Name: 인간 공막의 공 초점 현미경을 수행하기 위해 코팅 기술을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 학습하세요 인간 공막 조직의 공 초점 현미경법으로 면역 세포 분포와 혈관 상태를 분석하는 방법을. 코팅 기술을 활용하여 조밀한 결합 조직의 상세 영상을 얻고 안과 질환 연구에 활용하세요.

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독일 연구 재단 (FOR2240 "(림프) 안구 염증성 질환에서의 혈관 형성 및 세포 면역"을 CC 및 LMH에; HE 6743/2-1 및 HE 7643/3-1에서 LMH로; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 "Joining Forces to Corneal Regeneration" (to CC).

인체 조직의 사용을 검토하고 제도적 검토 보드 또는 동등한 승인을 받아야한다. 여기에 설명 된 작업은 지역 윤리위원회의 승인 및 과학 시험 승인을 펼쳤습니다. 이 작품은 헬싱키 선언에 따라 수행 하였다. 인간의 공막 표본은 안과학과의 안구 은행, 쾰른 대학, 독일에서 (최대 사후 시간 24 시간) 세계 기증자의 눈에서 얻었다. 1. 실험 준비 <ol><li> 96 % 에탄올을 준비하고 다른 튜브에 완충 식염수 (PBS)를 인산염. PBS 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)를 포함 권장 희석에 차 항체를 준비하고 얼음에 모든 솔루션을 유지. 샘플 당 100 μl를 준비합니다. </li><li> 모든 악기를 청소하고 날카로운 메스를 사용합니다. 같은 메스로 절단 반복 한 후, 메스를 변경합니다. </li><li> 1-2 콜리 브리 포셉, 바로 마이크로 해부 가위, A # 10 메스를 얻안과 메스 마이크로 깃털, 4 26 G 바늘이나. </li><li> 폴리스티렌 플레이트 주위에 알루미늄 호일을 감싸거나 조직을 부착하는 코르크 판을 사용합니다. 양안 스테레오 현미경 아래에서 작업 할 수 있습니다. 필요한 경우 층류 아래 멸균 작업 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 공막 준비 <ol><li> 부드럽게 전구를 보유하고 공막 부분에 천공 공술 (Trepanation)를 수행 한 후 두개골을 잘라내는 톱을 돌립니다. 똑같이 라운드 컷을 수행하기 위해 표면에 신중하고 균일하게 책략가를 돌립니다. 15.5 mm 크기의 두개골을 잘라내는 톱을 사용합니다. 곡선 가위로 남아있는 첨부 파일을 잘라. 각막 공막 공술 (Trepanation)를 제거합니다. 이는 전방 개방 전구가 발생합니다. <ol><li> 위쪽으로 열려있는 부분 면봉에 공막을 넣습니다. 공막에서 두 층 (망막 포도막)를 해내 콜리 브리 집게를 사용하여 망막 포도막를 제거합니다. 내부 공막에 색소 포도막을 두지 마십시오. 유두에서 망막 포도막을 제거하기 위해 곡선 가위를 사용합니다. REM 수면을 제거aining 결막, 외안근, 그리고 피상적 인 공막에서 장부의 캡슐. </li></ol></li><li> 스트레이트 형 가위와 콜리 브리 집게를 사용하여 필요한 크기의 공막 샘플을 제거합니다. 약 2cm 서로 다른 위치에서 2 크기의 공막 샘플을 가져 가라. 때문에 작은 크기, 부드럽게 공막을 보유하고 스트레이트 형 가위를 사용하여 사각형으로 필요한 크기를 잘라. 각막 공막 공술 (Trepanation)은 공막 샘플의 전방 여백을 정의합니다. <ol><li> 반복 잡고 된 조직이 공 초점 현미경 분석에 적합하지 않은 곳은 집게로 잡는하지 마십시오. 및 사용 된 항체의 양 (도 1과 비교 예 전방 대 후방) 실험 종류에 따라 샘플의 필요한 수를 준비한다. </li></ol></li><li> 나중에 사용하기 위해 1.5 ml의 튜브 샘플을 넣습니다. 15 분 동안 1.5 ml의 96 % 에탄올에 샘플을 수정 한 다음 5 분 동안 그들에게 3 회 씻어진탕에 1.5 ml의 PBS있다. 냉동 조직 작업하는 경우, 스냅 동결하기 전에이 단계를 수행합니다. </li><li> 신선한 조직을 사용합니다. 이 불가능하다 그러나, 스냅 액체 질소의 공막을 동결하고 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 보관하십시오. 냉동 조직, 사용하기 전에 해동 작업을하는 경우. 반복 해동과 냉동 사이클을 피하십시오. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 1.5 ml의 5 % BSA를 함유하는 PBS에서 각 샘플을 보관. 이 단계는 적층에 도움이되는 샘플의 팽창을 유도하고 또한 불특정 바인딩을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 샘플이 팽창 한 후, 적층의 공막 사각형을 준비합니다. 예를 들면 양안 스테레오 현미경 현미경 아래에서 작업 할 수 있습니다. 알루미늄 호일 또는 26 G 바늘을 사용하여 코르크 판에 싸여 폴리스티렌 막에 후방 공막 샘플을 부착합니다. </li><li> 그들은 현미경 아래의 시야를 방해하지 않도록 바늘의 에지를 구부리고. </li><li> 전체 두께 공막 SAMP를 적층레. <ol><li> 첫째, 콜리 브리 집게를 사용하여 전방 공막 가장자리를 잡으십시오. 조심스럽게 # 10 메스, 안과 용 메스 마이크로 깃털 또는 주걱 블레이드를 사용하여 표면 공막 얇게 잘랐다. 수평으로 메스를 잡고 기본 층에서 씬 가능한 표면층을 잘라. </li><li> 공막 광장에서 얇은 공막 층을 해부하다. 표준 수술 기법이 섬유주 절제술 동안 플랩을 준비하고 30 ~ 80 μm의 두께 층 (그림 2 비교)가 발생한다이 방법은 유사합니다. </li></ol></li><li> 예 50 ㎕의 PBS에 피펫을 사용하여 조직을 PBS 소량 첨가함으로써 공막의 건조를 방지한다. </li><li> 방수 색상 예와 레이어 (표면과 깊은) (통근 및 인턴으로) 96 웰 플레이트에 PBS 100 ㎕로 컷 레이어를 넣고 방향을 모두 레이블을 붙입니다. </li><li> 조직이 완전히 적층 될 때까지 반복 2.7-2.9 단계를 반복합니다. &lt;/ 리&gt; </ol> 3. 면역을 수행 <ol><li> 권장 희석에 필요한 일차 항체의 100 μl를 추가합니다. 여기에, 예를 들어 사용 CD (31) (단클론 마우스 항 인간)과 LYVE1 항체 (토끼 항 인간), (1)의 희석에 둘 (2 % BSA를 포함) PBS 100과 밤새 4 ° C에서 품어. 96 웰 플레이트에서 매체를 변경하려면 우물의 벽에 피펫을 누른 상태에서 유체를 제거합니다. </li><li> 다음 날, 진탕 기에서 200 ~ 300 ㎕의 PBS로 5 분간 시료를 3 회 씻는다. 해당 이차 항체의 100 μl를 추가; 여기 된 염소 항 마우스 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 및 염소 항 토끼 시아닌 염료 3 (Cy3에)를 사용하여 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 샘플을 배양한다. 이차 항체 희석 1 : 300를 PBS 2 % 염소 혈청을 함유한다. </li><li> 셰이 커에 200 ~ 300 ㎕의 PBS에 5 분 동안 다시 3 회를 샘플을 씻어. </li><li> 핵 염색을 수행, 예를 들어, </&gt; 그들. 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) (희석 1 : 2000, 각 100 ㎕를 웰, 실온에서 10 분 동안 배양한다)은 다음 진탕 200-300 μL의 PBS로 다시 2 회 반복한다. </li><li> , 현미경 슬라이드에 샘플을 전송 삽입을 형광등 설치 매체의 1 ~ 2 방울, 커버 슬립을 추가, 투명 광택과 가장자리를 커버하여 밀봉, 저장 4 ° C에서 나중에 사용하기 위해 직접 공 초점과 슬라이드를 검토 현미경. </li><li> 샘플을 분석하기 위해 공 초점 현미경 (또는 동급)를 사용합니다. 원하는 배율, 예를 들어 10-40X 배율을 사용합니다. </li><li> 샘플의 두께를 확인하기 위해 공 초점 현미경 Z-스택을 사용하여 측정한다. 두께는 적도에 그리고 후방 (도입과 비교)로 상이 가능 공막 부분의 양은 공막의 위치에 의존한다. </li></ol>

<ol><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+%28LYVE1%29-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li>
<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li>
<li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li>
<li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis%3A+what+can+we+learn+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li>
<li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact%2C+functional+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li>
<li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+chamber-associated+immune+deviation%2C+ocular+immune+privilege%2C+and+orthotopic+corneal+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li>
<li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li>
<li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li>
<li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+content+of+the+scleral+spur%2C+trabecular+mesh%2C+and+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li>
<li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+CS+%22The+sclera%22">The sclera</a>. , Springer. (2012).</li>
<li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Blutkreislauf+des+Auges%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225(1943).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li>
<li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm%27s+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li>
<li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li>
<li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li>
<li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Ophthalmol+Soc+U+K%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li>
<li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
</ol>

저자는 재무 공개를 선언하지 않습니다. 이 기사의 내용은 전적으로 저자의 책임입니다.

인간 공막을 적층하여이 조직에 공 초점 현미경 검사를 수행하는 방법이다. 이 과정에서 중요한 단계는 조직을 부착에 대한 에탄올의 사용 대신 포르말린이다. 고정 에탄올 대신 포르말린을 사용하는 경우 우리의 경험에서 더 나은 결과를 얻을 수있다. 블런트 메스는 절차를 악화 피해야한다. 마찬가지로, 공막의 고갈은이 절차를 복잡하게하고, 화상의 품질을 감소시키기 때문에 피해야한다. 면역 조직 화학적 염색과 관련하여, 여기에 적용되는 이외의 항체를 사용할 수있다. 일반적으로 콜라겐보다 자동 형광 및 녹색 채널의 배경은, 푸른, 따라서 빨간색과 원적외선 채널 덜 배경으로 더 나은 결과를 보여를 보여줍니다. 그러나, 기술의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그것은 microsc 하에서 수행되는 미세 수술 절차대로 공막을 적층하는 것은, 많은 연습이 필요빈 터. 이 방법은 수동으로 수행되기 때문에, 단일 적층 슬라이스 크기가 정확히 동일하지...

공막은 조밀 한 결합 조직으로 구성되어 눈을 덮고있는 단단한 외부 층이다. 이것은 인공 구조물을 보호하기 위해 안압을 유지하도록 돕는다. 따라서, 공막은 명확한 비전을 위해 필수적이다. 그것은 림프 혈관 1,2없는 상태이며, 따라서 그것과 림프없는 내 눈 3-7 사이의 외부 림프없는 경계를 형성한다. 또한하여 힘줄과 해부학 적 유사성을 공유하고, 안구 근육 첨부 파일 사이트를 제공합니다. 공막은 주로 I 콜라겐 유형의 밀도가 번들로 구성되어 있으며 콜라겐 유형 III, IV, V, VI, VIII 8,9과 엘라스틴 10, 11의 작은 숫자를 가지고 있기 때문에,이 조직은 면역 조직 화학 염색을 위해 사용하기 쉬운 일이 아니다. (1) 표면 혈관 episclera, 결막 및 장부의 캡슐 아래에 발견하고 측면과 일을 향해 : 해부학, 공막은 세 가지 주요 계층으로 분리 될 수있다궤도 대향 눈 E의 뒷면; (2) 기질 공막은 공막의 주요부; 및 (3) 바로 위에 위치 포도막 얇은 착색 층 라미 fusca를. 공막에 대한 우리의 해부학 적 지식은 20 세기의 전반부에서 주로 유래한다. 당시 연구자들은 주로 인도 잉크 주입 (12)를 사용하여 혈관이 13 ~ 15 주조에 의해 혈관의 해부학을 공부했다. 나중에, 그 혈관 16-19 연구에서 조사되었다. 그 이후로, 이전 기술이 향상되었으며 새로운 우리가 이전 해부학 적 지식을 보완 할 수있는 개발되었다. 우리는 림프계 혈관 내피 히알루 특정 수용체 -1 (LYVE1) 20 21 podoplanin 같은 신뢰성 림프 마커 가지고 이후 예를 들어, 단지 약 십왔다. 공 초점 현미경은 다른 TI의 해부학 적 특징을 연구에 대한 새로운 가능성을 제공합니다눈의 ssues. 여러 얼룩 세포의 분화 마커 나 혈관 등의 해부학 적 구조에 관하여 셀의 위치 파악에 사용하는 것은 허용한다. 샘플이 더 큰 크기이며 때 특정 세포 유형의 검색에서 우리가 샘플을 통해 검색 할 수 있습니다 때 개요를 제공합니다. Z 스택 기술, 공 초점 현미경은 100-200 μm의 최대 샘플을 사용할 수있다. 공막은 근육 삽입 뒤에 0.3 mm와 극부 (11)에서 1mm 사이의 두께가 다르다. 두께와 불투명 모두으로 인해 공막은 기존의 방법을 사용하여 공 초점 현미경에 적합하지 않습니다. 이 문제를 해결하려면, 공막 조직은 공 초점 현미경과의 분석을 할 수 있도록 적층 하였다. 이 기술은 인간 공막 모두 생리적 및 병리학 적 상황에서의 더 나은 이해를 얻는 데 유용하다.

<table><tbody><tr><td>96% 에탄올</td><td>Merck Chemicals, 다름슈타트, 독일</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>양안 스테레오 현미경&nbsp;</td><td>Motic, 홍콩, 중국</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26G 바늘&nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgium</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 메스&nbsp;</td><td>깃털, pfm medical, 오사카, 일본</td><td>2E + 08</td><td></td></tr><tr><td>안과 메스 마이크로 깃털&nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 항체 (monoclonal mouse anti human)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 항체&nbsp; (다클론 토끼 안티 휴먼)</td><td>Zytomed, 독일</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 FITC 항체</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Cy3 항체</td><td>Dianova, 독일</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청 정상</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscope 슬라이드&nbsp;</td><td>엥겔브레히트, 에덤&uuml; nde, 독일</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO 형광 장착 매체&nbsp;</td><td>DAKO, 미국</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, 예나, 독일</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 공막의 공 초점 현미경을 수행하기 위해 코팅 기술을 사용하여

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

공막 커버와 눈을 보호하는 조밀 한 결합 조직이다. 그것은 주로 조밀 한 콜라겐 번들 (유형 I, III, IV, V, VI와 VII)로 구성되어있다. 그것의 형광도, 불투명, 두께에, 그것은 공 초점 현미경에 적합한 발견되지 않았습니다. 항원 검색을 위해 조직을 예열 특히, 면역을 위해 파라핀 포르말린 고정 공막을 사용하는 기술적 과제를 갖고 여기에 제시된 하나의 대체 방법. 공막 세포와 혈관을 모두 상대적으로 열악하기 때문에, 큰 조직 샘플의 사용을 보이는 세포를 방지하고, 선박 등의 해부학 적 부위에 관련된 자신의 위치 파악을 이해하는 데 도움이 모색되었다. 공 초점 현미경 큰 조직 샘플의 분석을 허용하기 위해, 적층 기술은 공막의 얇은 층을 생성하고자 하였다. CD31 혈관 및 림프관 내피 hyalu 결과의 분석에 따라로난 수용체 1 (LYVE1) 과학 시험에 대한 승인을 얻었다있는 양성 세포는,이 방법의 장점과 제한 사항이 설명되어 있습니다.

여기에서 수행되는 대표적인 실험에서, 특정 코팅 기법의 사용으로부터 유도 명백한 이점이있다. 첫 번째 실험은 세 개의 대표 사진 (도 3)의 상공 막 혈관 총의 다양한 네트워크를 도시한다. 선박은 CD31 양성이다. 두 번째 실험은 episclera와 CD31 양성 혈관과의 관계의 특정 LYVE1 + 세포, 면역 세포를 보여줍니다. 여기서 Z 스택 기술은 조직을 통해 스캔 혈관 면역 세포 (도 4)의 3 차원의 관계를 이해하는 10X 배율로 사용 하였다. 공막뿐만 아니라 첨부 된 외안근은 혈관 또는 면역 세포의 존재에 대해 분석 할 수있다.도 5 도표LYVE1 ...

인간 공막 조직은 주로 콜라겐입니다. 따라서 면역조직화학에 쉽게 사용할 수 없습니다. 공막 조직의 컨포칼 현미경을 위한 면역조직화학을 수행한다는 목표를 달성하기 위해 라미네이팅 기법을 사용했습니다.


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

본 방법론의 전반적인 목표는 인간 공막의 공초점 현미경 검사를 수행하는 것입니다. 이 방법은 공막의 건강한 상태 및 병적 상태에서의 면역 세포 분포와 혈관 상태와 같이 안과 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 조밀한 결합 조직의 공초점 이미징이 가능하다는 것입니다. 본 실험 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Stefan Kremers가 진행하겠습니다. 먼저, 개별 튜브에 96% Ethanol과 PBS를 준비하십시오.그런 다음 2% BSA가 포함된 PBS의 권장 희석 배율로 샘플당 100 µL의 1차 항체를 준비하고, 모든 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 한두 개의 Colibri 핀셋, 직선형 미세 해부 가위, 곡선형 가위, 10번 메스 또는 안과용 메스 마이크로 페더, 26 gauge 바늘 4개 및 면봉을 포함한 깨끗한 기구들을 준비하십시오. 폴리스티렌 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸거나 조직을 고정할 코르크 플레이트를 준비하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 전면이 개방된 구(bulb)를 제작한 후, 개방된 부분이 위를 향하도록 Sclera를 면봉 위에 놓습니다. 그런 다음 colibri 포셉을 사용하여 공막 내측에서 망막과 색소성 포도막 층을 공막에 해당 층들이 남지 않을 때까지 제거합니다. 필요한 경우 곡선 가위를 사용하여 유두에서 망막과 포도막을 제거합니다.그런 다음 표층 공막에서 남은 결막, 외안근 및 테논낭을 제거합니다. 이제 콜리브리 핀셋으로 조직을 살며시 잡고, 직선 가위로 조직의 여러 위치에서 약 2제곱센티미터 크기의 공막 샘플을 절단합니다. 이때 핀셋으로 반복해서 잡으면 해당 부위를 공초점 현미경 관찰에 사용할 수 없게 되므로 주의하십시오. 샘플을 1.5 milliliter 튜브에 넣고 96% 에탄올 1.5 milliliters를 첨가한 후, 조직을 고정시키기 위해 15분 동안 배양합니다.그 다음 에탄올을 제거한 후, 1.5 mL의 PBS를 사용하여 시료를 흔들어주며 5분씩 3회 세척합니다. 다음으로, 시료를 5% BSA가 포함된 1.5 mL의 PBS로 옮기고 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 이는 시료의 팽윤을 유도하여 라미네이팅을 돕고 비특이적 결합을 방지하기 위함입니다. 시료가 팽윤되면, 실체 현미경 하에서 끝부분을 구부린 26G 바늘을 사용하여 후안구 공막 시료를 호일로 감싼 폴리스티렌 막 또는 코르크 판에 고정합니다.그런 다음 전층 샘플을 층판화하기 위해 colibri 포셉을 사용하여 공막 조직의 전방 가장자리를 수평으로 잡습니다. 10번 메스를 사용하여 표층 공막을 하층으로부터 가능한 한 얇게 조심스럽게 잘라냅니다. 조직의 건조를 방지하기 위해 각 층 위에 PBS 50 µL를 피펫으로 분주합니다.층을 절단한 후, 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 µL의 PBS와 함께 넣고, 방수 마커를 사용하여 방향과 층을 표시합니다. 조직이 완전히 층분리될 때까지 층 분리 및 96-웰 플레이트로의 전이 과정을 반복합니다. 면역조직화학 염색을 수행하려면, 피펫 끝을 각 웰의 벽면에 밀착시킨 채 액체를 흡입하여 96-웰 플레이트에서 배지를 제거합니다.그런 다음 2% BSA가 포함된 PBS에 1:100으로 희석한 1차 항체 100 µL를 해당 웰에 첨가하고, 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 200~300 µL의 PBS를 사용하여 쉐이커에서 5분씩 3회 샘플을 세척합니다. 필요한 경우, 다른 1차 항체를 사용하여 4 °C에서 다시 하룻밤 동안 배양합니다.그 다음, 2% 염소 혈청이 포함된 PBS에 1:300으로 희석한 해당 2차 항체 100 µL를 첨가하고, 실온의 암소에서 1~2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 200~300 µL의 PBS를 사용하여 셰이커 위에서 샘플을 다시 3회, 각 5분씩 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 1:2000으로 희석한 DAPI 100 µL를 첨가하고 실온의 암소에서 배양합니다.200에서 300 µL의 PBS를 사용하여 샘플을 두 번 세척합니다. 입체 현미경 하에서 샘플을 현미경 슬라이드로 옮겨 샘플이 슬라이드에 평평하게 놓였는지 확인한 후, 형광 봉입제를 1~2방울 첨가합니다. 그 후 커버 글라스를 덮고 투명 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉합니다.나중에 사용하기 위해 4°C의 암소에 보관하거나 공초점 현미경으로 직접 관찰합니다. 공막의 위치에 따라 적도 부위와 후방 부위의 두께가 다르므로, 샘플의 두께를 확인하기 위해 z-stack 영상을 촬영합니다. 이 이미지들은 전방 및 후방 상공막에서 유래한 층상 구조의 인간 공막 내 혈관망의 다양한 네트워크를 보여줍니다.혈관은 녹색으로 표시된 바와 같이 CD31 양성 반응을 보입니다. 이 그림에서는 공막 외막의 LYVE1 양성 면역 세포와 CD31 양성 혈관 간의 관계를 보여줍니다. 혈관과 면역 세포의 3차원적 관계를 조사하기 위해 10배 배율로 z-stack 시리즈를 촬영하였습니다.여기서 보는 바와 같이, 공막 내에 둘러싸인 외안근은 각각 CD31 및 LYVE1 마커를 사용하여 혈관 또는 면역 세포의 존재 여부를 분석할 수 있습니다. 라미네이팅 기술을 숙달하면 적절하게 수행할 경우 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 조직이 건조해지지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.인체 조직을 다루는 작업은 잠재적으로 감염 위험이 있으므로, 항상 사전에 미생물 및 바이러스 진단과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜의 둘째로 고조파 생성 이미징 및 차동 주사를 사용 하 여 토끼 sclera cross-linking 화학 평가 기법을 설명 합니다.

치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호

이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

프로토콜의 목표는 레이저 스캐닝 현미경 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 임 플 란 트에 의해 thymocytes의 경도 intravital 실시간 추적을 보여주는 것입니다. 각 막의 투명도는 이식의 vascularization 지속적으로 녹음 시 조 셀 모집 및 성숙한 T 세포 출구 수 있습니다.

레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.

Whole Mount Imaging을 통해 Peripheral Lens 구조, 세포 형태 및 조직을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

학습하세요 인간 공막 조직의 공 초점 현미경법으로 면역 세포 분포와 혈관 상태를 분석하는 방법을. 코팅 기술을 활용하여 조밀한 결합 조직의 상세 영상을 얻고 안과 질환 연구에 활용하세요.

인간 공막의 공 초점 현미경을 수행하기 위해 코팅 기술을 사용하여

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