배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

이 이미징 기술의 전반적인 목표는 특히 혈관 평활근 세포에서 칼슘 동원제에 반응하여 나타나는 루멘 내 SR 칼슘 농도의 변동을 모니터링하는 것입니다. 이 방법은 세포 내 칼슘 사이클링을 보다 직접적인 방식으로 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 근소포체 내의 칼슘 수송과 ER 스트레스 사이의 관계를 파악하는 것은 매우 중요합니다.

이 기술의 장점은 세포질 변화의 간접적인 측정값으로부터 추정하는 대신, 근소포체 루멘 내부의 칼슘을 직접 측정할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Gabriela Ziomek이 맡아 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, DMEM에서 단백질 혼합물을 1:25로 희석하여 준비하십시오.

다음으로, 각 35 mm 유리 바닥 플레이트에 단백질 혼합물 DMEM 200 µL를 분주하여 바닥의 내부 유리 원형 영역을 완전히 덮습니다. 플레이트를 안전 캐비닛 내부의 실온에서 최소 30분 동안 둡니다. 그동안 10% NCS가 포함된 DMEM을 항온수조에서 37 °C로 가온합니다.

그 후, 유리 피펫을 사용하여 배양 플라스크에서 DMEM을 제거합니다. 이어서, 따뜻한 멸균 PBS로 플라스크 바닥을 세척하여 남아 있는 DMEM 잔여물을 제거합니다. 배양된 평활근 세포를 플라스크 바닥에서 떼어내기 위해, 1 mL의 trypsin으로 플라스크를 빠르게 세척한 후 이를 제거합니다.

그런 다음 trypsin 1 mL를 추가합니다. 플라스크를 꺼내기 전, 효소가 플라스크 바닥 전체에 접촉할 수 있도록 약 30~60초 동안 가볍게 흔들어 줍니다. trypsin으로 세포가 탈락되면, trypsin 반응을 중단시키기 위해 10% NCS가 포함된 신선한 DMEM을 플라스크에 첨가합니다.

플라스크에서 결과 세포 용액을 라벨이 부착된 깨끗한 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. 그다음 준비 중인 각 플레이트에 10 % NCS가 포함된 신선한 DMEM 1 milliliter를 첨가합니다. 그 후, 세포 용액이 담긴 튜브를 조심스럽게 여러 번 뒤집어 형성되었을 수 있는 펠릿을 풀어줍니다.

부드럽게 혼합된 세포 용액을 원하는 부피만큼 각 플레이트에 피펫으로 분주합니다. 이어서, 각 플레이트를 시계 방향 또는 반시계 방향으로 충분히 회전시켜 바닥의 유리에 세포가 균일하게 분포되도록 합니다. 효과적인 이미징을 위해 향후 48시간 동안 충분히 높은 합일도(confluency)에 도달할 수 있도록 플레이트에 충분한 양의 세포를 추가하는 것이 필요합니다.

각 플레이트에 배지와 세포 용액을 추가한 후, 세포가 유리 바닥에 적절히 부착될 수 있도록 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 세포가 명확하게 부착될 때까지 15분 간격으로 현미경을 통해 플레이트를 확인하십시오. 그런 다음 -80 °C 보관소에서 Adenovirus D1 SR 분주액을 꺼내 이동식 아이스 배스를 이용하여 생물안전작업대(BSC)로 운반합니다. 그 후.

냉각된 D one SR의 원하는 용량을 각 플레이트에 피펫팅하고, 감염된 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 10 % NCS가 첨가된 신선한 DMEM 1 mL를 세포에 보충합니다. 이어서, 플레이트를 5 % CO2가 포함된 37 °C의 습윤 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다.

하룻밤 동안 배양한 후, 플레이트에서 배양액을 제거합니다. 따뜻한 생리적 HEPES-PSS 완충액 1 mL로 배양 플레이트를 3회 세척합니다. 다음으로, 기록 직전에 따뜻한 신선한 HEPES-PSS 완충액 1 mL를 첨가합니다.

공초점 현미경의 관련 소프트웨어를 실행하여 FRET SE 애플리케이션을 사용해 초기 이미징을 수행합니다. 애플리케이션이 열리면 setup 탭을 클릭하여 원하는 실험 설정을 조정하십시오. 채널 설정을 수동으로 변경하여 공여체 및 FRET의 경우 440 nanometers, 수용체의 경우 513 nanometers에서 세포가 순차적으로 들뜨도록 설정합니다.

그런 다음 방출 파장을 공여체(donor)의 경우 488 nanometers로, FRET 및 수용체(acceptor)의 경우 535 nanometers로 설정하십시오. 이어서 광강도를 15% 투과율로 설정하고, 세포의 여기 노출 시간은 150 millisecond, 노출 간격은 10 second로 설정합니다. 다음으로 플레이트를 현미경 스테이지 위에 안정적으로 배치하십시오.

라이브 버튼을 사용하여 이미지 해상도를 확인하십시오. 원하는 해상도를 얻기 위해 설정을 추가로 조정하십시오. 설정 탭에서 이미지 캡처 버튼을 사용하여 샘플의 이미지를 촬영하십시오.

이제 평가(evaluation) 탭으로 이동하여, 수행 중인 실험의 FRET 효율을 계산하기에 적절한 방법을 선택하십시오. D1 SR 지표와 같은 카멜레온(Cameleons)을 사용하는 실험에는 ratiometric 계산법인 방법 3이 권장됩니다. 그 후, 그래프(graph) 탭으로 전환하여 기록되는 강도(intensity) 값들을 그래프로 확인하십시오.

필요한 경우, 이미지 뷰어에서 ROI를 그려 해당 관심 영역의 평균 강도를 그래프에서 관찰하십시오. 기록을 시작하여 최소 3분 동안 데이터를 수집함으로써, 관심 약제를 투입하기 전에 안정적인 기저선 신호를 확보하십시오. 그런 다음, 기록 중인 관심 영역 근처의 플레이트에 직접 투입하여 SR 칼슘을 고갈시키는 도구로 칼슘 이동 약제를 투입하십시오.

처리 후 원하는 시간 동안 기록을 계속하십시오. 그 후, FRET SE 애플리케이션을 사용하여 공초점 도립 현미경으로 ratiometric FRET 연속 이미지를 캡처하십시오. 이 단계에서 쥐 대동맥 평활근 세포 배양 플레이트를 준비하려면, 따뜻한 생리적 HEPES-PSS 완충액 1 mL로 배양 플레이트를 3회 세척하십시오.

그 다음, 지시약을 1 mL의 따뜻한 HEPES-PSS와 혼합하여 배양 플레이트에 넣습니다. 평활근 세포를 지시약과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 배양 플레이트에서 지시약을 제거하고 1 mL의 따뜻한 생리학적 HEPES-PSS 완충액으로 3회 세척합니다.

그 다음, 기록 직전에 1 mL의 신선하고 따뜻한 HEPES-PSS 완충액을 추가합니다. 공초점 도립 현미경을 사용하여 연속 이미지를 캡처합니다. 이어서 SR 칼슘을 고갈시키기 위한 도구로 칼슘 이동제를 투여하고, 처리 후 원하는 시간 동안 기록을 계속합니다.

여기 CFP, FRET 및 YFP 밴드 패스 필터를 사용하여 D one SR 지시약이 형질전환된 평활근 세포의 대표적인 스냅샷이 제시되어 있습니다. 이 그림은 D one SR이 형질전환된 배양된 쥐 대동맥 평활근 세포의 실시간 의사색(pseudo-color) 스냅샷을 보여줍니다. 2 µM의 Thapsigargin 처리 시 신호 강도가 감소했으며, 이는 Thapsigargin 유도 칼슘 방출로 인해 SR 칼슘 함량이 유의하게 감소했음을 나타냅니다. 그리고 이 그래프는 2 µM Thapsigargin을 처리한 배양된 평활근 세포에서 정규화된 D one SR 비율의 대표적인 추적선을 보여주며, 이를 통해 SR 칼슘의 유의한 감소가 확인되었습니다.

다음은 세포질 칼슘 지시약이 로딩되고 2 µM Thapsigargin으로 처리된 배양된 쥐 대동맥 평활근 세포의 대표적인 스냅샷입니다. 보시는 바와 같이, Thapsigargin은 SR로부터의 칼슘 방출로 인해 세포질 내 신호 강도의 유의미한 증가를 유발합니다. 그리고 이 그래프는 2 µM Thapsigargin으로 처리된 배양된 평활근 세포에서 정규화된 Fluo four AM 비율의 대표적인 트레이스를 보여줍니다. 묘사된 칼슘 신호의 증가는 SR에서 방출된 칼슘의 양에 비례하는 것으로 간주됩니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 시작부터 끝까지 약 48시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 칼슘 지표를 이용한 형질전환 전 세포의 건강 상태를 보장하기 위해 세포를 설명된 조건으로 유지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 D one SR 지표를 사용하여 소포체(SR) 내강의 칼슘 수준을 측정할 수 있도록 배양 세포를 준비하는 방법에 대해 명확히 이해하게 될 것입니다.