토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

이 외과적 개입의 전반적인 목표는 기능 장애가 있는 망막 색소 상피(RPE)를 대체하여 노화 관련 황반변성과 같은 RPE 관련 질병에 대한 가능한 치료법을 찾는 것입니다. 이 방법은 세포 기반 치료 및 연령 관련 황반 변성에 대한 검안 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 치환 기질 또는 약물 전달 장치를 망막하 공간으로의 수송 방식을 제공할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 토끼의 유리체 절제술 및 망막하 수술에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 돼지, 원숭이 또는 인간과 같은 다른 모델 유기체에도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 안구 내 수술이 복잡할 뿐만 아니라 이 절차를 위한 인력, 조직 및 기술이 잘 동기화되어야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 기구 로딩 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Fabian Thieltges와 외과 스크럽 간호사인 Ralf Brinken입니다.

수술을 시작하기 전에 적절한 마취 수준을 확인하고 수술하지 않은 동물의 다른 눈에 안연고를 바르십시오. 그런 다음 토끼를 수술용 현미경으로 왼쪽에 놓고 오른쪽 눈은 위를 향하게 하고 코는 담요로 접어 약간 위로 향하게 합니다. 포비돈 요오드 몇 방울로 1분 동안 눈을 소독한다.

그런 다음 멸균 BSS로 눈을 헹구고 미리 절단된 눈 구멍이 있는 멸균 드레이프로 동물의 머리를 덮습니다. 12 x 17cm 크기의 끈적끈적한 외과적 절개 드레이프를 눈 위에 놓고 가위를 사용하여 정중선 수평 절개로 눈을 노출시킵니다. 거꾸로 된 캘리퍼를 사용하여 눈을 엎은 위치로 옮기고 3-0 실크 봉합사로 조직을 고정합니다.

그런 다음 Vannas 가위를 사용하여 인접한 혈관에서 약 1mm 떨어진 가장자리에 가까운 결막을 절개하고 가장자리와 평행하게 주막을 확대합니다. 결막을 뭉툭하게 분리한 다음 6-7mm 수직 수직 절개를 하여 결막에 T"를 만듭니다. 2시 위치 주위에 또 다른 작은 peritomy를 만듭니다.

그런 다음 23 게이지 마이크로 유리체 망막 블레이드의 끝을 공막을 통해 조심스럽게 삽입하고 8시 위치의 변연에서 3.5mm 지점의 눈의 뒤쪽 극을 가리킵니다. 절개 부위가 확대되지 않도록 칼날을 같은 방향으로 천천히 후퇴시키고 7-0 Vicryl 봉합사를 미리 배치합니다. 그런 다음 맞춤형 측면 포트 주입 캐뉼라를 공막 개구부에 삽입하고 사전 배치된 봉합사를 사용하여 캐뉼라를 고정합니다.

안압을 수은 20-24mm로 설정합니다. 그런 다음 25게이지 플랫 헤드 투관침을 사용하여 2시 위치에서 공막을 뚫고 25게이지 샹들리에 조명을 포트에 삽입합니다. 테이프로 조명을 고정하고 약 30% 전력으로 조정한 다음 개별적으로 조정합니다.

20개의 메스를 사용하여 부종성 각막 상피를 제거하여 더 나은 안구 내 시각화를 용이하게 합니다. 이제 10시 방향에 23게이지 미세 유리체 망막 면도날로 또 다른 경화술을 시행하고 매듭을 완전히 묶지 않고 절개된 공막 주위에 U자형 7-0 Vicryl 봉합사를 놓습니다. 고속 유리체 절제술사의 끝을 절개 부위에 삽입하고 입구 구멍 주변에서 유리체 절제술을 시작합니다.

유리체액을 분당 최대 2, 000에서 3, 000 컷으로 작은 조각으로 자르고, 시신경 디스크와 섬유골 수질에 대한 유리체 절제술을 계속하고, 최대 200mm의 수은을 흡인합니다. 유리체액을 망막에서 부드럽게 분리하려면 유리체를 디스크의 뒤쪽 극과 아래쪽 극 위에 놓고 절단하지 않고 계속 흡인합니다. 후방 유리체 박리가 완료되면 유리체강내 약 50마이크로리터의 관심 화합물을 주입하여 거의 완전히 제거하는 동안 부유 유리체를 시각화합니다.

눈이 준비되면 주입 세포 배양을 보충되지 않은 안과 등급 BSS로 세 번 헹굽니다. 다음으로, 100 x 20mm 세포 배양 접시에 10ml의 안과 등급 BSS를 채우고 접시에 세포 배양 삽입물을 추가합니다. 광학 현미경으로 접시를 중앙에 놓고 날카로운 타원형 맞춤형 중공 바늘을 사용하여 세포 배양에서 두 개의 긴 가장자리와 두 개의 둥근 가장자리가 있는 납작한 콩 모양의 2.4 x 1.1mm 기판을 펀칭합니다.

두 번째 포트를 통해 바늘을 BSS로 부드럽게 주입하여 BSS로 채워진 세포 배양 접시에 임플란트를 플러시합니다. 세 번째 가장자리를 얻으려면 임플란트의 둥근 끝 부분 중 하나를 0.5ml 절개하고 23게이지 멤브레인 박리 겸자를 사용하여 임플란트를 맞춤형 로딩 스테이션으로 옮깁니다. 임플란트가 똑바로 세워져 있는지 확인한 다음 집게를 사용하여 모든 조직이 팁 내부에 고정될 때까지 임플란트를 슈터 기구에 부드럽게 완전히 밀어 넣고 세포가 이식될 때까지 슈터 팁을 BSS 아래의 로딩 스테이션에 놓습니다.

망막 아래 세포를 이식할 수 있도록 기밀 주사기에 연결된 확장 가능한 41게이지 망막하 주사바늘로 신경 망막에 접근하고 BSS를 망막하 주사하여 기포 망막 박리를 만듭니다. 흩어짐이 디스크 직경이 약 2-3개인 경우 수직 23게이지 VR 가위를 사용하여 망막 절개술을 1.5mm로 확대하고 1.4mm 절개 칼을 사용하여 10시 방향 경화절개술을 20게이지 접근 방식으로 정확하게 확장합니다. 다음으로, 20게이지 슈터 더미를 경화절개술을 통해 통과시키려고 시도하고, 장전된 슈터의 부드럽지만 아늑한 전환을 보장하기 위해 필요에 따라 절개 부위를 확대합니다.

그런 다음 장전된 슈터를 20-24mm의 수은으로 공막 절개 부위를 통해 망막 절개 가장자리까지 통과시키고 망막 외피 위치에서 망막하 보형물을 주입합니다. 사수는 첫 번째 시도에서 공막을 신속하게 통과해야 하므로 최적의 크기의 경화절개술을 보장해야 합니다. 그런 다음 RPE 세포를 얕은 각도로 망막하 이식하여 임플란트가 Bruch의 막에 갇히지 않도록 해야 합니다.

임플란트가 망막 절개술에서 합리적으로 떨어진 망막 아래에 놓이도록 조정합니다. 그런 다음 경화절개술에서 포트를 제거하고 샹들리에 포트를 통해 25마이크로리터의 트리암시놀론을 주입합니다. 7-0 봉합사를 사용하여 2시와 10시 방향의 경화절제술을 닫고 누출 여부를 확인합니다.

주입 캐뉼라를 제거하고 사전 배치된 7-0 Vicryl 봉합사로 마지막 경화절개술을 즉시 닫습니다. 30게이지 바늘을 사용하여 BSS를 주입하여 두드리면서 필요에 따라 안압을 조정합니다. 마지막으로 결막을 7-0 Vicryl로 봉합하고 proptosing silk를 제거하여 깊은 안와 정맥 신경총을 피하도록 주의합니다.

망막 아래 생착은 중심 유리체 절제술을 시행할 때 약 60%의 수술 성공률을 보이며, 이는 후방 유리체 박리가 유도될 때 75% 이상으로 증가합니다. 여기에서는 복잡하지 않은 시술 후 폴리에스테르 멤브레인에 이종 이식된 배양 망막 색소 상피의 스캐닝 레이저 검안경 적외선 반사 이미지를 보여주며, 면역 반응으로 인한 광수용체 위축이 임플란트 주위에 후광으로 나타납니다. 이 해당 스펙트럼 도메인 광간섭 단층촬영 이미지에서는 RPE의 이종 이식에 대한 반응으로 외부 핵층이 얇아지는 것을 관찰할 수 있으며, 주로 임플란트 위에 눈에 띄는 과반사 밴드가 있는 망막에서 관찰할 수 있습니다.

그러나 임플란트에 인접한 신경 망막은 거의 정상에 가까운 반사 띠를 나타내며, 이는 임플란트의 외상성 전달을 시사합니다. H/E 염색에서 관찰된 바와 같이, 망막하 흉터와 외부 핵층 위축은 면역이 억제되지 않은 이종 이식 토끼에서 발생합니다. 임플란트 아래의 브루흐 막도 인접해 있는 것으로 보이며, 맥락모세관에는 흩어져 있는 적혈구가 포함되어 있어 임플란트 분만 중에 발생한 외상이 없음을 더욱 확인시켜줍니다.

이 기술을 마스터하면 합병증이 발생하지 않으면 1시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 임플란트에 맞을 만큼 큰 망막 기포와 망막 절개술을 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 더 빠른 수술 개입은 일반적으로 더 나은 결과를 낳습니다.

이러한 절차에 이어서, 광간섭 단층촬영(optical coherence tomography) 또는 조직학(histology)과 같은 다른 방법들을 사용하여 이식의 성공, 망막하 생체 적합성 및 이식된 세포의 생존과 같은 추가적인 질문에 답할 수 있다. 개발 후 이 기술은 줄기세포 생물학 및 생체 재료 분야의 연구자들이 망막 질환, 특히 RPE에 대한 줄기세포 유도체 및/또는 생체 기능화 운반체 기질의 망막하 전달을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 토끼에서 유리체 절제술 및 망막하 이식 수술을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

수정체, 유리체 망막 및 망막하 계면으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 손 위치, 좋은 시각화, 안정적인 안압과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.