를 입증합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 프로브가 어떻게 제작되는지, 그리고 이 장치가 단일 세포의 질량 분석 및 생물학적 조직의 주변 질량 분석 이미징에 어떻게 사용되는지 잘 이해하게 될 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 단일 프로브 장치를 제작하고, 전체 시스템을 설정하고, 기기를 작동하는 데 자세한 지침이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 일단 마스터하면 많은 세포에 대해 단일 세포 분석을 지속적으로 수행할 수 있습니다. 또한 각 분석에는 3분도 채 걸리지 않습니다.

주변 MS 이미징 실험을 완료하는 데 샘플 크기, 공간 해상도 및 사용된 질량 분석기에 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 고품질 단일 프로브를 제작하는 것이 핵심 단계라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 실험을 성공적으로 수행하기 위해서는 기기의 튜닝 및 작동이 중요합니다.

여기에 제시된 것과 유사한 절차에 따라 다른 방법을 개발할 수 있습니다. 예를 들어, 시료 용매에 시약을 첨가하고 반응성 단일 세포 분석 및 주변 MSI를 수행하여 시료에서 분자 검출을 개선할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 주변 조건에서 단일 세포 분석과 질량 분석 이미징 연구 모두에서 연구원들을 위한 길을 열었습니다.

이 기술은 세포 생물학 연구, 약리학 연구 및 임상 테스트에 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 날카로운 석영 모세관과 UV 경화 에폭시로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 UV 안전 고글을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.