May 6th, 2016
인간 공막 조직은 주로 콜라겐입니다. 따라서 면역조직화학에 쉽게 사용할 수 없습니다. 공막 조직의 컨포칼 현미경을 위한 면역조직화학을 수행한다는 목표를 달성하기 위해 라미네이팅 기법을 사용했습니다.
이 방법론의 전반적인 목표는 인간 공막의 컨포칼 현미경 검사를 수행하는 것입니다. 이 방법은 안과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 건강한 사람의 면역 세포 분포 및 혈관 상태, 공막의 병리학적 상태와 같은.
이 기술의 주요 장점은 조밀한 결합 조직의 컨포칼 이미징이 가능하다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 대학원생인 Stefan Kremers입니다. 먼저 개별 튜브에 96% 에탄올과 PBS를 준비합니다.
그런 다음 2% BSA를 함유한 PBS의 권장 희석액으로 1차 항체 샘플당 100마이크로리터를 준비하고 모든 용액을 얼음 위에 보관합니다. 1-2개의 콜리브리 집게, 직선 미세 해부 가위, 구부러진 가위, 숫자 10 메스 또는 안과용 메스 마이크로 깃털, 4개의 26 게이지 바늘 및 면봉을 포함한 깨끗한 도구를 준비합니다. 폴리스티렌 플레이트에 알루미늄 호일을 감거나 티슈를 부착할 코르크 플레이트를 준비합니다.
텍스트 프로토콜에 따라 앞쪽으로 열린 전구를 만든 후 열린 부분이 위를 향하도록 면봉에 공막을 놓습니다. 그런 다음 결장 집게를 사용하여 공막에 이러한 층이 없어질 때까지 공막 내부에서 색소가 있는 포도막층을 제거합니다. 그런 다음 필요한 경우 구부러진 가위를 사용하여 유두에서 망막과 포도막을 제거합니다.
그런 다음 표재성 공막에서 남아 있는 결막, 배란 외 근육 및 장부 캡슐을 제거합니다. 이제 대장 겸자를 사용하여 조직을 부드럽게 잡고 곧은 가위로 조직의 다른 위치에서 약 2제곱센티미터 크기의 공막 샘플을 자르고 컨포칼 현미경 검사에 적합하지 않은 영역을 집게로 반복적으로 잡는 것을 방지합니다. 샘플을 1.5ml 튜브에 넣고 1.5ml의 96% 에탄올을 첨가한 다음 조직을 고정하기 위해 15분 동안 배양합니다.
그런 다음 에탄올을 제거한 후 1.5ml의 PBS를 사용하여 흔들면서 5분씩 샘플을 3회 세척합니다. 다음으로, BSA 5%가 함유된 1.5ml의 PBS로 샘플을 옮기고 실온에서 2시간 동안 배양하면 샘플의 팽창을 유도하여 라미네이팅을 돕고 비특이적 결합을 방지합니다. 샘플이 부풀어 오르면 실체 양안 현미경으로 가장자리가 구부러진 26 게이지 바늘을 사용하여 후방 공막 샘플을 호일로 감싼 폴리스티렌 막 또는 코르크 플레이트에 부착합니다.
그런 다음 전체 두께의 샘플을 라미네이트하려면 colibri 겸자를 사용하여 공막 조직의 앞쪽 가장자리를 수평으로 잡습니다. 숫자 10 메스를 사용하여 밑에있는 층에서 표재성 공막의 가능한 한 얇은 층을 조심스럽게 자릅니다. 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 피펫 50 마이크로 리터의 PBS를 층에 펌핑합니다.
그런 다음 층을 절단한 후 100웰 플레이트에 있는 96마이크로리터의 PBS에 놓고 방수 마커를 사용하여 방향과 층을 모두 표시합니다. 조직이 완전히 적층될 때까지 층을 계속 분리하고 96웰 플레이트로 이동합니다. 면역조직화학을 수행하려면 각 웰의 벽에 피펫을 대고 유체를 흡인하여 96웰 플레이트에서 매체를 제거합니다.
그런 다음 PBS에서 1-100으로 희석한 1차 항체 100마이크로리터를 2% BSA로 적절한 웰에 추가하고 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 배양합니다. 다음날 200-300 마이크로 리터의 PBS를 사용하여 셰이커에서 샘플을 각각 5 분 동안 3 번 세척합니다. 필요한 경우 다른 1차 항체를 사용하고 섭씨 4도에서 밤새 다시 배양합니다.
그런 다음 해당 2차 항체 100마이크로리터를 첨가하고 PBS에서 1-300을 2%의 염소 혈청으로 희석한 후 실온에서 1-2시간 동안 암흑 속에서 배양합니다. 배양 후 200-300 마이크로 리터의 PBS를 사용하여 샘플을 셰이커에서 각각 5 분씩 3 회 다시 헹굽니다. 그런 다음 각 웰에 1에서 2000 희석된 DAPI 100마이크로리터를 추가하고 실온에서 암흑 속에서 배양합니다.
샘플을 두 번 세척하기 위해 200-300 마이크로 리터의 PBS를 사용하기 전에. 실체 쌍안 현미경 아래의 현미경 슬라이드로 샘플을 옮겨 샘플이 슬라이드에 평평하게 놓여 있는지 확인하고 형광 장착 매체를 1-2방울 추가합니다. 그런 다음 그 위에 커버 슬립을 놓고 투명 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉합니다.
나중에 사용할 수 있도록 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하거나 컨포칼 현미경으로 직접 검사할 수 있습니다. 샘플의 두께를 확인하려면 공막 위치에 따라 두께가 적도 및 후방으로 다르므로 z-스택을 사용합니다. 이 이미지는 전방 및 후방 상피경(anterior and posterior episclera)에서 파생된 적층 인간 공막(laminated human sclera)에서 혈관 신경총(plexis)의 다양한 네트워크를 보여줍니다.
혈관은 녹색으로 표시된 것처럼 CD31에 대해 양성입니다. 이 그림에서는 상피공막의 LYVE1 양성 면역 세포와 CD31 양성 혈관과의 관계가 설명되어 있습니다. z-stack 시리즈는 혈관과 면역 세포의 3차원 관계를 조사하기 위해 10배 배율로 촬영되었습니다.
여기에서 볼 수 있듯이 공막 내에 포함된 안구 외 근육은 각각 마커 CD31 및 LYVE1을 사용하여 혈관 또는 면역 세포의 존재 여부를 분석할 수도 있습니다. 일단 숙달되면 라미네이팅 기술이 제대로 수행되면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 조직이 건조해지는 것을 방지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
인체 조직을 대상으로 하는 작업은 잠재적으로 감염될 수 있으므로 항상 미생물 및 바이러스 진단과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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이 기사는 주로 콜라겐으로 구성되어 있으며 면역조직화학 분석에 어려움을 초래하는 인간 공막 조직에 대한 공초점 현미경 분석 방법론을 제시합니다. 이 기술은 공막의 건강 및 병리학적 상태에서 면역 세포 분포 및 혈관 상태를 조사하는 것을 목적으로 합니다.
Studying immune cell distribution and vascular status in dense connective tissues like the human sclera presents challenges for target validation in ophthalmic drug development. This laminating technique enables confocal microscopy of otherwise opaque tissues, supporting mechanistic de-risking by providing quantitative spatial data on biomarker expression. The method enhances predictive confidence in preclinical models by allowing analysis of larger tissue samples to reduce sampling bias in target engagement studies.
The method integrates into discovery workflows by enabling detailed phenotypic screening of immune and vascular targets in dense connective tissues prior to lead identification.