Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

본 실험의 전반적인 목표는 미주신경의 기도 신경 지배 노도 뉴런(nodose neurons)을 표지하고 분리하는 것입니다. 이 방법은 기도 신경 지배 뉴런이 어떤 식별 특성을 가지고 있는지와 같은 말초 신경생물학 분야의 주요 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 특정 신경세포 집단을 표적화하고 분리하기 위한 강력하고 고효율의 방법을 제공한다는 것입니다. 감각 신경절을 수확한 후, 신경절을 건드리지 않고 각 튜브에서 500 µL의 신경절 해리 용액을 흡입하여 제거하십시오. 다음으로, 각 시료에 1 mL의 PBS를 추가하고 신경절이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다리십시오.

그다음, PBS를 제거하고 소화 효소가 첨가된 신경절 해리 용액 1 mL를 뉴런에 넣은 후, 양성 대조군 튜브에 Fast Blue 20 µL를 추가합니다. 소화 효소의 사용 기간에 따른 적절한 시간 동안 튜브를 37 °C에서 배양합니다. 이때 15분마다 튜브를 짧게 흔들거나 튕겨주어 신경절이 소화 용액에 충분히 잠기도록 합니다.

신경 세포가 소화되는 동안, 샘플당 하나의 1.5 milliliter 튜브에 들어있는 28%밀도 용액 400 microliters 위에 갓 제조한 12%밀도 용액 400 microliters를 천천히 조심스럽게 첨가합니다. 서로 다른 명암을 가진 두 개의 뚜렷한 층이 보여야 합니다. 그다음, 분류 샘플당 Fast Blue 양성 튜브 하나와 Fast Blue 음성 튜브 하나를 포함하여, 분류를 위한 1.5 milliliter 수집 튜브에 라벨을 붙입니다.

소화 기간이 끝나면 소화 효소를 버리고, 방금 시연한 것과 같이 1 mL의 PBS로 신경절을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 각 튜브에 200 µL의 신선한 신경절 해리 용액을 추가합니다. 그런 다음, 100 µL 부피로 설정된 200 µL 피펫을 사용하여, 기포가 생기지 않도록 주의하며 신경절을 여러 번 피펫팅하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.

손상되지 않은 조직 조각이 더 이상 보이지 않으면, 한 손으로 70 micron 세포 스트레이너를 단단히 잡고 분리된 세포 용액을 스트레이너 중앙에 피펫으로 옮깁니다. 그런 다음, 100 microliters의 신선한 신경절 분리 용액으로 분리 튜브를 세척하여 추가 세포를 수집합니다. 세척액을 스트레이너에 걸러내고, 새 피펫 팁을 사용하여 스트레이너 아래쪽에 남아 있는 세포 함유 용액을 흡입하여 세포 현탁액에 추가합니다.

이제 준비된 밀도 구배 위에 300 µL의 세포를 조심스럽게 층을 이루어 쌓습니다. 그리고 원심분리를 통해 신경절 세포를 수집합니다. 세포가 회전하는 동안, 소팅 시스 액(sorting sheath fluid)으로 인해 용해 버퍼가 심하게 희석되는 것을 방지하기 위해 Fast Blue 양성 수집 튜브에는 갓 제조한 용해 버퍼 300 µL를, 음성 수집 튜브에는 용해 버퍼 600 µL를 추가합니다.

원심분리가 끝나면, 세포 파편의 대부분이 포함된 상층액 700 microliters를 조심스럽게 제거합니다. 그다지 남은 세포에 신선한 신경절 해리 용액 700 microliters를 혼합합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 상층액을 조심스럽게 버립니다.

그 다음, 200 $\mu\text{L}$로 설정된 1,000 $\mu\text{L}$ 피펫을 사용하여 200 내지 300 $\mu\text{L}$의 sorting ganglia dissociation solution에 세포를 다시 현탁합니다. 그리고 분리 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 둡니다. FACS로 신경절 세포를 정제한 후, lysis buffer 내에서 뉴런을 1분간 볼텍싱하여 균질화합니다.

다음으로, 세포를 70% ethanol 1분량과 함께 여러 번 혼합한 후, 샘플을 최대 700 microliters까지 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 마이크로원심분리기를 사용하여 컬럼을 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리하고 통과액은 버립니다. 전체 샘플이 스핀 컬럼을 모두 통과하면, 표준 RNA 정제 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다.

그런 다음 마이크로플루이딕 전기영동 시스템을 사용하여 제조사의 사양에 따라 RNA 품질을 테스트하십시오. 이 그래프들에는 소팅 게이트를 설정하는 데 사용된 음성 및 양성 Fast Blue 대조군이 표시되어 있습니다. 분리된 Fast Blue 표지 Nodose 세포는 이후 Fast Blue 양성 및 Fast Blue 음성 집단으로 소팅될 수 있습니다.

이 방법의 분리 효율은 73~85%이며, 평균적으로 약 1,500개 이하의 Fast Blue 양성 세포와 약 60,000개의 Fast Blue 음성 세포가 수집되었습니다. 이 대표 샘플에서 관찰된 바와 같이, 미세유체 전기영동으로 얻은 18S 및 28S 피크를 사용하여 RNA 무결성 지수(RNA integrity number)를 계산함으로써 추출된 RNA의 품질을 결정할 수 있습니다. 숙련된 경우, 적절하게 수행한다면 이 기술은 4시간 30분 이내에 완료될 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 각 단계를 신속하게 진행하고 RNA 추출을 위해 갓 조제한 용액을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 기도 신경 지배 뉴런만이 가진 고유한 기능적 특성은 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 뉴런 배양과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 말초 신경생물학 분야의 연구자들이 미주신경의 결절신경절(nodose ganglia) 내 특정 기도 신경 지배 뉴런 집단의 고유한 특성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, RNA 시퀀싱에 사용하거나 기능 연구를 위해 플레이팅할 수 있도록 nodose ganglia의 특정 뉴런을 라벨링하고 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 2-Mercaptoethanol을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 화합물을 사용할 때는 항상 장갑 착용 및 화학 흄 후드 내 작업과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.