Name: 배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 혈관 평활근 세포에서 FRET 기반 공촛점 이미징을 이용한 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 측정 방법. 이 기술은 세포 내 칼슘 순환과 ER 스트레스 관계를 직접적으로 규명하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 [CVB &amp; ME에 MOP-1112666] 건강 연구의 캐나다 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.

윤리 문 : 모든 실험과 절차는 브리티시 컬럼비아 주, 밴쿠버, 캐나다의 대학의 연구소 바이오 안전성 가이드 라인과 일치 실시 하였다. FRET 기반 공 초점 현미경을위한 35mm 유리 바닥 문화 요리 1. 준비 <ol><li> 다음 절차에 따라 36-48 시간 전에 실험에를 사용하여 플레이트를 준비합니다. </li><li> C 저장 ° -20에서 선택 젤라틴 단백질 혼합물 0.25 % 트립신 EDTA를 검색하고 사용할 때까지 이동 얼음 욕조에 보관하십시오. 주 : 단백질이 코팅 혼합물만을 사용 전에 고화 혼합을 방지하기 위해, 짧은 시간 동안 RT에 노출되어야한다. 필요할 때까지 트립신 용액은 냉장 보관한다; 대안으로, 트립신 단계 1.5 완료 후 -20 ° C 저장 영역에서 검색 할 수 있습니다. </li><li> DMEM (더 추가 된 혈청, 냉장) : 단백질 혼합물의 1시 25분 희석을 준비합니다. 각 플레이트가 준비되기 단백질 혼합물 / DMEM의 적절한 볼륨을 이동. 35mm 유리 바닥 판의 경우, 완전 판의 하단에 내부 유리 원을 충당하기 위해 약 200 μl를 추가합니다. </li><li> 안전 캐비닛 내부 및 실온에서 적어도 30 분 동안 앉아 접시를 남겨주세요. 이 기간 동안 물을 욕조에 37 ° C 10 % NCS와 따뜻한 DMEM. </li><li> 바로 전에 다음 단계에 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 트립신. </li><li> 유리 피펫 및 흡입을 사용하여 배양 플라스크 현재 DMEM를 제거합니다. 따뜻한 멸균 PBS와 플라스크의 워시 바닥은 남아있는 DMEM 찌꺼기를 제거합니다. </li><li> 플라스크의 바닥에서 미리 배양 평활근을 제거 : 참고 : 플라스크는 세포가 접시 준비하기 전에 원하는 컨 플루 (약 80 %)에 도달 할 수 있도록이 단계에 일 설립되었다. 세포들은 원래 10 % NCS로 DMEM 20 ml의 플라스크에 현탁시키고 DMEM 공급 재생 된 세포를 인큐베이터로 복귀 된 후 24 시간에 대해 5 % CO 2 공급하여 37 ℃에서 배양 하였다. DMEM는 이브를 갱신했다세포가 포화 상태에 도달 할 때까지 공예 48 시간이 초기 단계에 따라. <ol><li> 워시는 트립신 1 ml의 신속 플라스크 다음 흡입을 사용하여 1 ml의 트립신을 제거합니다. </li><li> 트립신의 또 다른 1 ㎖에 추가하고 효소가 플라스크의 전체 바닥과 접촉 할 수 있도록 플라스크를 휘두르는, 더 긴 기간 (약 30 ~ 60 초)로 떠난다. </li><li> 플라스크에서 분리 만족 될 때까지 현미경으로 분리 얼마나 많은 세포를 관찰한다. 플라스크에서 분리 된 세포의 비율이 만족 될 때까지 대체 물​​기 제거 트립신 용액 및 검사 세포 분리. 주 : 플라스크를 37 ℃에서이 프로세스의 속도를 약 30-60 초 동안 인큐베이터로 복귀 할 수있다. </li><li> 세포를 트립신을 사용 빠질되고 나면 (트립신은 플라스크의 총 부피의 1/8 번째를 형성하도록 충분한 볼륨), 트립신 반응을 정지 플라스크에 10 % NCS 신선한 DMEM를 추가합니다. 주 : 250 ml의 배양 플라스크를 사용하는 경우, 예를 들어,이 것7 ㎖의 DMEM 세포 용액 8 ml의 결과 트립신 1 ㎖의에 추가. </li></ol></li><li> 깨끗한 (표시) 50 ML 원뿔 튜브에 플라스크에서 셀 솔루션을 결과로 전송. </li><li> 각 플레이트에 1 ml의 신선한 DMEM 플러스 10 % NCS 추가는 (충분한 매체가 24 시간을 지속하기 위해) 준비되고있다. </li><li> 부드럽게 튜브를 형성 할 수있는 모든 펠렛을 헤어 셀 솔루션을 여러 번 포함 반전. </li><li> 피펫은 각 플레이트에 부드럽게 혼합 셀 솔루션의 볼륨을 원하는. 참고 :이 프로토콜에 대한 도금 권장 SMCs 번호는 35mm 배양 접시 당 0.5-0.8 × 106이다. 이 번호는 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 각각의 실험실에서 테스트하고 수정해야합니다. </li><li> 유리 바닥에서 세포의 평등 한 분배를 보장하기 위해 철저하게 / 시계 방향 반 시계 방향으로 각각의 판을 소용돌이 친다. </li></ol> D1SR 칼슘 2 + 표시를 실시 아데노 바이러스 벡터 2. 과도 형질 <ol><li> 나 또한 다음dium 각각의 접시에 세포 솔루션은 세포가 접시의 바닥에 유리에 제대로 부착 할 수 있도록 적어도 1 시간 동안 CO 2 공급 5 %와 37 ° C에서 배양 접시를 둡니다. 세포가 명확하게 부착 될 때까지 15 분 간격으로 현미경으로 번호판을 확인합니다. </li><li> -80 ° C 저장 영역에서 아데노 바이러스 D1SR 나누어지는을 검색하고 생물 안전 캐비닛에 전송하는 모바일 얼음 욕조에 보관하십시오. </li><li> 피펫 원하는 용량 각 플레이트에 냉장 D1SR의 (100의 감염의 다중성). 주 : 플레이트 당 필요한 아데노 바이러스 용액의 부피에 대한 계산은 플라크 형성 단위 (PFU)로 표시되는 원본 원액에 바이러스 역가에 의존한다. 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 배양 접시에 하나의 평활근 세포 (SMC)를 감염하는 데 필요한 번호 또는 바이러스 입자로 해석됩니다 (100)의 감염 (MOI)의 다양성을 권장합니다. </li><li> 5 % CO 2 공급 O / N 37 ° C에 감염된 세포를 품어. </li><li> 다음 날, 신선한 DMEM 1 ㎖ 플러스 10 % NCS와 세포를 보충. </li><li> CO 2 O / N 5 %에서 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 접시를 품어. </li></ol> FRET 기반 공 촛점 이미징을 사용하여 3. 측정 SR 내강의 Ca 2+ <ol><li> O / N 배양 후, 플레이트에서 배지를 제거합니다. </li><li> 포함 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼와 배양 접시를 씻으 (mmol·L에 - 1) 염화나트륨 (140), 포도당 (10), KCl을 5, HEPES (5), 염화칼슘 (2) 1.5의 MgCl 2 일 (PH 7.4) 세 번. </li><li> 직전 기록의 시작에 1 ml의 신선한 따뜻한 HEPES-PSS 버퍼를 추가합니다. </li><li> 공 초점 현미경의 관련 소프트웨어에 FRET SE (감응 방출) 응용 프로그램 (또는 유사한 기능)를 사용하여 초기 이미징을 수행합니다. <ol><li> 응용 프로그램이 열리면, 원하는 실험 조건을 달성하기 위해 설정을 조정하려면 &quot;설정&quot;탭으로 클릭합니다. </li> &lt;세포 (기증자과 채널 FRET) 440 nm에서 순차적으로 흥분과 (수용체 채널에 대한) 513 nm의 있도록 리&gt; 수동으로 채널 설정을 변경합니다. (기증자에 대한) 488 nm 내지 53​​5 nm의 (FRET 및 수용체에 대한)에서 방출 파장을 수집합니다. </li><li> 와 노출 사이에 10 초 간격 (세​​ 개의 연속 CFP 기증자, FRET 및 YFP 수용체 채널에 대한 녹화 시간) 세포의 150 밀리 여기 노출 시간, 15 %의 전송 빛의 강도를 설정합니다. </li></ol></li><li> 현미경 무대에서 판을 안정화. </li><li> 이미지 해상도를 확인하십시오 &quot;라이브&quot;버튼을 사용합니다. 원하는 해상도에 도달 할 때까지 추가 설정을 조정할. </li><li> 아직도 &quot;설정&quot;탭 아래의 &quot;캡처 이미지&quot;버튼을 사용하여 샘​​플의 이미지를 가져 가라. </li><li> 은 &quot;평가&quot;탭에 이동, 실험에 대한 FRET 효율이 수행되는 계산하는 적절한 방법을 선택합니다. 방법 3의 비례 계산 [E A (I) = B / A를 사용하여, 등 D1SR의 지표로 cameleons을 포함하는 실험을하는 것이 좋습니다. </li><li> 강도 값은 실험 중에 그래프 형태로 기록되는 것을 관찰 할 수 있도록 &quot;그래프&quot;탭으로 전환. </li><li> 실험이 진행되는 그래프에 관심이 지역의 해당 평균 강도를 관찰하는 이미지 뷰어에서 투자 수익 (ROI)을 그립니다. 참고 : 연구자가 여러 로아을 그리고 강도 기록하고 그래프에 동시에 표시 할 대응하도록 선택할 수 있습니다. 대안 적으로, 연구자들은 초기 기록을위한 단일 ROI 윤곽 및 소프트웨어의 데이터 분석 지향 버전 실험 파일을 열어 나중에 다수의 ROI 윤곽을 진행할 수있다. 참고 : FRET 기반 실험을 설정하는 데 필요한 단계에 대한 자세한 세부 사항은 FRET 응용 프로그램 마법사 매뉴얼에서 찾을 수 있습니다. 현미경은 FRET 마법사 장착되지 않은 경우, 다음의 프로토콜에 대한 파라미터를 설정하는데 사용될 수있다수동으로 기록. </li><li> 녹화 시작 전에 관심 에이전트를 도입하여 신호의 정상 기저 기록을 위해 적어도 3 분 동안 데이터 수집을 허용한다. </li><li> -moving 에이전트를 칼슘을 소개합니다 (예 : 2 μM 쌥시 가르 긴 100 nm의 엔도 텔린-1) 수동으로이자 존재의 영역에 가깝게 자리에서 판에 직접 소정의 복용량을 피펫 팅에 의해, SR 칼슘 2 + 파괴하기위한 도구로 가능한 기록했다. 원하는 시간 후 처리에 대한 기록을 계속합니다. </li><li> 캡처 비율 계량은 FRET SE 응용 프로그램을 사용하여 공 초점 거꾸로 현미경의 63X 기름 침지 목적으로 일련의 이미지 (512 X 512 픽셀) FRET. </li><li> 포맷 및 통계 기반의 소프트웨어를 사용하여 분석이어서 관심 (ROI)의 각 지역에서 5 ~ 10 SMCs의 클러스터에서 영상에서 결과 데이터를 수집합니다. <ol><li> 나중에 사용하기 위해 데이터를 저장하기 위해, 기록 추적을 통해 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 SAV하기 위해 &quot;내보내기&quot;옵션을 선택합니다연구자가 선택한 드라이브에 기록 된 평균 신호 강도와 전자 스프레드 시트. </li><li> 시각 0 초에서 관찰 원료 강도 값에 의해 각 데이터를 분할하여 각각의 실험 데이터를 정규화. </li><li> 수동으로 복사하고 원래 스프레드 시트 / 초에서 관련 데이터 행을 붙여 넣기하여 통계 프로그램 프로젝트 파일에 스프레드 시트에서 가져 오기 정규화 된 데이터. </li><li> 자동으로 프로그램에 붙여 넣을 데이터 세트에 해당하는 그래프를 생성합니다. 참고 :이 프로그램의 기본 설정은 가져온 데이터에서 선 그래프를 생성합니다. 표시되는 그래프의 종류는 기본 도구 모음에서 발견 제목 &quot;변경&quot;에서 &quot;그래프의 다른 유형을 선택&quot;버튼을 클릭하여 수정할 수 있습니다. </li><li> 단일 데이터 시트로 동일한 실험 큰 그룹 내에서 여러 개의 독립적 인 실험을 대표하는 풀 데이터 수행 특정 테스트에 대한 평균 추적을 생성한다. </li></ol></li></oL&gt; 세포질 칼슘의 4 조제 2 + 표시 <ol><li> 검은 microcentrifuge 관에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 1 ml의 0.0125 g 플루로 닉 산 (PA)에 녹이고 (PA 용해 있도록 모바일 수욕 튜브를 따뜻하게 할 수있다). </li><li> -20 ° C 저장 영역에서 세포질 칼슘 지시 염료 (FLUO-4 AM)의 튜브 (50 μg의)를 검색합니다. </li><li> 빛과 접촉 최대한 보호하기 위해 호일 염료의 튜브를 감싸. </li><li> 피펫 염료를 함유하는 튜브에 DMSO + PA 용액 45 μL. 실온에서 박 및 저장소에 DMSO + PA 솔루션을 감싸. </li><li> 철저하게 솔루션 위아래로 여러 번 피펫 팅하여 튜브의 내용을 섞는다. 대안 적으로, 10 분 동안 염색 튜브를 초음파 처리. 참고 : 철저하게 충분한 될 것 DMSO + PA 솔루션을 통해 염료를 배포의 어느 단계; 단순히 연구자의 취향의 문제이다. 조사자 용액을 초음파 처리로 선택한 경우, 그것다른 사람들이 소음에 의해 영향을받지 않습니다 고립 된 지역 / 방에서 수행해야합니다. 조사는 귀를 보호하기 위해 무거운 머플러를 사용해야합니다. <ol><li> 용액을 초음파 처리하는 경우, 2/3 전체 (와 DH 2 O) 초음파기 화장실 내부의 거품 튜브 홀더와 장소의 내부에 염료를 포함하는 포일 포장 튜브를 삽입합니다. </li><li> 격리 지역 / 공간 및 전력 시스템의 장소 소니 케이 온천 (보​​호 모자를 확인하기 전에 초음파 처리를 시작으로 장소에). 공간을두고 튜브를 (가능한 한 오랫동안 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸서 보관)을 차단하고 검색하기 전에 10 분 동안 실행중인 시스템을 그대로 둡니다. </li></ol></li><li> 어두운 마이크로 원심 튜브에 이제 완전히 혼합 용액 나누어지는 (튜브 당 5 μl를 10 튜브 총 만들 수 있어야합니다). </li><li> 포일의 각 나누어지는 튜브를 감싸. 사용할 때까지 -20 ° C 조건에서 건조에 레이블 튜브 및 저장. </li></ol> 5. 세포질 칼슘의 측정 2 + <ol><li> 쥐 대동맥 SMCs의 문화 판을 준비하는 1.1-1.12의 단계를 따릅니다. </li><li> 48 시간 포스트 문화의 접시에서 배양 배지를 제거합니다. </li><li> -20 ° C 저장 영역에서 세포질 칼슘 2 + 표시 등 (5 μL)의 이전 준비 나누어지는을 제거하고 사용할 때까지 이동 얼음 조에서 유지한다. </li><li> 포함 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼와 배양 접시를 씻으 (mmol·L에 - 1) 염화나트륨 (140), 포도당 (10), KCl을 5, HEPES (5), 염화칼슘 (2) 1.5의 MgCl 2 일 (PH 7.4) 세 번. </li><li> 따뜻한 HEPES-PSS 1 ml의 지표를 혼합 배양 접시에로드합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 표시기 (24 °에 C)와 SMCs을 품어. </li><li> 문화 판에서 표시를 제거하고 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼로 3 회 세척한다. </li><li> 직전 기록의 시작에 1 ml의 신선한 따뜻한 HEPES-PSS 버퍼를 추가합니다. </li><li> 63X 오와 직렬 이미지 (512 X 512 픽셀) 캡처공 촛점 거꾸로 현미경의 IL-침지 목표. <ol><li> 수동 세포를 488 nm에서 흥분하도록 설정을 변경하고, 발광 파장은 700 Hz의 스캔 속도로 555 nm에서 수집된다. </li><li> 세포를 150 밀리 여진 노출 시간 (세포 촬영 중에 지정된 시간 간격으로 빛에 노출되는 시간)과 노출 사이 5 초 간격으로, 15 %의 투과에서의 광 강도를 설정한다. </li></ol></li><li> 현미경 무대에서 판을 안정화하고 녹음을 시작. </li><li> 적어도 3 분 녹음하기 전에 관심의 제를 도입하여 신호의 꾸준한 기초 기록을 확인합니다. </li><li> (단계 3.16에 설명 된대로) 2 + SR 칼슘을 고갈 및 시간 후 처리의 원하는 금액에 대한 기록을 계속위한 도구로 칼슘 -moving 에이전트 (예를 들면, 2㎛ 쌥시 가르 긴) 소개합니다. </li><li> 녹음 신호 강도 형광 SI 평균을 현미경 특정 소프트웨어를 사용하여관심 (ROI)의 각 지역에서 5 ~ 10 SMCs의 클러스터에서 gnals (F / F 0). 수집 형식 및 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 영상에서 얻어진 데이터를 분석한다. 이 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집의 설명과 분석을위한 단계를 3.18.1-3.18.5 참조하십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 SR의 루멘 내 칼슘 농도를 연구하기 D1SR 아데노 바이러스와 혈관 평활근 세포의 형질을 설명합니다. 이 방법은 직접이 소기관 내 칼슘의 측정뿐만 아니라 다른 칼슘 이동 에이전트 애플리케이션의 결과로서 SR 만점으로의 이동 / 허용한다. 이 방법은 SR과 세포질 칼슘 수준에 변화가 전체 세포의 건강에 영향을 미칠 어떻게 이러한 변화는 상호 관련있는 방법의 포괄적 인 이해를 위해 노력 연구자를위한 많은 장점을 가지고있다. 세포 내 칼슘 운동의 전통 관찰은 세포질 칼슘 수준 변화의 추적을 포함한다. D1SR하거나 유사한 구조를 이용하여 유래의 중요한 장점은 따라서, 오히려 SR에 대한 아고 니스트의 효과에 의해 모호한 결론을 도출 할 필요없이, 예를 들면 SR 같은 특정 소기관을 포함하는이 이온의 움직임을 모니터 할 수있다간접적 조작에 의해 유도 된 세포 내 칼슘 수준의 변화를 관찰. 같은 맥락 함...

칼슘은 신체의 모든 단일 세포 내에서 풍부하게 발견되는 매우 중요한 이온입니다. 그것은 성장, 증식, 이동 및 세포 사멸 1-4 등 다양한 세포 기능에 중요한 역할을 가지고있다. 잘 칼슘이 모두 직간접적인 행동을 통해 이러한 프로세스에 영향을 미칠 수 있음을 설립, 따라서,이 이온의 정상적인 세포 내 농도 변화는 쉽게 영향을받는 세포에 대한 부정적인 결과가 발생할 수 있습니다. 스케줄링은 셀 (5) 내에서 가장 큰 세포 내 칼슘 저장소로 간주됩니다. 스케줄링 및 세포질 모두에서 칼슘의 정상 상태 수준은 일반적으로이 세포 기관의 칼슘 수송성 채널 중 일정한 유량을 통해 유지된다. 인한 부상 또는 질병의 형태로 세포에 가해지는 스트레스 조건은 일반적으로 그가 온 오래 지속되는 효과를 가지고 갈 SR 칼슘의 중요한 변화 2+와 관련된셀의 alth. 케이스의 가장 심각한에서 스트레스 셀의 무능력 복구하고 정상 상태 SR의 칼슘을 유지 2+ 수준도 사멸 6-8으로 사망 절정에 달하다 수 있습니다. 세포의 칼슘 역학에 대한 현재의 연구는 몇몇 연구 시험 칼슘 저장소의 콘텐츠를 직접 9-11 세포 기관 있다는 사실에 의해 제한된다. 가장 일반적인 방법은 대신 SR 칼슘 함량 12-14에서 변화의 간접적 인 측정과 같은 세포 내 칼슘 수준의 측정을 포함한다. 이 실험에서, 칼슘은 일반적으로 세포 소기관의 고갈을 초래되는 약물 (예 쌥시 가르 긴)의 사용을 통해 SR로부터 방출되도록 유도된다. 결론은 다음 세포질 칼슘 농도의 변동에 따라 SR 칼슘의 변경과 관련하여 그려집니다. 로터리 엄마에 같은 결론을 도출하기 위해 연구자 남은 능력에도 불구하고nner, SR 칼슘 측정이 방법은 수집 된 데이터의 해석에 관한 많은 제한과 같은 정보를 수집합니다 할 수있는 간접적 인 방법은 분명히있다. 이 명확한 제한을 우회시키기 위해서는, SR 내강 네트워크 내에서 직접 발견 칼슘의 양을 측정 할 필요가있다. 직접 관내 SR 칼슘 수준을 기록 할 수있는의 최종 결과에 필수적은 세포 배양 용 공구 및 사용되는 칼슘 지표이다. 현재의 논문에 언급 된 데이터의 경우, 사용되는 혈관 평활근 세포는 냉동 세포주로부터 왔다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 세포는 5 % CO 2 공급 일정 37 ° C에서 배양 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) +를 설명 실험 구절 22-26을 통해 10 %의 신생아 혈청 (NCS)에서 배양 하였다. 현재의 방법을 이용하여, 예를 들어, 세포는 매우 성공적 세포 시뮬레이션 단백질 혼합물에 성장 된조직 (15)의 많은 다른 유형의 환경을 제공합니다. SR 칼슘 정맥 따른 성공에 중요 2+ 연구는 사용 된 단백질 혼합물의 형태이고; 이 경우, 낮은 성장 인자 다양한 일반 칼슘 신호 전달에 영향을주는 동작과 끊임없이 시험 셀 내에서 발생하는이 도구의 부품을 피할 필요가 있었다. 시험 셀의 성공적인 성장 후, 칼슘 인디케이터 효과적으로 이러한 배양 세포에 도입한다. 이 SR-상주 칼슘 2+ D1SR 지표를 전달하는 아데노 바이러스 벡터를 이용하여 가능하게되었다. 높은 형질 전환 효율을 달성하기 위해, 셀은 종래 촬상 적어도 36-48 시간 동안 바이러스 벡터와 함께 배양해야한다. 이 제제는 칼슘에게 높은 정확성과 재현성을 가진 SR 루멘 내에서 2 + 과도 전압을 측정 할 수있는 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다. 이 프로토콜에서 사용 D1SR 표시가 D1ER 칼슘의 수정 된 변종이다 2+ 난원래 캘리포니아 대학에서 박사 로저 첸의 실험실, 샌디에고, 미국 9,16에 의해 만들어진 ndicator. 원래 D1ER는 이전 칼슘 2 + 지표 9,16에 비해 훨씬 넓은 범위 (0.5-160 μM)을 통해 칼슘 감도를 표시 cameleons라는 유전자 인코딩 칼슘 지표의 2 세대에 속한다. 새로운 변형 D1SR 박사 웨인 첸 (캐나다 앨버타 대학)에서 일종의 선물은, 그러나, 돌연변이 calsequestrin 시퀀스 (대신 원래 D1ER에서와 같이 칼레 티 큘린 순서)를 수행한다. 돌연변이 calsequestrin는 11 루멘 SR 내에서 칼슘 결합에 내인성 calsequestrin과 경쟁의 문제를 제거 칼슘 결합 감소했다. D1SR 표시등​​이 잘린 강화 시안 형광 단백질 (CFP)과 노란색 형광 단백질 (YFP) 수정 칼 모듈 린 (CAM) 및 M13을 포함하는 링커 단백질에 의한 바인드 (t을 운반CAM) 시퀀스에 결합 미오신 경쇄 키나제의 그는 26 잔류 물 펩타이드. 캠-M13 순서는 내생 칼 모듈 린 결합에서 M13을 방지하기 위해 수정되었습니다. 또한, SR 유지를 보장하기 calsequestrin 시퀀스 CFP (11)의 5&#39;- 말단에 첨가되었다. 칼슘 이온에 결합 할 때, 캠 M13 도메인은 FRET 신호 강도의 증가로 기록되는 측면 CFP와 YFP 사이의 에너지 전달이 증가 될 구조적 변화를 통해 진행한다. 2+ SR 내강 칼슘의 농도가 떨어질 때 한편, 캠 M13 도메인은 측면 CFP 및 YFP 및 FRET 신호 강도의 현저한 저하의 에너지 전달의 감소를 초래 역방향 구조적 변화를 통해 진행 .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 변형 된 독수리의 매체 (고 포도당, 피루 베이트)</td><td>생명 기술</td><td>11995-065</td><td>37 &deg에서 따뜻한; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>-20도로 유지 & C 사용 직전까지</td></tr><tr><td>신생아 송아지 세럼</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td>-20 유지 &deg; C 사용 직전까지</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 플레이트</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G - 1.5 - 14 - C</td><td></td></tr><tr><td>250ml 0.2 &mu; M 통풍 블루 플러그 씰 캡 플라스크</td><td>BD 팔콘</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA 솔루션</td><td>생명 기술</td><td>25200056</td><td>-20 &deg; C 사용 직전까지</td></tr><tr><td>50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>선물</td></tr><tr><td>디메틸 설폭시드 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>-20 &deg; C 사용 직전까지</td></tr><tr><td>1.5ml 블랙 마이크로원심분리기 튜브</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 fret 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

혈관 평활근 세포(VSMC)의 근 소포체(SR)에서 정상 상태 칼슘(Ca2+) 수준을 유지하는 것은 전반적인 건강에 매우 중요합니다. 세포 내 Ca2+ 함량의 상당 부분은 VSMC의 SR 저장소 내에서 발견됩니다. 원형질막-SR 접합을 통해 주변 세포외 공간과 밀접한 연관을 가진 유일한 세포 내 소기관인 SR은 Ca2+ 과도 상태 또는 세포가 경험하는 스트레스의 불규칙성에 대한 첫 번째 반응 라인을 구성하는 것으로 간주될 수 있습니다. 많은 기능 중 가장 중요한 기능 중 하나는 세포 전체에 걸쳐 Ca2+ 조절 신호를 전송하여 세포 전체의 추가 반응을 유도하는 역할입니다. 이와 관련하여 세포질 Ca2+ 지표의 보다 일반적인 사용은 아직 완전히 특성화되지 않은 내강 내 SR Ca2+ 저장에 대한 매우 역동적인 변화에 대한 연구에 전반적으로 충분하지 않습니다. 여기에서는 luminal SR Ca2+의 직접적이고 명확한 측정을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 도구는 세포의 정상적인 기능과 건강에 중대한 영향을 미치는 SR Ca2+의 미묘한 변화를 조사하는 데 유용합니다. 특히 SR Ca2+ 함량의 변동은 세포가 경험하는 질병 또는 스트레스 상태에 대한 세포 반응과 관련된 상당한 양의 정보를 제공할 수 있습니다. 이 방법에서는 SR 표적 Ca2+ 지시약의 수정된 버전인 D1SR을 사용하여 배양된 쥐 대동맥 평활근 세포(SMC)에 제제를 도입한 것에 대한 반응으로 Ca2+ 변동을 감지합니다. D1SR 지시자를 사용한 배양 후 컨포칼 형광 현미경 검사 및 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 이미징을 사용하여 제어 조건 하에서 내강 내 SR Ca2+ 수준의 변화를 직접 관찰하고 세포 내 Ca2+ 이동을 유도하는 기능을 하는 작용제를 추가합니다.

이 섹션은 간접적 세포질 칼슘의 변동을 관찰함으로써 칼슘 저장소 농도 소기관하는 변화를 측정 통상 사용되고있는 방법에 비해, SR 내강 칼슘 농도 데이터를 캡처하는 한 방법을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예를 제공 2+ . 도 1a는 YFP 채널 (514 nm의 여기 / 535 nm의 방출)에 D1SR 아데노 바이러스로 형질 SMC 문화의 관심 (ROI)의 영역의 스냅 샷을 보여줍니다. 모든 SMCs가 D1SR 발현 양성되지만, 도시 된 바와 같이,이 D1SR 표시기 발현 수준이 동일한 ROI 내의 다른 셀 사이에서 변화하는 것이 분명하다.도 1b는 D1SR로 형질 SMC의 형광 화상의 2-D 투사를 도시 칼슘 분포의 명확...

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

이 이미징 기술의 전반적인 목표는 특히 혈관 평활근 세포에서 칼슘 동원제에 반응하여 나타나는 루멘 내 SR 칼슘 농도의 변동을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 세포 내 칼슘 사이클링을 보다 직접적인 방식으로 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 근소포체 내의 칼슘 수송과 ER 스트레스 사이의 관계를 파악하는 것은 매우 중요합니다.이 기술의 장점은 세포질 변화의 간접적인 측정값으로부터 추정하는 대신, 근소포체 루멘 내부의 칼슘을 직접 측정할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Gabriela Ziomek이 맡아 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, DMEM에서 단백질 혼합물을 1:25로 희석하여 준비하십시오.다음으로, 각 35 mm 유리 바닥 플레이트에 단백질 혼합물 DMEM 200 µL를 분주하여 바닥의 내부 유리 원형 영역을 완전히 덮습니다. 플레이트를 안전 캐비닛 내부의 실온에서 최소 30분 동안 둡니다. 그동안 10% NCS가 포함된 DMEM을 항온수조에서 37 °C로 가온합니다.그 후, 유리 피펫을 사용하여 배양 플라스크에서 DMEM을 제거합니다. 이어서, 따뜻한 멸균 PBS로 플라스크 바닥을 세척하여 남아 있는 DMEM 잔여물을 제거합니다. 배양된 평활근 세포를 플라스크 바닥에서 떼어내기 위해, 1 mL의 trypsin으로 플라스크를 빠르게 세척한 후 이를 제거합니다.그런 다음 trypsin 1 mL를 추가합니다. 플라스크를 꺼내기 전, 효소가 플라스크 바닥 전체에 접촉할 수 있도록 약 30~60초 동안 가볍게 흔들어 줍니다. trypsin으로 세포가 탈락되면, trypsin 반응을 중단시키기 위해 10% NCS가 포함된 신선한 DMEM을 플라스크에 첨가합니다.플라스크에서 결과 세포 용액을 라벨이 부착된 깨끗한 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. 그다음 준비 중인 각 플레이트에 10 % NCS가 포함된 신선한 DMEM 1 milliliter를 첨가합니다. 그 후, 세포 용액이 담긴 튜브를 조심스럽게 여러 번 뒤집어 형성되었을 수 있는 펠릿을 풀어줍니다.부드럽게 혼합된 세포 용액을 원하는 부피만큼 각 플레이트에 피펫으로 분주합니다. 이어서, 각 플레이트를 시계 방향 또는 반시계 방향으로 충분히 회전시켜 바닥의 유리에 세포가 균일하게 분포되도록 합니다. 효과적인 이미징을 위해 향후 48시간 동안 충분히 높은 합일도(confluency)에 도달할 수 있도록 플레이트에 충분한 양의 세포를 추가하는 것이 필요합니다.각 플레이트에 배지와 세포 용액을 추가한 후, 세포가 유리 바닥에 적절히 부착될 수 있도록 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 세포가 명확하게 부착될 때까지 15분 간격으로 현미경을 통해 플레이트를 확인하십시오. 그런 다음 -80 °C 보관소에서 Adenovirus D1 SR 분주액을 꺼내 이동식 아이스 배스를 이용하여 생물안전작업대(BSC)로 운반합니다. 그 후.냉각된 D one SR의 원하는 용량을 각 플레이트에 피펫팅하고, 감염된 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 10 % NCS가 첨가된 신선한 DMEM 1 mL를 세포에 보충합니다. 이어서, 플레이트를 5 % CO2가 포함된 37 °C의 습윤 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다.하룻밤 동안 배양한 후, 플레이트에서 배양액을 제거합니다. 따뜻한 생리적 HEPES-PSS 완충액 1 mL로 배양 플레이트를 3회 세척합니다. 다음으로, 기록 직전에 따뜻한 신선한 HEPES-PSS 완충액 1 mL를 첨가합니다.공초점 현미경의 관련 소프트웨어를 실행하여 FRET SE 애플리케이션을 사용해 초기 이미징을 수행합니다. 애플리케이션이 열리면 setup 탭을 클릭하여 원하는 실험 설정을 조정하십시오. 채널 설정을 수동으로 변경하여 공여체 및 FRET의 경우 440 nanometers, 수용체의 경우 513 nanometers에서 세포가 순차적으로 들뜨도록 설정합니다.그런 다음 방출 파장을 공여체(donor)의 경우 488 nanometers로, FRET 및 수용체(acceptor)의 경우 535 nanometers로 설정하십시오. 이어서 광강도를 15% 투과율로 설정하고, 세포의 여기 노출 시간은 150 millisecond, 노출 간격은 10 second로 설정합니다. 다음으로 플레이트를 현미경 스테이지 위에 안정적으로 배치하십시오.라이브 버튼을 사용하여 이미지 해상도를 확인하십시오. 원하는 해상도를 얻기 위해 설정을 추가로 조정하십시오. 설정 탭에서 이미지 캡처 버튼을 사용하여 샘플의 이미지를 촬영하십시오.이제 평가(evaluation) 탭으로 이동하여, 수행 중인 실험의 FRET 효율을 계산하기에 적절한 방법을 선택하십시오. D1 SR 지표와 같은 카멜레온(Cameleons)을 사용하는 실험에는 ratiometric 계산법인 방법 3이 권장됩니다. 그 후, 그래프(graph) 탭으로 전환하여 기록되는 강도(intensity) 값들을 그래프로 확인하십시오.필요한 경우, 이미지 뷰어에서 ROI를 그려 해당 관심 영역의 평균 강도를 그래프에서 관찰하십시오. 기록을 시작하여 최소 3분 동안 데이터를 수집함으로써, 관심 약제를 투입하기 전에 안정적인 기저선 신호를 확보하십시오. 그런 다음, 기록 중인 관심 영역 근처의 플레이트에 직접 투입하여 SR 칼슘을 고갈시키는 도구로 칼슘 이동 약제를 투입하십시오.처리 후 원하는 시간 동안 기록을 계속하십시오. 그 후, FRET SE 애플리케이션을 사용하여 공초점 도립 현미경으로 ratiometric FRET 연속 이미지를 캡처하십시오. 이 단계에서 쥐 대동맥 평활근 세포 배양 플레이트를 준비하려면, 따뜻한 생리적 HEPES-PSS 완충액 1 mL로 배양 플레이트를 3회 세척하십시오.그 다음, 지시약을 1 mL의 따뜻한 HEPES-PSS와 혼합하여 배양 플레이트에 넣습니다. 평활근 세포를 지시약과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 배양 플레이트에서 지시약을 제거하고 1 mL의 따뜻한 생리학적 HEPES-PSS 완충액으로 3회 세척합니다.그 다음, 기록 직전에 1 mL의 신선하고 따뜻한 HEPES-PSS 완충액을 추가합니다. 공초점 도립 현미경을 사용하여 연속 이미지를 캡처합니다. 이어서 SR 칼슘을 고갈시키기 위한 도구로 칼슘 이동제를 투여하고, 처리 후 원하는 시간 동안 기록을 계속합니다.여기 CFP, FRET 및 YFP 밴드 패스 필터를 사용하여 D one SR 지시약이 형질전환된 평활근 세포의 대표적인 스냅샷이 제시되어 있습니다. 이 그림은 D one SR이 형질전환된 배양된 쥐 대동맥 평활근 세포의 실시간 의사색(pseudo-color) 스냅샷을 보여줍니다. 2 µM의 Thapsigargin 처리 시 신호 강도가 감소했으며, 이는 Thapsigargin 유도 칼슘 방출로 인해 SR 칼슘 함량이 유의하게 감소했음을 나타냅니다. 그리고 이 그래프는 2 µM Thapsigargin을 처리한 배양된 평활근 세포에서 정규화된 D one SR 비율의 대표적인 추적선을 보여주며, 이를 통해 SR 칼슘의 유의한 감소가 확인되었습니다.다음은 세포질 칼슘 지시약이 로딩되고 2 µM Thapsigargin으로 처리된 배양된 쥐 대동맥 평활근 세포의 대표적인 스냅샷입니다. 보시는 바와 같이, Thapsigargin은 SR로부터의 칼슘 방출로 인해 세포질 내 신호 강도의 유의미한 증가를 유발합니다. 그리고 이 그래프는 2 µM Thapsigargin으로 처리된 배양된 평활근 세포에서 정규화된 Fluo four AM 비율의 대표적인 트레이스를 보여줍니다. 묘사된 칼슘 신호의 증가는 SR에서 방출된 칼슘의 양에 비례하는 것으로 간주됩니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 시작부터 끝까지 약 48시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 칼슘 지표를 이용한 형질전환 전 세포의 건강 상태를 보장하기 위해 세포를 설명된 조건으로 유지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 D one SR 지표를 사용하여 소포체(SR) 내강의 칼슘 수준을 측정할 수 있도록 배양 세포를 준비하는 방법에 대해 명확히 이해하게 될 것입니다.

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

우리는 공촛점 현미경을 검색 레이저를 사용하여 살아있는 세포에 느리게 fluxes에서 신속하게 (마이크로초) 칼슘 이벤트를 분리하는 방법을 제시한다. 방법은 세포에 수백 픽셀의 기록 선 검사에 의한 칼슘 지표의 형광 강도 변화를 측정합니다. 히스토그램 분석은 우리가 다른 칼슘 fluxes의 시간 스케일을 분리 할 수​​ 있습니다.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

직접 칼슘 불꽃을 측정하는 방법이 여기에 설명, 칼슘 2 +의 기본 단위는 그대로 골격 근육 섬유의 근질 세망에서 놓습니다. 이 방법은 고립 된 근육 섬유의 ryanodine 수용체에서 칼슘 2 + 릴리스의 삼투 스트레스 매개 트리거를 사용합니다. 역학과 내 Ca 2 + 신호 전달의 항상성 용량은 건강과 질환에서 근육 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아2 + 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER +의 적용 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

이 프로토콜은 절단 된 신경을 통해 형광 칼슘 염료를 마우스 운동 신경 말단에 로딩하는 방법을 설명합니다. 또한, 컨포칼 현미경을 사용하여 말초 신경 종말에서 빠른 칼슘 과도 현상을 기록하는 독특한 방법이 제시됩니다.

Confocal 현미경을 사용한 높은 시간 분해능을 가진 마우스 신경근 접합부의 칼슘 과도 상태 등록

본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.

정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구

배우세요 혈관 평활근 세포에서 FRET 기반 공촛점 이미징을 이용한 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 측정 방법. 이 기술은 세포 내 칼슘 순환과 ER 스트레스 관계를 직접적으로 규명하는 데 활용됩니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

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