바이오 필름 관련 타겟팅

이 절차의 전반적인 목표는 생존 염색약을 이용한 항생제 감수성 테스트를 위해, 뚜껑에 부착된 페그를 사용하여 96-웰 플레이트 형식에서 세균 바이오필름을 쉽고 재현성 있게 배양하는 것입니다. 이 방법은 체내 감염 상태를 더 잘 반영하는 경우가 많은 바이오필름 관련 세포에 대한 활성을 탐색함으로써 항생제 발견 및 개발 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3단계 분석법으로 형성된 바이오필름에 쉽게 자극을 주고, 일반적인 생존 염색약을 사용하여 억제 여부를 결정할 수 있다는 점입니다.

먼저, 영양분이 풍부한 배지에서 바이오필름 형성 미생물을 배양합니다. 글리세롤 스톡으로부터 Staphylococcus aureus Newman 균주를 10 milliliters의 Muller-Hinton 배지에 접종합니다. S.aureus 취급과 관련된 모든 작업은 장갑을 착용하고 생물안전작업대(bio-safety cabinet) 내에서 수행하십시오.

회전 쉐이커를 사용하여 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 계산된 배양액 부피를 원심분리 튜브에 넣고 10,000 Gs에서 1분간 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 바이오필름 접종액을 준비하려면, 사용한 배양 배지를 흡입하여 제거하고 세포 펠릿을 20 mL의 CRPMI에 재현탁합니다. 200 µL 멀티채널 피펫을 사용하여, 25 mL 리저버에 담긴 접종액 125 µL를 바닥 플레이트의 A행부터 G행까지의 각 웰에 분주합니다.

무균성 대조군으로서 H행의 각 웰에 멸균된 CRPMI 배지 125 µL를 채웁니다. 페그 리드(peg lid)를 집어 페그가 아래를 향하도록 플레이트 바닥 위에 유지합니다. 개별 페그를 각각의 웰에 조심스럽게 맞춥니다.

플레이트와 페그가 서로 물리적으로 접촉하지 않도록 주의하십시오. 정렬이 완료되면 덮개를 조심스럽게 내립니다. 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 덮개와 플레이트를 밀봉한 다음, 밀폐 가능한 플라스틱 백에 넣고 단단히 밀봉합니다.

증발을 최소화하기 위해 백 내부의 공기 부피를 가능한 한 낮게 유지하십시오. 5% Carbon Dioxide 인큐베이터에서 37 degrees Celsius로 48시간 동안 흔들지 않고 플레이트를 배양합니다. 바이오필름 챌린지 당일에 새로운 96-well 플레이트를 준비하고, B행부터 H행까지의 각 웰에 실온으로 평형을 맞춘 CRPMI 100 microliters를 첨가합니다. 최대 4가지의 테스트 화합물을 각각 1.0 milliliter의 CRPMI에 희석하여 최종 희망 농도의 2배가 되도록 만듭니다.

웰 A1-A3에 화합물 1을 200 µL, 웰 A4-A6에 화합물 2를 200 µL, 웰 A7-A9에 화합물 3을 200 µL, 그리고 웰 A10-A12에 화합물 4를 200 µL씩 첨가합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 테스트 화합물을 연속 희석합니다.

먼저 A행에서 B행으로 100 µL를 옮긴 후 혼합합니다. 같은 방식으로 웰에서 웰로 100 µL씩 계속 옮깁니다. 매 전송 후 혼합하며, F행에서 멈춥니다. 혼합 후, F행에서 100 µL를 폐기물 용기에 버립니다.

G행과 H행에는 액체를 옮기지 마십시오. 마지막으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트의 각 웰에 CRPMI 100 µL를 추가하여 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 바이오필름 개시 플레이트와 웰 크기가 동일한 새 멸균 96-웰 플레이트에 phosphate-buffered saline 200 µL를 추가합니다. 그다음, 배양된 바이오필름 개시 플레이트에서 플라스틱 백과 파라핀 필름을 제거합니다.

페그와 플레이트 바닥이 접촉하면 바이오필름이 손상될 수 있으므로, 뚜껑을 수직으로 들어 올리십시오. 이후 OD600 분석을 위해 바닥 부분을 보관하십시오. 페그 뚜껑을 PBS가 들어 있는 플레이트에 넣어 부유 세포를 씻어냅니다.

페그를 5초 동안 담급니다. PBS에서 페그를 들어 올린 후, 페그가 웰 벽면에 부딪히지 않도록 주의하며 다시 한번 담급니다. 세척된 페그 리드를 챌린지 플레이트에 배치합니다.

페그와 바닥 플레이트 사이의 불필요한 접촉을 피하십시오. 접촉 시 바이오필름이 손상되어 일관되지 않은 결과가 나올 수 있습니다. 플레이트를 파라핀 필름으로 밀봉한 후, 이전과 같이 밀봉 가능한 플라스틱 백에 넣으십시오. 5% Carbon Dioxide 인큐베이터에서 37 degrees Celsius로 24시간 동안 흔들지 않고 배양하십시오.

바이오필름 형성 시작 플레이트의 바닥 부분을 취해 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰의 박테리아를 재부유시킵니다. 적절한 마이크로플레이트 리더로 OD600을 측정하여, H행의 멸균 대조군을 제외한 모든 웰에서 성장이 일어났는지 확인합니다. resazurin 전환을 검출하기 위해 배양 챔버가 장착되어 있고 키네틱 형광 측정이 가능한 플레이트 리더를 사용하십시오. 들뜸 파장 530 nanometer, 방출 파장 590 nanometer로 설정하여 24시간 키네틱 형광 측정을 수행합니다.

챔버 온도를 37 °C로 설정하고, 20분마다 플레이트를 읽도록 설정하십시오. 제조사의 지침에 따라 플레이트 리더기가 플레이트 바닥에서 측정하도록 설정하십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 멸균된 96-well 플레이트의 각 웰에 200 µL의 PBS를 첨가하여 플레이트를 세척할 준비를 하십시오.

그런 다음, 0.8 mg/mL resazurin 스톡 솔루션 400 µL를 CRPMI 배지 20 mL에 추가하여 최종 농도가 16 µg/mL resazurin이 되도록 바이오필름 회복 배지를 준비합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 새로운 96-웰 플레이트의 각 웰에 바이오필름 회복 배지 150 µL를 분주합니다. 챌린지 플레이트를 인큐베이터에서 생물 안전 작업대로 옮기고, 플라스틱 백과 밀봉 필름을 조심스럽게 제거합니다.

챌린지 플레이트에서 페그 리드를 제거하고, 이전과 같이 PBS로 부유 세포를 씻어내며, 이후 OD600 분석을 위해 챌린지 플레이트 바닥면을 보관합니다. 세척 후, 바이오필름 회수 배지가 들어 있는 플레이트 바닥에 페그 리드를 배치합니다. 주변 웰의 바닥 부분이 가려지지 않도록 주의하며 플레이트 측면을 파라핀 필름으로 감쌉니다.

플레이트를 랩으로 감싼 직후 플레이트 리더에 넣고, 이전에 작성한 resazurin-kinetic 프로토콜을 실행하여 24시간 동안 키네틱 측정을 시작하십시오. 챌린지 과정 중에 발생했을 수도 있고 발생하지 않았을 수도 있는 부유 세포의 성장을 정량화하려면, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 챌린지 플레이트 바닥 전체의 OD600을 측정하십시오. 여기에는 화합물 농도를 적정하기 위해 두 단계의 완전 희석을 사용한 챌린지 플레이트의 예시 레이아웃이 나와 있습니다.

배양된 바이오필름을 neocuproine 또는 그 구리 복합체로 처리하였습니다. 24시간 후 챌린지 플레이트 바닥의 OD600 값을 측정한 결과, neocuproine 단독 처리가 아닌 neocuproine 구리 복합체 처리 시 1.25 micromolar 이상의 농도에서 처리된 바이오필름으로부터 생존 세포의 탈락 및 이후 성장이 억제됨을 확인하였습니다. 이후 해당 바이오필름들을 대상으로 resazurin 분석을 수행하였습니다.

24시간 후 육안으로 검사하면 여러 플레이트를 동시에 진행할 때 빠르게 예/아니오 답을 얻을 수 있습니다. 생존 가능한 바이오필름이 있는 웰에서는 레사주린(Resazurin)이 분홍색으로 변하지만, 바이오필름이 제거된 경우에는 파란색으로 유지됩니다. 레사주린 전환의 키네틱 리딩을 통해 바이오필름 생존력에 미치는 농도 의존적 효과를 확인할 수 있으며, 이는 여기의 gentamicin 예시와 같습니다.

염료 전환 시작의 농도 의존적 지연은 바이오필름의 생존력 감소를 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때, 페그가 웰의 측면에 부딪히지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.