Name: Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 배우세요 기도 신경 분포하는 미주 신경절 감각 뉴런을 라벨링하고 분리하는 방법을. Fast Blue 추적과 세포 분류 기술을 활용하여 특정 뉴런 집단을 격리하고 고품질 RNA를 추출할 수 있습니다.

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NIH에서 지원하는 SEJ에 R01HL105635을 부여합니다. 저자는 기술적 조언 디에고 V. Bohórquez에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 기술 지원을 R. 이안 커밍 감사 및 공작 인간 백신 연구소 연구 유동 세포 계측법 공유 자원 시설 (더럼, NC)에 유동 세포 계측법을 수행하는 단계를 포함한다. 세포 계측법 건강의 국립 연구소, 알레르기 국립 연구소 감염증 (UC6-AI058607)에서 건설 부분 지원을받은 듀크의 지역 Biocontainment 연구소에서 수행 한 흐름.

동물 주제와 관련된 절차는 듀크 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 빠른 블루 1. 비강 관리 빠른 블루의 경우, 최소 2 일 마우스를 안락사 전에 염료를 관리 할 수​​ 있습니다. 염료는 최대 8 주 동안 지속됩니다. <ol><li> 천천히 시작 호흡 할 때까지 빛 흡입 마취 (2.5 %의 세보)와 마우스를 마취. </li><li> 마우스를 위해 때때로 일시 천천히 콧 구멍에 염료 용액 40 μL (0.4 mM의 패스트 블루, 1 % 디메틸 설폭 사이드, DMSO, 포스페이트 완충 식염수, PBS)을 심어 여과 팁 200 μL 피펫을 사용하여이 용액을 흡입한다 (도 1A). </li><li> 수직으로 마우스를 잡고 헤드 업, 부드럽게 염료 폐 전체에 확산하기 위해 가슴을 마사지. </li></ol> 해부 및 분석의 날 2. 준비 <ol><li> 10 ml의 준비0 표 1에 명시된 성분을 조합하여 신경절 해리 용액 (GADS). </li><li> 전용 실험실 영역에서 RNA 추출을 수행합니다. 실험, 70 % 에탄올, 10 % 표백제와의 RNase의 오염 제거 시약과 깨끗한 표면을 시작하기 전에. 이 RNA 원심 분리기 모든 튜브 랙 및 피펫을 포함한다. RNA 사용만을위한 전용 필터 팁 박스가 있는지 확인합니다. 이 샘플을 오염 바와 같이, DNA의 준비를 위해이 장비와 영역을 사용하지 마십시오. </li><li> 의 RNA 분해 효소가없는 물을 신선한 70 %, 80 % 에탄올을 혼합한다. 샘플 당 1 ml의 RNA 추출에 사용될 준비한다. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 고급 DMEM / F12 </td><td> 9.5 ml의 </td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> HEPES (10 밀리미터) </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> N2 보충 </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> B27 (NO 비타민 A) </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> NGF (50 μg의 / ㎖) </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> 신경절 해리 솔루션 (GADS) 표 1. 시약의 혼합물. 3. 해부 절차 <ol><li> 500 μL GADS, 각 실험 샘플에 대한 하나의 긍정적 정렬 제어를위한 하나, 그리고 음의 정렬 제어를위한 하나의 1.5 ml의 튜브를 입력합니다. 해부에 걸쳐 얼음에 보관 튜브. </li><li> nodose 신경절을 해부 및 분리를 용이하게하기 위해 두 부분 컷을 한 후 실험 샘플 튜브에 넣어. nodose 신경절 (16)와 DRG (17)의 해부에 대해 다음 조브 프로토콜을 참조하십시오. </li><li> 정렬 컨트롤, 해부 및 부분적 지느러미 루트 신경절 (DRG)와 같은 비 표지 신경을 잘라. 양성 대조군과 두 gangli 두 신경절을 사용하여부정적인 제어를위한. </li><li> 성공적인 정렬을위한 충분한 nodose 신경 세포를 얻으려면 하나의 실험 샘플 튜브 포함 GADS에 5 쥐에서 신경을 결합한다. </li></ol> 4. 감각 신경절 해리 <ol><li> 관에 신경을 떠나, 500 μL의 GADS를 피펫. 신경절 후, 튜브의 바닥에 정착 PBS를 피펫을 위해 1 ml의 PBS를 추가하여 한 번에 신경을 씻어 기다립니다. </li><li> 1 ml의 GADS과 소화 효소의 22 μL (콜라게나 제 I / II 및 단백질 분해 효소 믹스, 2.5 ㎎ / ㎖에서 H 2 O)에 각 튜브를 추가합니다. </li><li> 양성 대조군 튜브에 20 μl의 빠른 블루 (5.26 mm)를 추가합니다. </li><li> 이미 37 ℃에서 설정된 수욕 또는 가열 블록에 튜브를 넣고. 참고 : 신경 소화의 시간은 소화 효소의 나이에 따라 달라집니다. 6개월 45 분 동안 소화 - (2) 내에 소화 효소를 용해 1 개월 내에 30 분 동안 소화. 효소가 6 개월 이상 된 경우, 신경 f를 소화또는 60 분. </li><li> 15 분마다 흔들어 튜브 짧게 신경을 보장하기 위해 그들을 가볍게는 솔루션이 적용됩니다. </li><li> 신경 소화되는 동안 입자 용액 (폴리 비닐 피 롤리 돈 코팅 된 콜로이드 실리카 입자)를 사용하여 농도 구배를 준비한다. <ol><li> GADS에서 12 % 입자 용액, 샘플 당 500 μl를 섞는다. </li><li> GADS에서 28 % 입자 용액, 샘플 당 500 μl를 섞는다. </li><li> 천천히 조심스럽게 각 샘플에 대한 신선한 1.5 ML 튜브에 400 ㎕의 28 % 농도의 용액의 상단에 400 μl의 12 % 밀도 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 두 층이 혼합하는 것을 허용하지 않습니다. 두 가지 층은 튜브에 표시한다 다른 것보다 어두운 하나. </li></ol></li><li> 신경이 소화되는 동안, (정렬 샘플 당 하나의 빠른 긍정적 인 블루와 하나의 빠른 블루 부정적인 튜브를) 정렬 새로운 1.5 ml의 수집 튜브 라벨. INTERFER하지 않도록 정렬 기능 요구에 따라,이 튜브는 착탈 뚜껑 있어야셀 소터와 전자. </li><li> 적절한 소화 시간 후, 소화 효소와 GADS를 제거하고 1 ml의 PBS로 두 번 신경을 씻는다. 각 튜브에 신선한 GADS 200 μl를 추가합니다. </li><li> 떨어져 세포를 파괴하기 위해 위아래로 여러 번 100 μl의 볼륨 설정 200 μL 피펫, 피펫의 신경을 사용합니다. 조직에는 손상 조각이 볼 수없는 때까지 반복합니다. 용액에 거품을 만들지 마십시오. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 해리 세포를 전달합니다. </li><li> 남아있는 나머지 길 잃은 셀을 선택하고 셀 스트레이너를 통해 추가 솔루션을 전달하는 원래 분리 튜브에 또 다른 100 μL의 GADS를 추가합니다. 새로운 피펫 팁을 사용하여 여과기를 통과 메시에 집착 한 나머지 세포 함유 액체를 수집합니다. GADS 현탁 세포의 최종 부피는 300 μL이다. </li><li> 조심스럽게 이전에 만든 밀도 기울기의 상단에 세포의 300 μl를 층. 거품을 피하고 C의 혼합밀도 레이어 ELL 학생. </li><li> RT에서 2,900 XG에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 세포를 원심 분리에있는 동안 다음, 용해 완충액 (실험 샘플 당 1 ml)에 섞어 10 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 (RNA 추출 키트) 1 ㎖의 완충액 RLT있다. <ol><li> 빠른 블루 긍정적 인 포집 관에 300 μL 용해 버퍼와 빠른 블루 음의 포집 관 (단계 4.7에서 표시 관) 600 μl를 추가합니다. 이 볼륨을 수집 할 예정 셀의 수에 의존한다. 7000 세포 600 μl를 추가 들어 &lt;2,000 세포, 300 μl를 추가&gt;가. 이것은 상당히 용해 완충 용액을 희석하지 않는 정렬 피복 유체를 보장한다. </li></ol></li><li> 원심 분리가 완료된 후, 조심스럽게 제거하고 700 ㎕의 상단 층을 버린다. 이 계층은 다른 세포 정렬을 방해 세포 파편의 대부분을 포함하고 있습니다. </li><li> 용액을 피펫 함유 나머지 셀에 700 μL의 신선한 GADS 추가테 위아래로 여러 번 혼합한다. </li><li> 세포 펠렛 2,900 XG에 15 분 동안 원심 분리기. </li><li> 세포를 원심 분리기에있는 동안, 1 ML의 GADS 5 μL의 DNase의 (10 ㎎ / ㎖)을 추가하여 GADS를 (샘플 당 500 μl를) 정렬 섞는다. </li><li> 원심 분리가 완료되면 조심스럽게 세포 펠렛을 떠나, 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 다시 일시 정지 (200)에서 세포 펠렛 - 최대 피펫 팅하여 200 ㎕를 여러 번으로 설정 1,000 μL 피펫과 아래로 300 ㎕를 정렬 GADS를. 얼음에 샘플을 넣습니다. 셀은 정렬 할 준비가 된 것입니다. </li></ol> 5. 형광 활성 셀 (FAC) 정렬 참고 :이 섹션은 운영 FACS 분류기의 지식이나 숙련 된 인력의 도움을 필요로한다. <ol><li> 세포 생존 능력을 테스트하기 위해 각각의 샘플 1 ㎕의 요오드화 프로피 듐 (PI) 스톡 용액 (50 μg의 / ㎖)을 추가한다. 이 튜브, PI 하나 하나없이로 음성 대조군을 분할합니다. PI는 죽은 세포에서 DNA를 결합한다. 만약처음 몇 종류 후, PI의 사용이 필요하지 않은 레이블을 할 죽은 세포가 없습니다. </li><li> 전송 세포는 얼음에 예., BD FACS AriaII이, 디바 8 소프트웨어를 실행, 악기 유동 세포 계측법합니다. </li><li> 셀 크기는이 모집단에서 가변하기 때문에, 정렬에 많은 노즐 (100 μm의)을 사용한다. 응력 세포 경험의 양을 감소시키고 세포 생존력은 낮은 압력 (20 PSI)을 사용하여 증가한다. </li><li> 분석 플롯, 필요한 경우 앞으로 산란, 사이드 분산 형 (SSC), 패스트 블루, 그리고 PI를 설정하는 FACS 분류기 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 세포를 다시 일시 중단하려면, 부드럽게 분류기에로드하기 전에 샘플 잠시 소용돌이. </li><li> 게이트 임계 값 (그림 2A)를 설정, 음성 대조군, 더 빠른 블루 또는 PI로 시작합니다. 이 세포 집단의 자기 형광의 양을 결정할 것이다. 옵션 : 죽은 세포의 인구가 있는지 여부를 확인하는 PI와 음성 시료를 실행합니다. </li><li> (INC 양성 대조군 샘플을 정렬보상 매개 변수를 설정하기 위해) 빠른 블루와 ubated. </li><li> 문 및 매개 변수가 설정되면, 실험 샘플을 정렬 시작합니다. RNA 샘플을 용해 완충액을 포함하는 제조 수집 튜브로 정렬된다. </li><li> 셀 정렬이 완료 될 때까지 얼음에 정렬 된 샘플을 유지합니다. </li><li> 세포는 정렬 후 즉시 RNA 추출 단계를 시작한다. </li></ol> 6. RNA 추출 <ol><li> 1 분 동안 용해 버퍼에 소용돌이 분류 세포를 균질화한다. </li><li> 몇 번을 피펫 팅 아래로 70 % 에탄올과 혼합의 1 볼륨을 추가합니다. </li><li> 스핀 컬럼에 시료 700 ㎕의 최대 전송합니다. 8,000 × g으로 15 초 동안 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. <ol><li> 시료의 총 부피가 스핀 컬럼을 통과 할 때까지 반복한다. </li></ol></li><li> 제조자 protoco에있어서, 상기 DNase를 처리 단계를 포함하는, 350 ㎕의 완충액 RW1을 추가하고 RNA 정제 과정을 계속셀 리터. </li><li> RNA 추출 된 후에, 제조자의 명세에 따른 전기 영동 미세 유체 시스템을 사용하여 RNA의 품질을 테스트한다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜은 미주 신경의 신경절에 nodose기도 - 근에 분포하는 신경 세포를 대상으로하는 방법을 설명한다. 일단 라벨링 신경절 부드럽게 최적 세포 수 및 생존력을 유지하기 위해 분해된다. 이들 뉴런은 FAC가 용해 버퍼에 직접 정렬 및 RNA를 추출 후이다. 이 프로토콜의 의미는, 분리 대상 및 특정 감각 세포 집단의 품질을 보존하는 능력이다. 유전자 발현은 신경이 작은 집단에서 설명되고, 기관 특이 기능 및 신경망이 식별된다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 분리 과정을 통해 빠른 진행과 이후의 세포 정렬을 포함한다. 분리 직후에 시작되도록 정렬 시간을 예약하는 것이 중요하다. 이 RNA 추출을위한 모든 튜브와 장비는 모든 RNA 추출 시약, 신선 70 %와 80 % 에탄올 솔루션은 신선한 만든, 그리고 것이 중요하다무료 깨끗하고의 RNase 있습니다. 이 프로토콜은 세포가 단일 세포 RN​​A 추출 및 시퀀싱 웰 플레이...

체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경의 세포 기관은 등 지느러미 루트, 삼차, 또는 nodose 신경절로, 감각 신경에 있습니다. 각각의 감각 신경절은 신체의 특정 지역을 innervates 및 해당 지역 내에서 별도의 기관과 조직을 신경을 분포시키다 세포가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 및 삼차 신경은 두개골에있는 동안기도 1 위 얼굴, 눈, 수막 또는 신경을 분포시키다 뉴런을 포함, 몸과 팔다리에 걸쳐 프로세스를 확장, 2. 미주 신경의 nodose 신경 낮은기도와 폐에 3 두개골 아래 목에 위치하고 있으며, 위장관, 심장에 걸쳐 신경 섬유를 확장 세포 기관을 포함하고있다. 인간의 nodose 신경절 그러나, 마우스에이 융합 혼자 서또한 폐 (4)를 innervates 경정맥 신경절과 함께. 이 융합 된 신경절 자주 / 경정맥 nodose 복잡한, 미주 신경절이라고, 또는 단순히 nodose 신경절 5있다. 여기서,는 nodose 신경절로 지칭된다. nodose의 구 심성 섬유는 뇌간의 고독한 기관 (NTS)의 핵에 내장 정보를 전달합니다. 이 독특한 신경절에 감각 입력은 소화관 운동성 6, 심장 박동 7, 8, 9 호흡 및 자극 활성화 호흡 응답 10, 11와 같은 기능의 다양한 배열을 제어합니다. 기능과 신경 지배 기관의 다양성, 대상과 개인의 연결 경로를 연구하기 위해 nodose 신경절의 기관 고유의 소집단을 분리하는 것이 중요합니다. 그러나 nodose의 작은 크기와이 사소한 작업이 아니다 포함 뉴런의 수가 제한을 부여. 신경절 nodose 각 마우스는 약 5,000 뉴런 (12) 포함위성 세포를지지하는 광범위한 집단에 추가한다. 5 % 정신 자극기도 - 5,000 nodose 신경 만 3. 따라서 인해 호흡기 자극 또는 병리에기도 - 근에 분포하는 신경 세포 내의 기능적인 형태 또는 분자 변화는, 조밀하게 포장 nodose 신경절에서 손실됩니다. 이 문제를 해결하기 위해 방법을 식별하고기도에 분포 뉴런을 격리하기 위해 개발되었다. 기도는 이후의 근에 분포 nodose 뉴런을 식별하는 추적 형광 염료에 노출시켰다. 빠른 블루 신경 세포에 의해 포착하고이 최대 팔주 (13)에 대해 유지됩니다 자신의 세포 기관에 신속하게 이동했다 - 15. 일단 부드러운, 아직 효율적 해리 프로토콜은 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬 염료 라벨 및 세포 생존을 유지하는 데 사용되었다 확인했다. 정렬 세포는 유전자 발현 또는 F를 결정하기 위해 고품질의 리보 핵산 (RNA)을 추출하는 데 사용됩니다또는 다른 다운 스트림 분자 분석. 이 프로토콜은 관심의 조직을 신경을 분포시키다 감각 뉴런을 분리하기위한 유용하고 강력한 기술을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>패스트 블루</td><td>폴리사이언스, Inc.</td><td>17740-2</td><td>물 중 2mg/ml 재고</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 레드 니슬 염색</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(PBS) Ca 및 Mg free</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>글루타민( Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (비타민 A 없음)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>신경 성장 인자 (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &micro; PBS/10% FBS 소화 효소의 g/ml</td></tr><tr><td>, Liberase DH 연구 등급</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>재고 2.5 mg/ml in water</td></tr><tr><td>particle solution (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>절대 에탄올(200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>RNase free water</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>RNase 오염 제거 시약, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 키트, RNeasy 플러스 마이크로 키트</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>DNase 키트, RNase-Free DNase 세트</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>재고 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>재고 10 &micro에 10 mg/ml; PBS</td></tr><tr><td>미세유체 전기영동 시스템(TapeStation 2200)</td>의 g/ml애<td>질런트</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경 세포의 세포 기관은 감각 신경절 내에 위치하고 있습니다. 감각 신경은 신체의 특정 기관 또는 부분에 분포. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 신체 사지에 걸쳐 프로세스를 연장한다. 삼차 신경은 두개골에있는 얼굴을 신경을 분포시키다, 상부기도한다. nodose 신경절의 미주 구 심성은 창자, 심장, 폐를 통해 확장 할 수 있습니다. 호흡,기도 자극, 기침 반사 신경 다음 nodose 뉴런과 같은 기능의 다양한 배열을 제어 할 수 있습니다. 따라서, 이해하고 기능을 조작하기 위해서는기도 특정 신경 하위 집단을 확인하고 분리하는 것이 매우 중요하다. 마우스에서,기도는기도 별 nodose 신경 세포의 역행 추적을위한 형광 추적 염료, 빠른 블루,에 노출에스. nodose 신경이 분해되고 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬은 염료 양성 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 다음으로, 고품질의 리보 핵산 (RNA)가 차세대 시퀀싱 염색 양성 세포로부터 추출된다. 특정 신경 세포의 유전자 발현이 결정되는이 방법의기도를 사용.

이 방법을 사용하여,기도 - 근에 분포하는 신경 세포는 비강 빠른 블루 (그림 1A)를 주입하여 표시되어 있습니다. 이일 후, 빠른 블루 라벨 세포는 nodose 신경절 (그림 1C)에 나타납니다. nodose 신경절의 총 신경 인구의 5 % -이 세포들은 3을 차지합니다. 이러한 목적을 위해 사용 된 다른 역행 염료 DII (1,1&#39;- 디 옥타 데실 3,3,3 &#39;, 3&#39;- tetramethylindocarbocyanine 과염소산) 및 Fluorogold을 포함한다. 신경 nodose DII 라벨 폐 노출. 그러나, DII가 신경절에 도달하는 데 시간이 더 소요 7~14일 점안 (18, 19) 이후, 따라서 적극적으로 이송 염료를 사용 하였다. Fluorogold 또한기도 뉴런 14, 20 라벨에 사용되었습니다 적극적으로 이송 염료이다. 경험 그러...

장기 특이적 감각 뉴런은 식별하기 어렵습니다. Fast Blue 추적은 세포 분류를 위해 기도에 신경을 분포시키는 노도즈(nodose) 뉴런을 식별하는 데 사용됩니다. 분류된 노도즈(nodose) 뉴런은 염기서열분석을 위해 고품질 리보핵산(RNA)을 추출하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 기도 특이적 뉴런의 유전자 발현을 측정합니다.

Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

본 실험의 전반적인 목표는 미주신경의 기도 신경 지배 노도 뉴런(nodose neurons)을 표지하고 분리하는 것입니다. 이 방법은 기도 신경 지배 뉴런이 어떤 식별 특성을 가지고 있는지와 같은 말초 신경생물학 분야의 주요 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 특정 신경세포 집단을 표적화하고 분리하기 위한 강력하고 고효율의 방법을 제공한다는 것입니다. 감각 신경절을 수확한 후, 신경절을 건드리지 않고 각 튜브에서 500 µL의 신경절 해리 용액을 흡입하여 제거하십시오. 다음으로, 각 시료에 1 mL의 PBS를 추가하고 신경절이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다리십시오.그다음, PBS를 제거하고 소화 효소가 첨가된 신경절 해리 용액 1 mL를 뉴런에 넣은 후, 양성 대조군 튜브에 Fast Blue 20 µL를 추가합니다. 소화 효소의 사용 기간에 따른 적절한 시간 동안 튜브를 37 °C에서 배양합니다. 이때 15분마다 튜브를 짧게 흔들거나 튕겨주어 신경절이 소화 용액에 충분히 잠기도록 합니다.신경 세포가 소화되는 동안, 샘플당 하나의 1.5 milliliter 튜브에 들어있는 28%밀도 용액 400 microliters 위에 갓 제조한 12%밀도 용액 400 microliters를 천천히 조심스럽게 첨가합니다. 서로 다른 명암을 가진 두 개의 뚜렷한 층이 보여야 합니다. 그다음, 분류 샘플당 Fast Blue 양성 튜브 하나와 Fast Blue 음성 튜브 하나를 포함하여, 분류를 위한 1.5 milliliter 수집 튜브에 라벨을 붙입니다.소화 기간이 끝나면 소화 효소를 버리고, 방금 시연한 것과 같이 1 mL의 PBS로 신경절을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 각 튜브에 200 µL의 신선한 신경절 해리 용액을 추가합니다. 그런 다음, 100 µL 부피로 설정된 200 µL 피펫을 사용하여, 기포가 생기지 않도록 주의하며 신경절을 여러 번 피펫팅하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다.손상되지 않은 조직 조각이 더 이상 보이지 않으면, 한 손으로 70 micron 세포 스트레이너를 단단히 잡고 분리된 세포 용액을 스트레이너 중앙에 피펫으로 옮깁니다. 그런 다음, 100 microliters의 신선한 신경절 분리 용액으로 분리 튜브를 세척하여 추가 세포를 수집합니다. 세척액을 스트레이너에 걸러내고, 새 피펫 팁을 사용하여 스트레이너 아래쪽에 남아 있는 세포 함유 용액을 흡입하여 세포 현탁액에 추가합니다.이제 준비된 밀도 구배 위에 300 µL의 세포를 조심스럽게 층을 이루어 쌓습니다. 그리고 원심분리를 통해 신경절 세포를 수집합니다. 세포가 회전하는 동안, 소팅 시스 액(sorting sheath fluid)으로 인해 용해 버퍼가 심하게 희석되는 것을 방지하기 위해 Fast Blue 양성 수집 튜브에는 갓 제조한 용해 버퍼 300 µL를, 음성 수집 튜브에는 용해 버퍼 600 µL를 추가합니다.원심분리가 끝나면, 세포 파편의 대부분이 포함된 상층액 700 microliters를 조심스럽게 제거합니다. 그다지 남은 세포에 신선한 신경절 해리 용액 700 microliters를 혼합합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 상층액을 조심스럽게 버립니다.그 다음, 200 $\mu\text{L}$로 설정된 1,000 $\mu\text{L}$ 피펫을 사용하여 200 내지 300 $\mu\text{L}$의 sorting ganglia dissociation solution에 세포를 다시 현탁합니다. 그리고 분리 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 둡니다. FACS로 신경절 세포를 정제한 후, lysis buffer 내에서 뉴런을 1분간 볼텍싱하여 균질화합니다.다음으로, 세포를 70% ethanol 1분량과 함께 여러 번 혼합한 후, 샘플을 최대 700 microliters까지 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 마이크로원심분리기를 사용하여 컬럼을 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리하고 통과액은 버립니다. 전체 샘플이 스핀 컬럼을 모두 통과하면, 표준 RNA 정제 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다.그런 다음 마이크로플루이딕 전기영동 시스템을 사용하여 제조사의 사양에 따라 RNA 품질을 테스트하십시오. 이 그래프들에는 소팅 게이트를 설정하는 데 사용된 음성 및 양성 Fast Blue 대조군이 표시되어 있습니다. 분리된 Fast Blue 표지 Nodose 세포는 이후 Fast Blue 양성 및 Fast Blue 음성 집단으로 소팅될 수 있습니다.이 방법의 분리 효율은 73~85%이며, 평균적으로 약 1,500개 이하의 Fast Blue 양성 세포와 약 60,000개의 Fast Blue 음성 세포가 수집되었습니다. 이 대표 샘플에서 관찰된 바와 같이, 미세유체 전기영동으로 얻은 18S 및 28S 피크를 사용하여 RNA 무결성 지수(RNA integrity number)를 계산함으로써 추출된 RNA의 품질을 결정할 수 있습니다. 숙련된 경우, 적절하게 수행한다면 이 기술은 4시간 30분 이내에 완료될 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 각 단계를 신속하게 진행하고 RNA 추출을 위해 갓 조제한 용액을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 기도 신경 지배 뉴런만이 가진 고유한 기능적 특성은 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 뉴런 배양과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 말초 신경생물학 분야의 연구자들이 미주신경의 결절신경절(nodose ganglia) 내 특정 기도 신경 지배 뉴런 집단의 고유한 특성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, RNA 시퀀싱에 사용하거나 기능 연구를 위해 플레이팅할 수 있도록 nodose ganglia의 특정 뉴런을 라벨링하고 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 2-Mercaptoethanol을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 화합물을 사용할 때는 항상 장갑 착용 및 화학 흄 후드 내 작업과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

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우리는 2.0 mm 검경과 이경을 사용하여 직접 후두경을 통해 마우스에서 기관 내 삽관을위한 간단하고 신뢰할 수있는, 그리고 상대적으로 저렴한 방법을 개발했습니다. 이 기술은 atraumatic이고 만성 실험에서 반복 측정에 사용될 수있다. 우리는 우수한 기관 절개 또는 이전에 비수술 적 방법을보고 찾을 수 있습니다.

마우스의 기관 내 삽관<em&gt;를 통해</em이경 사용&gt; 직접 후두경

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마우스의 얼굴 신경 Axotomy : 부상으로 운동 신경 응답을 연구하는 모델

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

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Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

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