Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

이 실험의 전반적인 목표는 미주신경의 기도 신경 분포 노도즈 뉴런에 라벨을 붙이고 분리하는 것입니다. 이 방법은 말초 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 기도 신경 분포 뉴런이 가지고 있는 식별 특성은 무엇입니까?

이 기술의 주요 장점은 특정 신경 세포 집단을 표적으로 삼고 분리하기 위한 강력하고 높은 처리량 방법을 제공한다는 것입니다. 감각 신경절을 채취한 후 신경절을 방해하지 않고 각 튜브에서 500마이크로리터의 신경절 해리 용액을 흡인합니다. 다음으로, 각 샘플에 1ml의 PBS를 추가하고 신경절이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다.

그런 다음 PBS를 제거하고 소화 효소가 보충된 1ml의 신경절 해리 용액을 뉴런에 첨가한 다음 20마이크로리터의 Fast Blue를 양성 대조 튜브에 추가합니다. 소화 효소의 나이에 따라 적절한 시간 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 15분마다 튜브를 짧게 흔들고 튕겨서 신경절이 소화액으로 덮여 있는지 확인합니다.

신경 세포가 소화되는 동안 샘플당 1.5ml 튜브 하나에 400마이크로리터의 28% 밀도 용액 위에 새로 준비된 12% 밀도 용액 400마이크로리터를 천천히 조심스럽게 추가합니다. 두 개의 별개의 레이어가 보여야 하며, 하나는 다른 레이어보다 어둡습니다. 다음으로, 분류 샘플당 Fast Blue 양극 튜브 1개와 Fast Blue 음극 튜브 1개를 포함하여 분류를 위한 1.5ml 수집 튜브에 라벨을 붙입니다.

소화 기간이 끝나면 소화 효소를 버리고 방금 시연한 것처럼 1ml의 PBS로 신경절을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 각 튜브에 200마이크로리터의 신선한 신경절 해리 용액을 추가합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터 부피로 설정된 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 신경절을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리하고 기포를 피하지 않도록 주의합니다.

온전한 조직 조각이 보이지 않으면 한 손에 70미크론 세포 여과기를 단단히 잡고 해리된 세포 용액을 여과기 중앙에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 100마이크로리터의 새 신경절 해리 용액으로 해리관을 세척하여 추가 세포를 수집합니다. 여과기를 통해 세척을 파일러하고 새 피펫 팁을 사용하여 여과기 아래쪽에 남아 있는 용액을 흡인하여 세포 현탁액에 추가합니다.

이제 300마이크로리터의 모든 세포를 이전에 준비된 밀도 구배 위에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 그리고 원심분리로 신경절 세포를 수집합니다. 세포가 회전하는 동안 새로 준비된 용해 완충액 300마이크로리터를 Fast Blue 포지티브 수집 튜브에 추가하고 600마이크로리터의 용해 버퍼를 음성 수집 튜브에 추가하여 분류 피복 유체가 용해 완충액을 크게 희석하지 않도록 합니다.

원심분리가 끝나면 대부분의 세포 파편을 포함하는 용액의 상단 700마이크로리터를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 700마이크로리터의 신선한 신경절 해리 용액을 나머지 세포와 혼합합니다. 원심분리로 세포를 펠렛화하고 상등액을 조심스럽게 버립니다.

그런 다음 200-300 마이크로 리터의 분류 신경절 해리 용액에 세포를 200 마이크로 리터로 설정된 1, 000 마이크로 리터 피펫으로 다시 현탁시킵니다. 그리고 분류할 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 놓습니다. FACS에 의해 신경절 세포를 정제한 후, 와류(vortexing)로 1분 동안 용해 완충액의 뉴런을 균질화합니다.

다음으로, 한 부피의 70% 에탄올과 세포를 여러 번 혼합하고 최대 700마이크로리터의 샘플을 스핀 컬럼으로 이동합니다. 마이크로 원심분리기에서 8, 000 x g에서 15초 동안 컬럼을 원심분리하고 플로우 스루를 버립니다. 전체 샘플이 스핀 컬럼을 통과하면 표준 RNA 정제 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다.

그런 다음 미세유체 전기영동 시스템을 사용하여 제조업체의 사양에 따라 RNA 품질을 테스트합니다. 이 그래프에는 정렬 게이트를 설정하는 데 사용되는 음수 및 양수 Fast Blue 컨트롤이 표시됩니다. 그런 다음 해리된 Fast Blue Labeled Nodose 세포를 Fast Blue 양성 및 Fast Blue 음성 집단으로 분류할 수 있습니다.

이 방법의 분류 효율은 73-85%이며 평균적으로 약 1, 500 이하의 Fast Blue 양성 세포와 거의 60, 000개의 Fast Blue 음성 세포가 수집됩니다. 이 대표적인 샘플에서 관찰된 바와 같이, 미세유체 전기영동에 의해 달성된 18S 및 28S 피크는 추출된 RNA의 품질을 결정하기 위해 RNA 무결성 수를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 단계를 빠르게 진행하고 RNA 추출을 위해 새로 준비된 용액을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 뉴런 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 기도 신경 분포 뉴런에 고유한 기능적 특성은 무엇입니까? 개발 후, 이 기술은 말초 신경생물학 분야의 연구자들이 미주신경의 결절신경절(nodose ganglia)에 있는 특정 기도 신경 분포 집단의 고유한 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 RNA 염기서열분석에 사용하거나 기능 연구에 도금할 수 있는 nodose ganglia의 특정 뉴런을 라벨링하고 해리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 2-메르캅토에탄올로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 화합물을 사용할 때는 항상 장갑을 착용하고 화학 물질 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.