Name: 탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: 배우세요 이중 선호도 정화와 질량 분석을 사용하여 MyoD 단백질 상호 작용체를 식별하는 방법을. HeLa S3 세포에서 저발현 파트너를 규명하여 근육 분화 메커니즘을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

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Ait-Si-Ali 연구실의 연구는 Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon)의 지원을 받았습니다. 국립 암 연구소(INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS입니다. 파리 디드로 대학교(Université Paris Diderot)와 '나는 누구인가?' Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071은 AN#ANR R이 운영하는 "미래를 위한 투자" 프로그램을 통해 프랑스 정부의 자금 지원을 받았습니다. EB는 INCa 보조금의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

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제시된 방법은 전사 인자, MyoD의 파트너 철저한 식별을 허용한다. 그것은 MyoD 유도 분화, 즉 헬라-S3 세포에 강한 이종 시스템에서 MyoD 파트너를 한 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, 정의, 식별 MyoD 파트너는 보편적으로 표현된다. 이러한 일반 및 서열 - 특이 적 전사 요소, 염색질 변형 효소, RNA 프로세싱 단백질 키나제 (표 1 및 2)를 포함한다. 헬라-S3 세포 MyoD 유도 트랜스 분화에 내성이므로 MyoD 활성은 주로 억압하고 식별 파트너 MyoD 공동 리프레 될 가능성이 높다. 이것은 MyoD 전이 활성 능력을 저해 8 알려져 이드 단백질 (표 1 및 표 2,도 2)의 존재에 의해 강조된다. 중요한 것은, 이러한 억압 상태는 근육 아세포 증식의 MyoD 상태에 해당합니다. 사실, 우리는 CBFβ하는 MyoD와 ...

진핵 다세포 생물은 다른 기관 및 조직 구성된다. 각 기능 조직 각 분화 단계에서 결정되는 특정 유전자의 발현 패턴을 갖는다. 세포 분화 유전자 세트 세포 증식에​​ 관여하는 등 사람들의 침묵, 일반적으로, 특정 유전자의 활성화, 발현의 유지를 포함하고. 골격근 분화 또는 근육 생성, 즉 근육 아세포로 중배엽 간세포의 결정으로 시작 따라서 다단계 공정, 그 후 제 모노 - 핵 생성하고 다중 핵, myotubes에서 이러한 아세포의 말단 분화를 유도 . 따라서, 근육 아세포는 계속 증식 할 수있는 세포를, &quot;결정&quot;되어 있지만, 그들은 배아 개발하는 동안 또는 성인 근육 재생에 어느 골격 근육 세포에 전적으로 구별하실 수 있습니다 따라서 골격 근육 계통 위해 노력하고 있습니다. 골격근 단말의 처리가 다를entiation 그러한 E2F 대상 유전자 1과 증식 관련 유전자의 결정적인 사일런 리드 근원 세포 전구체 세포의 세포주기에서 영구 출구에서 시작하여 특정 유전자 프로그램 조율된다. 실제로 단말 분화 과정에서, 근육 모세포 증식 정지 골격근 특정 유전자의 발현 및 (2)에 myotubes 아세포의 융합 선행 중요한 단계이다. 이러한 프로그램은 골격근 손상 후 재생 공정 동안에 분화하는 성체 근육 줄기 세포라고도 위성 세포를 허용한다. 포유 동물의 근육 생성이 근육 조직의 기본 나선 루프 나선의 가족에 결정적으로 의존 (bHLH) 전사 자주 골격 근육의 결정 요인 또는 MRFs (근육 규제 요인) (3)의 가족이라 MyoD, Myf5, MRF4 및 오게 닌을, 요인. 그들 각각의 사양 및 DIF에 필수적인 역할을한다골격 근육 세포의 ferentiation과 특정 식 패턴 (4) 5-7 있습니다. Myf5 및 MyoD의 활성화는 근육 조직 계보에 세포를 커밋 결정적인 단계를 구성하고 오게 닌의 후속 표현은 MCK (근육 크레아틴 키나제) 등의 골격근 특정 유전자의 활성화와 근육 생성을 트리거합니다. 근육 조직 bHLH의 전사 인자는 이전에 침묵 궤적 8에서 근육 유전자의 활성화에 MEF2 가족의 구성원들과 협력한다. 또한 다양한 유전자 조절 영역 (8)에서 이른바 E-E 박스 결합 단백질로 알려진 유비쿼터스 bHLH 단백질, E12 및 E47,와 같은 이종 골격근 유전자 전사를 자극한다. 트위스트 이드 (분화 억제제) 및 기타 요인에 부정적인 8 바인딩 E 단백질에 대한 MyoD와 경쟁하여,이 과정을 조절한다. MyoD 근육 터미널 차별화 9 트리거에서 주요 플레이어로 간주됩니다 </s업&gt; 그것은 많은 완전 비 분화 된 근육 시스템 10-13의 근원 성 결정 / 분화 (트랜스 분화) 프로그램을 유도하는 능력을 가지고 있기 때문이다. 실제로, MyoD의 강제 표현은 서로 다른 세포 유형의 다른 태생 학적 기원 (12)로부터 유래도 사람들의 트랜스 분화를 유도한다. 예를 들어, MyoD 근육과 같은 세포로 간세포, 섬유 아 세포, 멜라닌 세포, neuroblasts 및 지방 세포로 변환 할 수 있습니다. MyoD의 트랜스 differentiative 작업은 원래의 유전 적 프로그램 (특히, 증식 유전자)의 침묵에 수반 비 근육 환경에서 근육 조직 유전 적 프로그램의 비정상적인 활성화 (특히 그 표적 유전자)를 포함한다. 근육 아세포 증식에 MyoD 표현하지만 그들의 발기인 14 ~ 16에 결합하는 경우에도 그 표적 유전자를 활성화 할 수 없습니다입니다. 따라서, MyoD가 지속적으로 미분화 된 근육 아세포에서 발현되는 대한 요구 사항은 매우 ELU 유지시브. MyoD 이전 염색질 리모델링을 활성화하는 14,17 효소의 로딩에 근육 아세포 증식에 억압 염색질 - 수정 효소의 채용으로 인해 그 표적 유전자를 억제 할 수있다. 예를 들어, 근육 아세포 증식에​​ MyoD은 히스톤 H3 라이신 9 H3K9 및 H3K27 KMTs 포함한 전사 공동 리프레 KAP-1, 히스톤 데 아세틸 라제 (HDACs) 및 억압 리신 methyltransferases (KMTs)와 연관되고, 적극적으로 표적 유전자의 발현을 억제한다 로컬 억압 크로 마틴 구조 14,17을 설정하여. 중요한 것은, 최근의 보고서는 MyoD 자체가 직접 H3K9 KMT G9a가 transactivating 활동 (16)의 억제 결과에 의해 메틸화 인 것으로 나타났다. MyoD 의한 비 근육 세포의 이러한 트랜스 분화에 관련된 후성 메커니즘은 대부분 알려져 있지 않다. 특히, 일부 세포주 MyoD 유도 트랜스 분화에 내성이다. 따라서, HeLa 세포에서 MyoD은 하나 또는 비활성심지어 인해 복잡한 SWI / SNF (18) 리모델링 염색질의 BAF60C 서브 유닛의 표현의 부족으로 리프레보다는 전사의 활성화로 작동 할 수 있습니다. 이 모델은 따라서 더 나은 MyoD 유도 유전자 억압의 메커니즘을 특성화하는 선택이 될 수 있습니다. 관련 파트너와 목표 궤적에서 억압 염색질 환경을 유도하기 때문에 터미널 차별화를 미세 조정하는 근육 아세포 증식에 MyoD 종속 억압 메커니즘을 밝히기 위해서 MyoD의 능력을 분석하는 것이 적합하다. 여기에서 우리는 질량 분석기 (MS)의 특성에 결합 탠덤 선호도 정화 (TAP-태그)를 사용하여 MyoD 파트너의 식별을위한 프로토콜을 설명합니다. 안정 플래그-HA-MyoD 발현-S3 헬라 세포의 사용은 분별 핵 추출물에서 MyoD 복합체를 정제하기에 충분한 재료를 얻을 수. 이종 시스템의 MyoD 파트너의 식별은 validati으로 이어졌습니다관련 시스템에.

<table><tbody><tr><td>세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer:&nbsp; Dounce 균질화기&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 및 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>스피너용 교반 장치</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>저결합 튜브</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>빈 스핀 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide 4-12%&nbsp; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x loading buffer&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x 환원제</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>은 염색 키트</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>원심 필터 유닛, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Protein G agarose beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G&nbsp; 수지</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Flag 수지 (anti-Flag M2-agarose 친화성 겔)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA 수지 (monoclonal Anti-HA agarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Flag free peptide (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Custom synthesis</td><td>50 mM에서 최대 4 mg/ml 재현탁 Tris-HCl, pH 7.8</td></tr><tr><td>HA 유리 펩타이드(YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>맞춤형 합성</td><td>50mM Tris-HCl, pH 7.8에서 최대 4mg/ml까지 재현탁</td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid 기반 단백질 분석 키트 : BCA 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>루미놀 기반 향상된 화학발광(ECL) HRP 기질</td><td>Life Technologies</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>전단 연어 정자 DNA (연어 고환에서 추출한 디옥시리보 핵산 나트륨 염)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>스페르민 테트라하이드로클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS 러닝 버퍼</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (고포도당)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>사전 예열&nbsp; at 37 &deg; 사용 전</td></tr><tr><td>C Trypsin-EDTA (0.05% 페놀 레드</td><td>Life technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Serum</td><td>GE healthcare life sciences&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>각 로트의 혈청은 먼저 세포에 대해 테스트해야 합니다.</td></tr><tr><td>페니실린과 스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>물(멸균 여과)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA from rat (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>면역침전 및 웨스턴 블로팅에 사용</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>세포 신호 기술</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>산타 크루즈</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG 마우스</td><td>산타 크루즈</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG 토끼</td><td>산타 크루즈</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-랫 -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-토끼 -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

탠덤 선호도 정화를 사용하여 myod 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

골격 근육 터미널 차별화는 근육 아세포에 만능 중배엽 전구 세포의 의지로 시작합니다. 이러한 세포는 여전히 증식 할 수있는 능력을 가지고 있거나 그들은 근섬유를 형성하도록 더 성숙하다 다핵 myotubes로 차별화 퓨즈있다. 골격근 단말 차별화 특히 근육 규제 요인 또는 MRFs의 멤버 (MyoD이 오게 닌은 Myf5 및 MRF4)는 또한 근육 조직 bHLH 전사 인자 계열이라는 다양한 전사 인자의 협조 작용에 의해 조율된다. 이러한 요인은 골격 근육 생성을 달성하기 위해 정교한 전사 조절 네트워크 내에서 염색질 리모델링 복합체와 협력. 이러한면에서, MyoD 근육 터미널 차별화를 트리거의 마스터 근육 조직 전사 인자로 간주됩니다. 이 개념은 골격근 세포에 비 - 근육 세포를 변환 MyoD의 능력에 의해 강화된다. 여기에서 우리는 MyoD를 식별하는 데 사용되는 방법을 설명골격근 단말 분화에 관련된 다른 요인을 해명하기 위해 철저하게 단백질 파트너. 장기 목표 골격근 유전자의 조절, 즉,., MyoD 타겟 관련된 후생 유전 학적 메카니즘을 이해하는 것이다. MyoD 파트너는 골격근 단말 분화 동안 관련된 파트너의 역할을 확인 하였다 질량 분석 (MS)의 특성에 결합 된 이종 시스템에서 직렬 선호도 그래피 (T​​AP 태그)를 이용하여 식별된다. 근육 재생에 선천성 중증, 근긴장 성 이영양증, 횡문근 육종 결함 : 근육 조직 요인, 또는 비정상적인 규제의 비정상적인 형태, 근육 질환의 수와 연관됩니다. 이와 같이, 근육 조직 인자가 질병의 치료를 향상시킬 수있는 질병 자체 회생기구 원인 메커니즘에 대하여 모두 근육 질환의 잠재적 치료 타겟의 풀을 제공한다. 따라서, 상세한 understan근육 조직 요인에 의해 제어되는 분자간 상호 작용과 유전 적 프로그램 땡 효율적인 치료의 합리적인 디자인을 위해 필수적이다.

MyoD 활성의 조절을 이해하기 위해서 질량 분석 (MS)에 의해 다음의 두 MyoD 태그 형태의 immunopurification에 기초한 생화학 적 정제를 사용 MyoD 착체의 완전한 특성화 착수. 플래그-HA-태그 MyoD 플래그-HA 허가를 발현 제어 세포주를 발현 헬라-S3 세포주의 사용 플래그-HA-MyoD 이중 화성 정제를 수행하여 MyoD 복합체를 정제하기에 충분한 재료를 얻을 수있다. 우리는에 핵 부분을 분획 추가 한 다음, 세포질과 핵 분수에 세포 추출물을 분획 소금 추출 (핵 소금 추출, SE) 및 뉴 클레오 위해 (뉴 클레오 강화, NE) 분수를 강화. 이러한 분리 된 핵 분수 (그림 1, 표 1 및 표 2)에서 TAP-태그 정화는 상대적으로 낮은 ...

MyoD는 완전히 분화된 많은 비근육 세포주의 근육 전달화를 유도하는 강력한 능력을 가진 근육 전사 인자입니다. 이 전이분화(transdifferentiation)에 관여하는 후성유전학적 메커니즘은 대체로 알려져 있지 않다. 여기에서는 이중 친화성 정제 방법과 질량 분석법을 설명하여 MyoD 파트너를 철저하게 특성화합니다.

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

이 실험의 전반적인 목표는 MyoD 단백질 파트너를 철저하게 특성화하는 것입니다. 이 방법은 주요 근육 전사 인자인 MyoD에 의한 골격근 색조 변형의 분자 조절과 같은 골격근 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나의 특정 핵 격실에 국한된 선택적으로 낮은 존재량을 가진 MyoD 파트너를 풀 수 있다는 것입니다.이 방법은 근육 분화 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 조직, 특히 핵 분화와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 조교인 Dr. Lauriane Fritsch가 맡을 것입니다. 이 프로토콜에서 MyoD 복합체는 FLAG glutenin 태그로 MyoD를 안정적으로 발현하는 HeLa S3 세포에서 정제됩니다.빈 벡터로 형질도입된 HeLa S3 세포가 대조군으로 사용됩니다. 두 세포주 모두 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 이전에 섭씨 영하 80도에서 성장, 수집 및 저장되었습니다. 세포 펠릿을 섭씨 37도의 수조에서 빠르게 해동합니다.모든 버퍼와 균질기는 사전 냉각되어야 하며 이 전체 절차는 냉장실에서 수행해야 합니다. 일반적으로 각 실험 지점에는 20g의 세포가 사용되지만 이 시연의 목적에서는 10g 또는 약 10mL의 세포만 처리됩니다. 처음에 5mL의 완충액을 사용하여 10mL의 저장성 완충액 A에 세포를 재현탁합니다.그런 다음 2.5mL를 추가한 다음 2.5mL를 더 추가합니다. 최대 세포를 얻기 위해 새 버퍼로 피펫을 잘 씻으십시오. 세포 현탁액 20mL를 꼭 끼워진 유봉을 사용하여 사전 냉각된 균질기로 옮깁니다.20번의 스트로크로 세포를 균질화합니다. 세포 현탁액을 50ml 튜브로 옮깁니다. 세포의 최대 회복을 위해 3.5mL의 자당 완충액으로 균질기를 세척하십시오.이 현탁액을 50mL 튜브로 빠르게 옮겨 핵을 보존하고 누출을 제한합니다. 30마이크로리터의 세포 현탁액을 30마이크로리터의 4% Trypan Blue로 염색하고 현미경으로 분석하여 용해 효율을 확인합니다. 용해가 성공하면 모든 핵이 파란색이어야 합니다.필요한 경우 균질화를 반복합니다. 10, 000 x g 및 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리기를 사용하여 핵을 펠릿화합니다. 상층액을 세포질 분획으로 저장합니다.핵 펠릿을 4mL의 자당 완충액에 재현탁하여 핵염 추출물 분획을 준비하기 위한 절차를 시작합니다. 그런 다음 4mL의 고염 완충액을

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

초파리는하지만 깊이있는 생화학 적 분석의 적합성에 대한, 강력한 유전자 조작으로 유명합니다. 여기에서 우리는 파리의 뇌에서 관심의 단백질의 상호 작용 파트너를 식별 할 수있는 TAP 기반의 절차를 제시한다. 이 절차는 잠재적으로 연구의 새로운 길을 초래할 수 있습니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

단백질 추출, 정량화, 강수량, 소화, 라벨링, 프로테오믹스 시설에 대한 제출, 데이터 분석 등 각 단계에 대한 자세한 정보를 포함하는 최적화된 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링 프로토콜을 제시합니다.

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

이 비디오는 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 질량 분석법 (든 - MS)에 의해 펩티드와 단백질 분석을위한 울트라 얇은 매트릭스 / analyte 레이어의 준비를 보여줍니다.

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

쿠매시 블리언트 블루 (CBB)의 polyacrylamide 젤의 G - 250로 단백질 얼룩에 대한 짧은 프로토콜은 CBB와 고전적인 얼룩 절차에서와 같이 유기 용제 또는 초산을 사용하지 않고도 설명되어 있습니다.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

배우세요 이중 선호도 정화와 질량 분석을 사용하여 MyoD 단백질 상호 작용체를 식별하는 방법을. HeLa S3 세포에서 저발현 파트너를 규명하여 근육 분화 메커니즘을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

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