등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

이 프로토콜의 전반적인 목표는 등쪽 마우스 피부에서 줄기세포와 표피 각질세포의 다양한 집단을 분리하는 것입니다. 이 프로토콜을 통해 사용자는 등쪽 마우스 피부에서 여러 세포 집단을 동시에 분리할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 신뢰할 수 있으며 이질적인 피부 세포 집단의 혼합물에서 특정 유형의 관심 세포를 분리하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 제 연구실의 Yahav Yosefzon 박사가 맡을 것입니다. 먼저 전기 이발기를 사용하여 모낭 주기의 휴지기 단계에 있는 50-80일 된 쥐의 등 피부 털을 모두 면도하고 피부와 피하층을 손상시키지 않고 가위를 피부에 최대한 가깝게 유지합니다. 그런 다음 70% 에탄올을 사용하여 피부를 소독하고 모발 잔여물을 제거합니다.

해부 패드에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 꼬리 근처의 피부를 들어 올리고 가위로 피부를 긁습니다. 등쪽 피부 전체를 채취하려면 뒤쪽-앞쪽 방향으로 조직을 조심스럽게 잘라 피부와 근막을 분리합니다.

피부를 모두 제거했으면 조직의 인접한 두 가장자리를 머리카락 면이 아래로 향하게 하여 해부 매트에 고정합니다. 그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 피부가 찢어지지 않도록 가벼운 압력을 가하고 진피가 맑고 깔끔해질 때까지 무딘 메스로 지방을 부드럽게 긁어냅니다. 지방이 모두 제거되면 100mm의 멸균 배양 접시에 피부 진피 쪽을 아래로 향하게 놓고 주름이 없을 때까지 조직을 곧게 펴십시오.

칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 10ml로 피부를 씻고 필요에 따라 피부를 다시 곧게 펴십시오. 그런 다음 PBS를 제거하고 0.25%트립신 10ml로 조직을 배양하여 피부가 펼쳐지고 자유롭게 떠다니도록 주의합니다. 배화가 끝나면 구부러진 집게를 사용하여 피부를 제자리에 고정하고 꼬리에서 시작하여 모발이 자라는 방향을 따라 피부의 모든 털을 긁어냅니다.

난포는 작은 덩어리를 형성하는 경향이 있으므로 한 번에 작은 부분을 긁어내어 덩어리의 크기를 최대한 줄이십시오. 모낭이 모두 채취되면 털이 없는 피부를 새로운 배양 접시에 옮기고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 10ml로 조직에 수분을 공급합니다. 모든 모낭이 제거되었는지 확인합니다.

그런 다음 메스와 집게를 사용하여 단일 모낭 현탁액이 얻어질 때까지 모낭을 분해합니다. 다음으로, 10ml 피펫으로 모낭 용액을 몇 분 동안 격렬하게 분쇄하여 모든 덩어리를 분해합니다. 그런 다음 세포를 얼음 위의 50ml 튜브로 옮기고 동물 및 샘플 번호가 미리 표시되어 있습니다.

이제 피부에서 PBS를 흡인하고 이를 사용하여 모낭 현탁액이 포함된 세포 배양 접시를 헹굽니다. 모낭 세포와 함께 세척액을 풀링하고 70미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 새로운 50ml 튜브로 여과합니다. 처음 50ml 튜브와 여과기를 10ml의 염색 완충액으로 세척합니다.

그런 다음 40미크론 스트레이너를 통해 현탁액을 새 50ml 튜브로 여과하고 두 번째 튜브를 5-10ml의 새 염색 버퍼로 세척합니다. 다음으로, 세포를 두 번 스핀다운하고 두 번째 원심분리 동안 5ml의 새로운 변형 완충액으로 세포를 세척합니다. 두 번째 탈수 후 펠릿을 800마이크로리터의 새 염색 완충액에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 25-50마이크로리터의 세포를 염색되지 않은 대조 튜브와 DAPI 대조 튜브로 옮기고 각 대조 튜브의 총 부피를 최대 300마이크로리터까지 끌어올리기에 충분한 염색 완충액을 추가합니다. 이제 1차 항체와 DAPI를 적절한 샘플 튜브에 추가하고 부드럽게 튕기면서 세포를 혼합합니다. 세포가 부유 상태를 유지하기 위해 어둠 속에서 얼음 위에서 30분 동안 10분마다 튕기면서 세포에 라벨을 붙입니다.

배양이 끝나면 튜브당 약 4ml의 염색 완충액으로 세포를 세척하고 800마이크로리터의 염색 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 여과기 캡이 있는 팩스 튜브로 세포를 여과하여 분석 중에 단일 세포 현탁액을 확인합니다. 이 그래프에서는 피부 상피 세포의 alpha six positive beta one 양성 집단 내에서 CD34 및 Sca-1 세포 표면 발현의 다양한 패턴을 보여줍니다.

세포는 먼저 인테그린 알파 6 및 인테그린 베타 1의 발현에 따라 게이트를 열었습니다. 그런 다음 인테그린 알파 6 양성 인테그린 베타 1 양성 세포를 CD34 및 Sca-1 발현에 따라 게이트화했습니다. 두 개의 뚜렷한 세포 집단이 관찰되었습니다.

알파 6 베타 1 CD34 양성 Sca-1 음성 세포는 모낭 줄기 세포를 나타내고, 알파 6 베타 1 Sca-1 양성 CD34 음성 세포는 표피 각질 세포를 나타냅니다. 일반적으로 동물당 1.5-5 곱하기 10 대 5 알파 6 베타 1 양성 세포 또는 CD34 양성 모낭 줄기 세포. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 쥐의 등쪽 피부를 해리하고 모낭 줄기 세포와 표피 각질 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.