탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합
May 17th, 2016
MyoD는 완전히 분화된 많은 비근육 세포주의 근육 전달화를 유도하는 강력한 능력을 가진 근육 전사 인자입니다. 이 전이분화(transdifferentiation)에 관여하는 후성유전학적 메커니즘은 대체로 알려져 있지 않다. 여기에서는 이중 친화성 정제 방법과 질량 분석법을 설명하여 MyoD 파트너를 철저하게 특성화합니다.
이 실험의 전반적인 목표는 MyoD 단백질 파트너를 철저하게 특성화하는 것입니다. 이 방법은 주요 근육 전사 인자인 MyoD에 의한 골격근 색조 변형의 분자 조절과 같은 골격근 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나의 특정 핵 격실에 국한된 선택적으로 낮은 존재량을 가진 MyoD 파트너를 풀 수 있다는 것입니다.
이 방법은 근육 분화 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 조직, 특히 핵 분화와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 조교인 Dr. Lauriane Fritsch가 맡을 것입니다. 이 프로토콜에서 MyoD 복합체는 FLAG glutenin 태그로 MyoD를 안정적으로 발현하는 HeLa S3 세포에서 정제됩니다.
빈 벡터로 형질도입된 HeLa S3 세포가 대조군으로 사용됩니다. 두 세포주 모두 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 이전에 섭씨 영하 80도에서 성장, 수집 및 저장되었습니다. 세포 펠릿을 섭씨 37도의 수조에서 빠르게 해동합니다.
모든 버퍼와 균질기는 사전 냉각되어야 하며 이 전체 절차는 냉장실에서 수행해야 합니다. 일반적으로 각 실험 지점에는 20g의 세포가 사용되지만 이 시연의 목적에서는 10g 또는 약 10mL의 세포만 처리됩니다. 처음에 5mL의 완충액을 사용하여 10mL의 저장성 완충액 A에 세포를 재현탁합니다.
그런 다음 2.5mL를 추가한 다음 2.5mL를 더 추가합니다. 최대 세포를 얻기 위해 새 버퍼로 피펫을 잘 씻으십시오. 세포 현탁액 20mL를 꼭 끼워진 유봉을 사용하여 사전 냉각된 균질기로 옮깁니다.
20번의 스트로크로 세포를 균질화합니다. 세포 현탁액을 50ml 튜브로 옮깁니다. 세포의 최대 회복을 위해 3.5mL의 자당 완충액으로 균질기를 세척하십시오.
이 현탁액을 50mL 튜브로 빠르게 옮겨 핵을 보존하고 누출을 제한합니다. 30마이크로리터의 세포 현탁액을 30마이크로리터의 4% Trypan Blue로 염색하고 현미경으로 분석하여 용해 효율을 확인합니다. 용해가 성공하면 모든 핵이 파란색이어야 합니다.
필요한 경우 균질화를 반복합니다. 10, 000 x g 및 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리기를 사용하여 핵을 펠릿화합니다. 상층액을 세포질 분획으로 저장합니다.
핵 펠릿을 4mL의 자당 완충액에 재현탁하여 핵염 추출물 분획을 준비하기 위한 절차를 시작합니다. 그런 다음 4mL의 고염 완충액을 한 방울씩 첨가하면서 소용돌이에서 철저히 혼합하여 최종 농도 300mM 염화나트륨을 얻습니다. 5분마다 섞어 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
다음으로, 8mL의 자당 완충액을 첨가하여 염화나트륨 농도를 150mM로 줄입니다. 13, 000 x g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기. 소금 추출 가능한 부분인 상등액을 모아 얼음에 남겨둡니다.
염색질 결합 분획을 준비하려면 펠릿을 3.5mL의 수크로오스 완충액에 꼼꼼하게 재현탁합니다. 염화칼슘을 최종 농도 1mM까지 첨가하고 혼합합니다. 염화칼슘은 나중에 추가될 소구균 뉴클레아제를 활성화합니다.
서스펜션을 섭씨 37도에서 1분 동안 예열합니다. 마이크로리터당 5개 단위의 35마이크로리터를 추가하면 마이크로리터당 25 10,000번째 단위의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. 섭씨 37도에서 정확히 12분 동안 배양합니다.
4분마다 섞습니다. 12분 후 즉시 얼음 위에 반응을 놓습니다. 미세구균 뉴클레아제 활성을 중지하려면 56마이크로리터의 5몰 EDTA pH 8.0을 4mM 및 와류의 최종 농도에 추가합니다.
얼음 위에서 5분간 배양합니다. 높은 진폭으로 매번 1분 동안 5회 초음파 처리하여 초음파 처리 사이에 1분의 휴식을 허용합니다. 염 추출물과 뉴클레오솜 농축 분획을 모두 섭씨 4도에서 85, 000 x g에서 30분 동안 원심분리를 변경합니다.
상층액을 수집합니다. 소금 추출 가능한 부분은 약 13mL여야 합니다. 그리고 뉴클레아솜 농축 분획은 약 6mL여야 합니다.
MyoD 단백질 복합체는 이중 친화성 정제에 의해 정제됩니다. FLAG 기반 및 HA 기반 정제에 대한 절차가 유사하기 때문에 FLAG 기반 정제만 시연합니다. TEGN을 첨가한 후 적절한 부피의 FLAG 수지를 50mL 튜브로 옮깁니다.
각 실험 지점에는 상업용 50% 재고 사전 세척 FLAG 수지에서 300마이크로리터의 FLAG 수지가 필요합니다. 1, 000 x g에서 2분 동안 원심분리기. 상층액을 제거하고 차가운 TEGN을 첨가한 후 다시 원심분리합니다.
FLAG 수지를 차가운 TEGN으로 총 5회 세척합니다. 마지막 세척 후 FLAG 수지를 동일한 부피의 TEGN에 다시 현탁시킵니다. 각 실험 지점에 대해 300마이크로리터의 세척된 FLAG 수지와 해당 단백질 추출물을 혼합합니다.
뉴클레아솜 농축 분획에는 15mL 튜브를 사용하고 염 추출 가능한 분획에는 50mL 튜브를 사용합니다. 섭씨 4도에서 밤새 회전하는 바퀴에 튜브를 배양합니다. 다음 날, 모든 튜브를 섭씨 4도에서 1, 000 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
상등액을 모으고 정화 효율 테스트 결과가 나올 때까지 섭씨 4도를 유지합니다. 염 추출 가능한 샘플의 경우 FLAG 수지를 4mL의 TEGN에 재현탁하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 세 번 반복하며, 매번 동일한 15mL로 옮겨 비드 손실을 방지합니다.
섭씨 4도에서 1, 000 x g에서 2분 동안 원심분리기. 상층액을 제거한 후 FLAG 수지에 TEGN 13mL를 넣고 섭씨 4도에서 1, 000 x g에서 2분간 원심분리합니다. 이런 식으로 수지를 7번 씻습니다.
마지막 세척 후 1mL의 TEGN에 레진을 재현탁하고 1.5mL의 낮은 결합 튜브로 옮깁니다. 2분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. pH 7.8에서 4mg/mL의 FLAG 펩타이드 용액 100마이크로리터에 각 실험 지점의 수지를 재현탁하고 잘 혼합하고 100마이크로리터의 TEGN 완충액을 추가합니다.
결합된 단백질을 용리시키기 위해 최소 4시간 동안 섭씨 4도에서 배양합니다. 2분 동안 원심분리하고 수지와 상층액을 2mL 튜브에 넣은 빈 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 컬럼을 6, 000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
2mL 튜브에 남은 상등액을 수집합니다. 그런 다음 HA 기반 정제를 진행하기 전에 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 정제 효율을 테스트합니다. 여기에 표시된 것은 FLAG HA MyoD를 안정적으로 발현하는 HeLa S3 세포주의 핵염 추출물 또는 뉴클레아솜 농축 분획에서 이중 친화성 정제 MyoD 복합체의 대표적인 결과입니다.
은 염색은 모의 세포주에 없는 화살표로 표시된 FLAG HA MyoD를 식별했습니다. 이중 친화성 정제 MyoD 복합체를 글리세롤 구배에서 분획화했습니다. 항-FLAG 항체를 사용하여 분획을 서쪽으로 덧씌우면 두 개의 핵 하위 구획에서 MyoD 하위 복합체가 밝혀졌습니다.
특히, 염 추출 가능한 MyoD는 3개의 소복합체에 분포하는 반면 염색질 결합 MyoD는 주로 하나의 복합체에 속합니다. 핵염 추출물 및 뉴클레오솜 농축 분획물에서 분리된 MyoD 상호작용체의 질량 분석 분석을 통해 MyoD의 일련의 알려진 파트너와 새로운 파트너를 식별했습니다. 여기서 두 분획 모두에서 발견되거나 특히 분획 중 하나에 대해 발견되는 MyoD 인터랙터는 기능적 주석에 따라 그룹화됩니다.
질량 분석법에서 밝혀진 상호 작용체 중 일부는 MyoD 복합체의 웨스턴 블롯에 의해 확인되었습니다. 여기에는 전사 인자 CBF, SWI/SNF 서브유닛 BAF47 및 HP1 단백질이 포함됩니다. HeLa 세포는 근육 세포가 아니며 일반적으로 MyoD를 발현하지 않기 때문에 새로 확인된 상호작용 세포와 MyoD 및 Myoblast 간의 상호 작용을 확인해야 합니다.
증식 및 분화 마우스 근아세포로부터의 핵 총 추출물을 표시된 항체를 사용한 면역침전 및 서양 분석에 사용되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 반 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 근아세포에서 얻은 결과를 구체화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 상호 작용의 기능적 의미와 같은 추가 질문에 답하기 위해 근아세포와 같은 관련성 시스템에서 특정 파트너의 녹다운과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 발달 생물학적 후성유전학 분야의 연구자들이 대부분의 신체 시스템에서 5가지 전사 인자의 조절 네트워크를 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포 분획 후 질량 분석법과 결합된 탠덤 친화성 정제를 수행하여 전사 인자의 파트너를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 연구는 근육 생물학의 중요한 전사 인자인 MyoD 단백질 파트너의 특성화에 중점을 둡니다. 사용된 방법을 통해 특정 핵하 구획 내 저농도 MyoD 파트너를 식별할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 근육 생물학
배경
- MyoD는 근세포 분화에 중요합니다.
- MyoD의 후성 유전학적 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다.
- MyoD 상호작용을 이해하면 근육 분화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
- 이 연구는 MyoD 복합체를 위한 새로운 정제 방법을 사용합니다.
연구 목적
- MyoD 단백질 파트너를 철저하게 특성화합니다.
- 골격근 기능의 분자 조절을 탐구합니다.
- 발견 사항을 다른 조직 분화 맥락에 적용합니다.
사용된 방법
- 이중 친화성 정제 방법.
- 파트너 식별을 위한 질량 분석법.
- FLAG 태그가 있는 MyoD를 발현하는 HeLa S3 세포의 사용.
- MyoD 파트너의 핵하 국소화 분석.
주요 결과
- 저농도 MyoD 파트너의 식별.
- 근육 분화의 조절에 대한 통찰력.
- 다른 분화 연구에서의 잠재적 응용.
- Dr. Lauriane Fritsch에 의한 방법의 시연.
결론
- 이 방법은 MyoD 상호작용을 연구하기 위한 확고한 접근법을 제공합니다.
- 발견 사항은 근육 생물학과 다양한 조직에서의 분화 조절에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
- 미래 응용은 다양한 조직 유형으로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding the MyoD interactome provides mechanistic insight into skeletal muscle terminal differentiation, a process relevant to regenerative medicine and muscle disorder therapeutics. Identifying low-abundance nuclear partners through tandem affinity purification enables target de-risking in early discovery by clarifying transcriptional regulatory networks. This approach supports predictive confidence in targeting myogenic factors for therapeutic intervention in conditions such as muscular dystrophy and rhabdomyosarcoma.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of MyoD-centered transcriptional complexes to validate functional relevance in myogenic pathways.
- Operational Value: Facilitates detection of low-abundance, subnuclear-localized partners that may be missed by conventional co-immunoprecipitation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by mapping MyoD interactions with chromatin remodelers and transcription factors implicated in muscle differentiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a validated interactome dataset for assay development targeting MyoD-dependent transcriptional regulation.
- Operational Value: Establishes a reproducible purification workflow from heterologous systems compatible with mass spectrometry readouts.
- Scientific Value: Provides quantitative interaction data to support screening campaigns for modulators of MyoD complex assembly.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links MyoD interactors to epigenetic mechanisms regulating skeletal muscle genes, informing biomarker relevance in differentiation models.
- Operational Value: Enables functional validation in disease-relevant systems such as mouse myoblasts to confirm partner roles in myotube formation.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing salt-extractable versus chromatin-bound MyoD subcomplexes with distinct functional annotations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling systematic mapping of transcription factor interactomes prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of MyoD-mediated transcriptional regulation through comprehensive partner identification.
- Screening: Produces standardized, mass spectrometry-ready complexes for assessing compound effects on MyoD interaction networks.
- Analytics: Delivers fractionation and Western blot-validated data to compare MyoD subcomplex distribution across nuclear compartments.
- Translational Research: Connects interactome data to preclinical validation in myoblast differentiation models for functional confirmation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tandem affinity purification platform applicable to other nuclear transcription factors beyond MyoD.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing direct and indirect MyoD partners in physiologically relevant complexes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lysis, fractionation, and dual-tag purification steps performed under controlled conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in MyoD-driven transcriptional programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of myogenic targets based on interaction network centrality and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell fractionation, affinity purification, and mass spectrometry-based proteomics.
- Dependent on access to ultracentrifugation equipment for nucleosome-enriched fraction isolation.
- Necessitates cross-team standardization between proteomics and cell biology units for consistent MyoD complex recovery.
- Involves adaptation considerations when transferring from HeLa S3 to primary myoblast systems for functional validation.
- Limited by the efficiency of tandem affinity purification in capturing transient or low-stoichiometry interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Isolation of Nuclei
3:54
Preparation of HeLa-S3 Nuclear Salt-extractable and Chromatin-bound Fractions
7:05
Protein Complexes Purification
11:22
Results: MyoD Interactors Identified by Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry
13:37
Conclusion
