TAPE : 외과 응용 프로그램에 대한 식물의 유비쿼터스 화합물에서 영감을 생분해 성 지혈 접착제

이 프로토콜의 전반적인 목표는 식물에 널리 존재하는 화합물에서 영감을 받아 수술용으로 적용 가능한 생분해성 지혈 접착제를 개발하는 것입니다. 이 방법은 생체 모방 기술의 내수성 접착 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되며, 이는 의생명 분야의 조직 접착제 및 밀봉제 등에 적용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 TAPE 제작 과정이 매우 간단하고 확장 가능하며 환경 친화적이라는 점입니다.

먼저, 마그네틱 교반기 위에서 4 mL 유리 바이알에 탄닌산 용액을 준비합니다. 증류수 1 mL와 탄닌산 1 g을 넣고 200 rpm으로 교반합니다. 1시간 후, 탄닌산이 완전히 용해되어 갈색 용액이 됩니다.

다음으로, 1 g의 PEG 분말에 1 mL의 증류수를 가하고 볼텍스하여 흰색 슬러리 상태로 만듭니다. 이 슬러리를 60 °C에서 10분 동안 유지합니다. 그러면 용액이 완전히 투명해져야 합니다.

그 다음, 상온으로 되돌립니다. 이어서 마이크로원심분리 튜브에 PEG 용액 329 µL와 탄닌산(Tannic Acid) 용액 671 µL를 혼합합니다. 두 용액 모두 점도가 매우 높으므로 분주 시 천천히 취하십시오.

좁은 스패튤라를 사용하여 용액들을 꿀과 같은 혼합물이 되도록 부드럽게 섞어줍니다. 고정각 로터(fixed angle rotor)를 사용하여 12,300 g에서 3분 동안 혼합물을 원심분리합니다. 그런 다음, 완전히 형성된 TAPE를 남기고 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 피펫으로 제거합니다.

TAPE를 4~8°C에서 수 주 동안 보관하십시오. TAPE의 접착 강도를 측정하려면 돼지 피부 생검 펀치로 테스트 조직을 준비하십시오. 모든 지방을 제거한 후, 지름 6mm의 테스트 조직 두 개를 준비하십시오.

각 조직의 바깥쪽에 상용 시아노아크릴레이트 접착제를 바르고, 시험기로 잡을 막대나 유사한 물체를 부착합니다. 다음으로, 조직의 한쪽에 TAPE를 한 방울 떨어뜨리고 두 조직의 내면 사이에 균일하게 펴 발라 부착시킵니다. 그 후, 조직을 여러 번 붙였다 떼어내어 접합면을 완전히 덮는 균질한 혼합물을 만듭니다.

다음으로, 시험 장치에 막대를 부착합니다. 20 Newtons의 힘을 1분 동안 가하는 것부터 시작하십시오. 그 다음, 조직이 완전히 분리될 때까지 분당 1 millimeter의 속도로 막대를 벌려 당깁니다.

데이터는 힘-거리 곡선으로 제공됩니다. 물이 있는 상태에서 접착 강도를 테스트하려면, 두 조직 사이의 분리된 영역에 20 µL의 물을 추가하고 즉시 TAPE로 젖은 표면을 접착하십시오. 다른 변경 사항 없이 이전과 동일하게 테스트를 반복하십시오.

먼저, 마이크로원심분리 튜브의 캡을 지름 8mm 크기로 잘라 무게를 잽니다. 다음으로, 캡에 TAPE 150mg을 채우고 전체 무게를 측정합니다. 이때 차단벽 역할을 해야 하므로 캡의 가장자리 위로 넘치게 채우지 마십시오.

75 square centimeter 세포 배양 플라스크에 PBS 버퍼 50 milliliters를 넣습니다. 로딩 캡을 플라스크에 넣고 캡이 잠기게 합니다. 50 rpm 이하로 설정된 궤도 셰이커 위에서 37 degrees Celsius로 플라스크를 배양합니다.

원하는 시점에 캡을 분리하고 질소 가스로 건조합니다. 그다음 캡의 무게를 측정합니다. 이어서 플라스크의 PBS를 교체하고 다음 측정 시점까지 부드럽게 흔들어주며 배양을 계속합니다.

측정값을 바탕으로 상대적 잔존 중량을 계산하십시오. 발가락 꼬집기 테스트를 통해 마취 상태를 확인한 6주령 수컷 생쥐를 준비하십시오. 수술을 시작하기 전 반드시 눈에 동물용 연고를 도포하십시오.

이제 복부 정중선 절개를 통해 간을 노출시키고, 간 아래에 질량을 알고 있는 여과지를 배치하여 간을 고정합니다. 다음으로, 18-gauge 바늘로 간을 찔러 출혈을 유도합니다. 멸균 거즈로 혈액을 흡수하는 동안, 절개 부위에 TAPE 100 µL를 즉시 도포합니다.

양성 대조군에는 cyanoacrylate 또는 유사한 접착제를 사용하고, 음성 대조군에는 아무런 조치를 취하지 않습니다. 추가적인 봉합은 필요하지 않습니다. 접착제를 도포한 후, 손상 부위에서 흘러나오는 혈액을 거름종이에 수집합니다.

2분 동안 30초마다 거름종이를 교체하십시오. 4장의 거름종이에 흡수된 혈액의 질량을 측정하십시오. 동물은 안락사시켜야 합니다.

TA와 PEG의 여러 비율을 테스트하였으며, TAPE를 제조하기 위한 최적의 조합은 2:1의 부피 비율이었습니다. 이러한 TAPE를 직경 6mm의 돼지 피부 두 장 사이에 도포한 후, 설명된 바와 같이 인장 시험기로 테스트하였습니다. 두 장의 돼지 피부를 분리하는 데 필요한 힘은 초기에 200 kPa로 측정되었으며, 반복적인 사이클을 통해 250 kPa까지 증가하였습니다.

부착 및 탈착 사이클마다 피부 샘플을 적신 결과, 결합 인장 강도는 초기에 90 kilopascals로 떨어졌으며 20회 사이클 후에는 50 kilopascals로 감소했습니다. TAPE의 내구성은 생리적 광조건 하에서 흔들어주며 PBS에 희석된 소량의 부피로 테스트되었습니다. 2:1 비율의 포뮬레이션을 사용했을 때 21일 동안 질량이 유지되었습니다.

이러한 조건 하에서 TAPE의 1:1 비율 제형은 13일 동안만 유지되었습니다. 다음으로, 체내(in vivo) 지혈 테스트를 수행하였습니다. TAPE로 밀봉한 간을 상용 피브린 글루와 비교하였습니다.

TAPE로 밀봉한 간은 피브린 글루(fibrin glue)로 밀봉한 간보다 출혈이 현저히 적었습니다. 숙련되면, 적절하게 수행했을 때 TAPE 조제는 5분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, Tannic Acid와 PEG 사이의 최적화된 비율을 유지하는 것이 중요하며, 이는 TAPE의 접착력에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 생체 인식 분야의 연구자들은 내수성 접착 재료 개발의 현재 문제들을 해결하기 위해 자연에서 영감을 얻은 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 방법은 지혈 재료에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 상처 치유를 위한 조직 밀봉제 및 약물 전달을 위한 이식형 패치와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.