깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

이 절차의 전반적인 목표는 깨어 있는 동물에서 신경 활성 물질의 미량 이온 영동 주입을 사용하여 신경 세포 처리의 시냅스 입력의 영향을 조작하는 것입니다. 이 방법은 신경 전달 물질의 역할과 감각 자극 및 코딩에 대한 상호 작용과 같은 감각 시스템을 사용하여 주요 기능을 분리하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 마취의 영향을받지 않고 탭에 대한 국소 synatic input의 조작과 neuronal modulatory system의 연구를 허용한다는 것입니다.

이 방탕한 동물은 억제된 쥐에 사용되었지만, 박쥐, 쥐 또는 기니피그와 같은 다른 포유류에도 사용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 절단을 위해 맞춤형 정렬 도구에 텅스텐 와이어를 배치하십시오. 전선의 느슨한 끝을 접착 테이프로 조심스럽게 부착하고 원하는 길이로 자릅니다.

그런 다음 정렬 도구에서 텅스텐 와이어를 제거하기 위해 테이프를 부드럽게 당깁니다. 모든 전선이 테이프에 연결되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 테이프를 광택이 나는 황동 스핀들에 감고 와이어를 스핀들에 단단히 고정하여 전기 연결이 양호하도록 합니다.

그런 다음 스핀들을 워크스테이션의 5RPM 모터에 연결합니다. 스핀들 접근은 에칭 용액의 표면에 대해 45도 각도가 있습니다. 그런 다음 와이어의 1/3을 용액에 담그십시오.

다음으로, 탄소 막대 전극을 에칭 배스에 담그어 회로를 닫습니다. 스핀들이 회전하기 시작하도록 워크스테이션을 켠 다음 전극과 에칭 용액을 통과하는 전류를 250밀리암페어로 조정합니다. 전류가 200밀리암페어로 떨어지면 팁 에칭을 중지하여 와이어 팁을 매우 미세한 지점으로 에칭하십시오.

이제 붕규산 유리 모세관에 와이어를 넣고 하단은 모델링 점토로 막습니다. 가열 코일과 매달린 플런저를 사용하여 피펫을 잡습니다. 현미경 아래에 놓기 전에 유리로 덮인 와이어를 슬라이드에 고정하십시오.

팁을 설정하고 초점이 맞춰진 붕소 구슬을 터치합니다. 그런 다음 약간 녹을 때까지 비드를 가열합니다. 그 후 와이어 팁을 약 10-15미크론 삽입하고 가열 전위차계를 끕니다.

비드가 식으면 전극 끝에서 유리를 제거하여 텅스텐을 노출시킵니다. 약 15mm의 팁을 얻으려면 극성을 적절한 매개변수로 설정하십시오. 모세관을 당겨 끝이 외딴 두 개의 피펫을 얻습니다.

모델링 점토를 사용하여 슬라이드에 폴 피펫을 장착하고 가는 가위, 집게 또는 메스의 평평한 면을 사용하여 팁을 부러뜨립니다. 전극과 다중 배럴 사이의 각도를 약간 조정하여 더 나은 접착력과 더 얇은 앙상블을 얻으십시오. 현미경 아래에서 텅스텐 전극을 다중 배럴 팁 위에 조심스럽게 정렬합니다.

정렬되면 다중 배럴에 닿을 때까지 전극을 내립니다. 두 개의 상단 배럴 사이의 홈에 끼운 다음 다중 배럴 끝에서 15-20 마이크로 미터 떨어진 곳으로 돌출 될 때까지 전극 끝을 밉니다. 이제 텅스텐과 멀티 배럴 앙상블에 팁에서 약 5mm 떨어진 곳에 작은 광 경화 접착제 한 방울을 바르십시오.

접착제가 끝에 닿지 않도록 멀티 배럴 채널을 막지 않도록 하고 블루라이트 LED 램프를 사용하여 접착제를 치료하십시오 이제 마취된 동물을 난방 담요에 올려 온도를 섭씨 38도로 유지하고 두 개의 이어바와 바이트 바가 있는 입체 프레임에서 동물 머리를 안정화한 다음 눈을 보호하기 위해 안과 젤을 바르십시오. 다음으로 두피를 면도하고 포비돈 요오드를 바르면 피부가 소독됩니다. 메스를 사용하여 정중선을 따라 절개하여 두개골을 드러내고 후두골의 주위와 더 많은 상부 부분을 덮고 있는 perastium을 후퇴시킵니다.

다음으로, 두개골과 헤드 포스트의 바닥에 광경화성 접착제를 얇게 바르십시오.10초 동안 기다렸다가 헤드 포스트를 정중선을 따라 두정골의 상부 부위에 놓습니다. 효과적인 접착 강도를 위해 파란색 광원을 사용하여 접착제를 20초 동안 경화시킵니다.

그런 다음 작은 드릴 비트를 사용하여 헤드 포스트 바닥 주변과 뒤에 두 개의 구멍을 뚫습니다. 천공된 구멍에 시계 나사를 놓아 두개골과 머리 사이의 추가 접점 역할을 합니다.tage. 한 바퀴 반 돌려 꼭 껴안고 나사를 끼우고 집게로 테스트하여 느슨하지 않은지 확인합니다.

그런 다음 은색 접지선의 끝을 세 번째 구멍에 삽입하고 경막에 닿는지 확인합니다. 방수 시아노아크릴레이트 접착제를 한 방울 떨어뜨려 와이어를 두개골에 묶습니다. 그 후, 광중합 복합재를 적용하여 헤드 포스트의 바닥, 은선의 하부, 나사를 덮어 헤드 포스트와 두개골의 결합을 강화합니다.

녹음 중 액세스를 허용하고 파란색 광원을 사용하여 컴포지트를 경화하기 위해 람다 이상으로 확장되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 두개골에 삽입되는 목 뒤쪽의 근육을 수축시킵니다. 작은 트레핀을 사용하여 람다 봉합사 바로 아래와 정중선 측면에 둥근 창을 뚫어 하구를 노출시킵니다.

이 절차에서는 동물의 몸을 맞춤형 폼 쿠션 구속기에 넣습니다. 헤드 포스트를 입체성 프레임에 부착된 홀더에 고정합니다. 이것은 동물에게 액체 보상을 주기에 좋은 시기입니다.

다음으로, 동물의 몸을 면 담요로 덮고 플라스틱 반원통과 접착 테이프를 사용하여 느슨하게 고정합니다. 끝이 유연한 주사기를 사용하여 선택한 약물로 배럴을 채웁니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 다중 배럴 전극을 홀더에 놓습니다.

다음으로, 각 배럴 내부에 코딩되지 않은 은색 와이어를 배치하여 한쪽 끝이 용액과 접촉하고 다른 쪽 끝이 접근할 수 있도록 합니다. 그런 다음 해당 끝을 microiontophoresis 장치에 연결합니다. 그런 다음 양극 단자를 텅스텐 전극 끝에 연결하고 접지 단자를 듀라와 접촉하는 은선에 연결합니다.

그런 다음 팁이 뇌 표면에 닿을 때까지 다중 배럴 전극을 움직입니다. 뇌 조직의 건조를 방지하기 위해 따뜻한 멸균 식염수를 바르십시오. 이 시점에서 유지 전류를 적용하여 배럴 팁에서 약물 누출을 방지하면서 단일 장치 활성을 찾습니다.

신경 활동 및 가바진의 이온 영동 적용을 기록합니다. 여기에 표시된 것은 가바진의 마이크로 이온 영동 주입 전과 주입 중에 하구에 기록된 4개의 뉴런의 주파수 응답 영역입니다. 검은색 십자가는 드물고 반복적인 소리로 표시되도록 선택된 주파수를 나타냅니다.

여기에서는 가바진 주입 전과 주입 중에 반응 영역을 구성하기 위해 제시된 모든 주파수와 강도에 대한 신경 반응의 누적된 peristimulus 시간 히스토그램입니다. 검은색 막대는 소리 지속 시간을 나타냅니다. 다음은 가바진을 적용하기 전과 적용하는 동안 빨간색에서 드물게 표시되고 파란색으로 반복적 자극으로 표시되는 한 쌍의 주파수에 대한 스파이크 응답의 도트 래스터입니다.

음영 처리된 배경은 자극의 지속 시간을 나타냅니다. 이러한 점 래스터는 파라주파수의 상대 확률이 전환되었을 때의 응답을 보여줍니다. 이 그래프는 가바진 적용 전과 적용 중에 드물고 반복적인 소리로 표시되는 7쌍의 주파수에 대한 단일 뉴런 반응을 보여줍니다.

그리고 이 그래프는 가바진을 적용하기 전과 적용 중에 측정된 희귀하고 반복적인 소리에 대한 신경 반응의 SSA 지수를 보여줍니다. 일단 숙달되면, 설명된 절차를 통해 관심 있는 뉴런의 신경 구조와 유형에 따라 특정 매개변수를 조정할 수 있습니다. 헤드레스트 동물 기록을 시도하는 동안 기록 시간은 동물의 습관화 수준에 따라 결정되고 제한된다는 점을 기억하는 것이 중요하지만, 중요한 장점은 동일한 동물에 대해 며칠 동안 여러 개의 기록 절개를 수행할 수 있어 사용되는 동물의 수를 최소화할 수 있다는 것입니다.

피기백 전극을 사용하여 미세이온 영동을 수행함으로써 신경 트랜지스터 주입과 같은 다른 절차를 결합하여 기록 부위 내 뉴런의 입력 소스 및 투영 대상과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 깨어 있는 동물과 함께 일할 때 중요한 문제는 그들의 안녕이므로 프로토콜에서 승인된 소환 시간을 초과하지 말고 불편함의 징후가 있는지 확인하기 위해 지속적으로 모니터링하십시오. 그렇다면 즉시 녹음을 중지해야 합니다.