BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

이 분화 프로토콜의 전반적인 목표는 배양에서 심방 심근세포의 동질적인 집단을 생성하는 것입니다. 따라서 이 방법은 심장 발달 및 심방 부정맥과 같은 심장 질환 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외에서 심방 심근세포의 균일한 배양을 생성하고 최소한의 교육으로 수행할 수 있다는 것입니다.

마우스 배아 줄기 세포 또는 mESC 배양을 설정하기 최대 4일 전에 멸균된 조직 배양 후드에서 웰당 1ml의 젤라틴이 있는 6개의 웰 플레이트에 각각 5ml의 0.2% 젤라틴 용액으로 10cm 조직 접시를 코딩합니다. 배양 당일, 여분의 젤라틴 용액을 제거하고 젤라틴으로 코팅된 10cm 접시 중 하나에 10ml의 매체를 추가합니다. 그런 다음 cryotongs를 사용하여 1 x 10의 바이알을 섭씨 37도의 수조에서 6mESC로 부드럽게 휘젓고 바이알 중앙에 작은 얼음 결정만 남을 때까지 돌립니다.

보푸라기가 없는 일회용 물티슈로 바이알을 건조시키고 70% 에탄올로 살균합니다. 그런 다음 바이알을 조직 배양 후드에 놓고 P1000 피펫을 사용하여 ESC를 접시에 추가합니다. 이산화탄소가 5%인 37도 섭씨 가습 세포 배양 인큐베이터에 세포를 놓고 플레이트를 앞뒤로, 좌우로 부드럽게 움직여 세포를 고르게 분포시킵니다.

배양이 끝나면 명시야 현미경을 사용하여 세포 부착을 확인합니다. 일부 파편과 죽은 세포가 관찰됩니다. 배지를 10ml의 새로운 mESC 배지로 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.

배양액이 60-70% confluent가 되면 마그네슘과 칼슘이 없는 5ml의 멸균 DPBS로 플레이트를 헹구고 섭씨 37도의 트립신 EDTA 2ml에 5분 동안 세포를 배양합니다. 세포가 배양하는 동안 계대 배양당 1개의 새로운 10cm 접시에서 여분의 젤라틴 용액을 흡인하고 각 플레이트에 10ml의 배지를 추가합니다. 그런 다음 15 밀리리터 튜브에서 원심분리를 통해 분리된 세포를 수집하고 10 밀리리터의 mESC 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

원하는 분할 비율에 따라 각 10cm 접시에 0.5-1ml의 세포 현탁액을 추가하고 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓고 방금 설명한 것처럼 각 접시에 세포를 부드럽게 분포시킵니다. 계대세포가 70% 합류하면 방금 설명한 대로 트립신 EDTA로 분리한 다음 5ml의 배아체 또는 EB 배지에 단세포 현탁액을 재현탁합니다. mESC를 세고 적절한 부피의 EB 배지로 2.5 곱하기 10의 최종 농도로 밀리리터당 3번째 세포로 희석합니다.

다음으로, 행잉 드롭 배양당 10cm 멸균 박테리아 페트리 접시 1개의 바닥에 PBS 2ml를 추가하고 EB 현탁액을 멸균 용액 수조로 옮깁니다. 이제 준비된 접시 중 하나에서 뚜껑을 제거하고 6 개의 팁이 장착 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 EB 현탁액 60 방울 20 개를 내부 표면에 조심스럽게 떨어 뜨립니다. 매달려 있는 방울이 떨어지지 않도록 주의하면서 뚜껑을 접시에 부드럽게 다시 놓고 접시를 이틀 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

EB'ss를 씻어내려면 행잉 드롭 배양액에서 뚜껑을 조심스럽게 제거하고 45도 각도로 기울입니다. 그런 다음 실온 EB 배지가 들어 있는 5ml 혈청 피펫을 사용하여 EB를 뚜껑 바닥에 있는 수영장으로 부드럽게 씻습니다. 뚜껑 표면에 붙어 있는 EB가 있는지 주의 깊게 검사한 다음 EB를 코팅되지 않은 6cm 페트리 접시에 옮깁니다.

EB를 조직 배양 인큐베이터에 다시 2일 동안 다시 넣고 EB 응집 및 부착을 위해 매일 플레이트를 확인합니다. EB를 도금하기 전에 준비된 6웰 플레이트의 각 웰에 있는 과도한 젤라틴 코팅 용액을 2밀리리터의 갓 준비된 실온 Grem2 처리 매체로 교체합니다. 그런 다음 100마이크로리터로 설정된 P1000 피펫을 사용하여 30EB를 각 웰로 옮긴 다음 플레이트를 밤새 인큐베이터에 다시 넣고 시연된 대로 부드러운 움직임으로 세포를 고르게 분산시킵니다.

EB가 우물 바닥에 부착된 후 10일째까지 2일마다 Grem2 배지를 교체하십시오. 그런 다음 건강한 세포 배양을 유지하기 위해 이틀에 한 번씩 새로운 EB 배지를 세포에 공급합니다. 행잉 드롭(hanging drop) 배양 전에는 만능 줄기 세포가 조밀하고 자발적인 분화가 없어야 합니다.

자발적인 분화가 관찰되는 경우, 해당 세포는 행잉 드롭 배양에 사용되어서는 안 됩니다. 질 EB는 일반적으로 균등하게 간격을 두는, 잘 둥근 거는 하락 안에 가장 잘 형성됩니다. 분화 둘째 날까지, EB는 매달려 있는 방울의 끝에서 분화 줄기 세포의 구형 배열로 육안으로 볼 수 있어야 합니다.

넷째 날에는 잘 형성된 EB가 자유롭게 떠다니고 크기와 모양이 균일해야 합니다. 일단 플레이트가 형성되면, 세포가 EB에서 조직 배양 플레이트의 표면으로 이동함에 따라 EB는 평평해지는데, 이는 분화 8일과 10일에 관찰된 바와 같습니다. 처리되지 않은 대조군 유정에서는 작고 천천히 수축하는 패치가 빠르면 6일째, 늦게는 9일째에 관찰됩니다.

Grem2 처리된 유정에서는 상대적으로 수축 속도가 빠른 큰 패치가 일반적입니다. 분화된 세포의 유전자 발현에 대한 RT-QPCR 분석은 일반적으로 Grem2 처리 배양에서 높은 수준의 심장 구조 및 조절 유전자를 보여줍니다. alpha-MHC DsRed 핵 세포주를 사용하는 경우, 심근세포의 수율 증가는 Grem2 처리된 웰에서 DsRed 표지된 핵의 수가 더 많아지는 것으로 관찰됩니다.

Grem2 처리는 또한 RT-QPCR 및 세포 활동 전위 지속 시간의 패치 클램프 측정에 의해 확인된 바와 같이 심방과 유사한 표현형으로 분화를 편향시킵니다. 일단 마스터하면 분화 줄기 세포는 60분 이내에 Grem2로 처리할 수 있으며 구슬 모양 세포는 일반적으로 7일째에 관찰됩니다. 이 절차를 시도하는 동안, brachyury와 같은 gastrulation markers의 최대 발현 후 4일째에 Grem2를 지속적으로 추가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 전기 생리학 및 QPCR과 같은 다른 방법을 수행하여 생성된 세포의 기능 및 분자 특성을 이해할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 Grem2를 사용하여 마우스 ESC에서 심방 심근 세포를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.