2016년 9월 13일
혈관 재생을 시각화하는 데 사용되는 도구에는 혈관 나무를 대조하는 방법이 필요합니다. 이 필름은 혈관 나무의 최적 대비를 달성하는 데 사용되는 섬세한 주입 기술을 보여주고 μCT 및 조직학적 연속 절편을 사용하여 결과 표본의 자세한 분석으로 인한 잠재적 이점을 설명했습니다.
정상 마우스에서 70%부분 간절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화. 전통적으로 간 재생은 간 무게와 부피의 증가를 측정하고 간세포 증식 속도를 측정하여 평가합니다. 요즘 우리는 생쥐의 혈관 간 재생에 관심이 있으며 혈관 성장을 시각화하고 정량화하고자 합니다.
따라서 우리는 혈관 재생을 이미징하기 위한 워크플로우를 확립합니다. 워크플로우는 혈관 트리 대조, CT 스캔 획득, 3D 재구성, 결과 이미지의 정량적 및 정성적 분석의 4단계로 구성됩니다. 워크플로우는 혈관 나무를 대조하는 것으로 시작됩니다.
먼저 정상 간 또는 절제 간을 노출시킨 다음 관심 있는 혈관 시스템에 따라 중합 실리콘 조영제 화합물을 문맥 또는 간 정맥에 주입합니다. 다음으로, 이식된 간을 MicroCT에서 스캔합니다. 스캔 후 Imalytics 전임상 소프트웨어를 사용하여 3D 혈관 재건을 수행합니다.
결과 이미지의 기술적 품질이 충분히 우수하면 HepaVision을 사용하여 3D 재구성을 수행할 수 있습니다. 이 프로그램은 클리닉에서 간담도 수술을 계획하는 데 사용됩니다. 혈관나무의 3D 시각화 외에도 이 프로그램을 사용하면 공급 및 배출 혈관을 기반으로 간 부피, 총 간 및 각 엽의 부피를 시각화하고 계산할 수 있습니다.
재건 후, 우리는 계산 기술의 도움으로 특정 혈관의 길이와 직경과 같은 혈관 성장을 나타내는 추가 매개변수를 결정할 수 있습니다. 이를 통해 혈관 성장에 대한 정량적 설명을 할 수 있습니다. 반면에, 포르말린 고정 Microfil 샘플은 연속 섹션으로 절단할 수 있습니다.
일련 섹션은 전체 슬라이드 스캐너를 사용하여 염색하고 디지털화할 수 있습니다. 연속 절편의 강성 및 탄성 등록 후, 문맥 및 간 정맥 시스템 모두의 3D 혈관 나무를 재건할 수 있습니다. 향후 단계에서는 분자 이벤트의 공간적 분포를 탐구하고자 합니다.
간 재생에서 관심을 끄는 분자 사건의 한 가지 예는 간세포 핵에서 증식 마커 Ki-67의 출현과 3D 재구성 된 혈관 나무에서의 공간 분포입니다. 다음으로 Microfil 주입을 수행하는 방법에 대해 자세히 소개하겠습니다. 시약을 준비합니다.
Microfil 화합물 혼합물의 경우 MV 희석제, MV 화합물, 이 경우 파란색 MV-120 및 경화제가 필요합니다. 또한 피펫, 튜브 및 피펫터가 필요합니다. 5밀리리터 튜브 1개에 2밀리리터 MV-120을 준비합니다.
그런 다음 3 밀리리터 MV 희석제를 첨가하여 희석합니다. 부드럽게 흔들어 섞습니다. 헤파린 식염수 용액의 경우 10ml의 식염수에 1ml의 헤파린을 첨가합니다.
수술대 준비. 첫째, 현미경이 필요하고 둘째, 소모품 세트가 필요합니다. 6-0 실크 및 6-0 폴리프로필렌 봉합사, 5밀리리터 및 1밀리리터 주사기, 30 게이지 및 21 게이지 바늘, 주사기와 카테터 연결용 확장 튜브, 바늘 삽입이 있는 26 게이지 카테터, 면 팁 및 거즈.
셋째, 수술 기구가 필요합니다. 마이크로 기기, 클램프 및 전기 응고기. 넷째, 관류 펌프가 필요합니다.
동물을 준비합니다. 마우스를 마취 유도실에 넣고 2%의 이소플루란과 분당 0.3밀리리터의 산소로 마우스를 마취합니다. 마취된 마우스를 테이프를 사용하여 수술대에 고정하고 2%의 이소플루란과 분당 0.3밀리리터의 산소를 지속적으로 흡입합니다.
Microfil 주사, 문맥 시스템. 피부층은 가위를 사용하여 복부를 가로 절개하고 근육층은 전기 응고기를 사용하여 절개합니다. 면봉을 사용해 장을 왼쪽으로 옮기고 식염수에 적신 거즈로 장을 덮는다.
현미경으로 문맥을 해부합니다. 6-0 실크 봉합사를 여분의 간 문맥 아래에 분기점까지 약 1mm 거리에 놓습니다. 나중에 사용할 수 있도록 느슨하게 묶으십시오.
5분 동안 전신 간추출을 위해 음경 정맥에 헤파린 식염수를 주입합니다. 이 애니메이션은 카테터 삽입 절차를 보여줍니다. 먼저 6-0 실크 봉합사를 간문맥 아래에 놓고 26 게이지 카테터를 문맥에 삽입하고 클램프를 사용하여 고정합니다.
카테터를 고정하고 비장 정맥과 장간막 정맥의 혈류를 차단하기 위해 미리 배치된 봉합사를 접합합니다. 여기에서는 수술 절차를 시연합니다. 바늘로 26게이지 카테터를 삽입합니다.
카테터를 더 삽입하고 동시에 바늘을 천천히 빼냅니다. 클램프를 사용하여 카테터를 고정합니다. 기포를 피하기 위해 카테터에 헤파린 식염수를 완전히 채웁니다.
확장 튜브를 카테터에 연결하고 단단히 고정합니다. 관류 펌프를 켭니다. 분당 0.4ml의 유속으로 헤파린 식염수 관류를 시작합니다.
관류 직후 오른쪽 엽이 창백해지는 것을 관찰하십시오. 전체 관류 절차 동안 간을 촉촉하게 유지하기 위해 식염수를 사용하여 간을 헹굽니다. 마취 하에 관류를 통한 출혈로 마우스를 안락사시킵니다.
간 전체가 창백해질 때까지 몇 분 동안 헤파린 관류를 계속하십시오. Microfil 관류 전에 준비된 Microfil 화합물에 0.1ml의 경화제를 첨가하여 중합 절차를 가속화합니다. Microfil 컴파운드를 5ml 주사기와 확장 튜브에 로드합니다.
기포를 없애기 위해 이전과 동일하게 카테터에 헤파린 식염수를 주입하여 기포를 제거합니다. 튜브를 카테터에 연결하고 단단히 고정합니다. 약 1-2분 동안 분당 0.2ml의 유속으로 Microfil 주입을 시작합니다.
파란색 제제가 문맥 가지로 천천히 퍼지는 것을 관찰하십시오. 파란색 혈관 구조가 각 간엽 표면에 빨간색 원으로 표시된 것처럼 나타나면 관류를 중지합니다. Microfil 화합물 중합을 위해 간을 최소 15분 동안 방치하십시오.
Microfil 주사, 간 정맥계. 이 절차는 기본적으로 문맥계에 주사하는 것과 동일한 단계를 따릅니다. 분기점까지 약 1mm 거리의 여분의 간 문맥 아래에 6-0 실크 봉합사를 놓습니다.
그런 다음 문맥에 카테터를 삽입하고 클램프를 통해 고정합니다. 다른 카테터를 하대정맥에 삽입하고 클램프로 고정합니다. 카테터를 고정하고 비장 정맥과 장간막 정맥의 혈류를 차단하기 위해 미리 배치된 봉합사를 접합합니다.
간상하 하대정맥에 클램프를 놓아 간의 유출을 막습니다. 신장 정맥과 하대정맥의 원위 끝을 포함하는 하대정맥의 결찰 가지. 카테터 1을 통해 헤파린 식염수를 사용하여 간을 씻어냅니다.
카테터 2를 통해 Microfil 화합물로 간 정맥계를 관류합니다. 결과, 마이크로 CT 재구성. Micro CT 스캔 후 Imalytics 전임상 소프트웨어를 사용하여 3D 혈관 재건을 얻었습니다.
문맥 및 간 정맥계 모두에서 혈관 재생은 더 작은 혈관의 외곽 분지와 함께 주요 혈관 구조의 신장 및 확장으로 나타났습니다. 수술 후 2일차에는 잔존엽의 혈관나무가 길어졌습니다. 수술 후 7일째가 되자, 동일한 주요 문맥과 간정맥에서 작은 가지들이 추가로 눈에 띄기 시작했습니다.
결과, 간 혈관 나무와 종속 간 영역의 3D 색상 코드 재구성. 각 간엽은 HepaVision에 의한 색상 코드 재구성 후 3차원 모두에서 쉽게 시각화되었습니다. 표에 나타난 바와 같이, 전체 간과 각 엽의 간용적은 여기에서 보듯이 정상 간의 간 정맥계에 대해 결정되었습니다.
결과, 연속 절편 및 재구성. 한편, 포르말린이 고정된 Microfil 샘플은 연속 절편을 실시했습니다. 염색된 연속 절편은 전체 슬라이드 스캐너를 사용하여 디지털화되었으며 두 시스템의 혈관 나무 재구성에 사용되었습니다.
이것들은 엄격하고 탄력적인 등록 전후의 쥐 간 연속 절편 스택의 단면입니다. 컴퓨터 등록 후 문맥 및 간 정맥 시스템을 단일 3D 모델로 재구성할 수 있습니다. 이 수동 및 계산적으로 시간이 많이 걸리는 단계는 추가 최적화가 필요합니다.
다음 단계, 즉 혈관 나무에 대한 분자 이벤트의 공간 분포를 시각화하는 것이 현재 개발 중입니다. 이 단계는 대조되는 혈관 나무에서 파생된 Micro CT 정보와 조직학적 정보의 융합 또는 순전히 조직학적 정보의 3D 시각화로 상상할 수 있습니다. 이 경우 Micro CT 정보는 까다로운 조직학 기반 3D 재구성을 위한 품질 관리 역할을 합니다.
일단 달성되면, 우리는 간 재생을 더 잘 조사할 수 있는 도구를 갖게 됩니다. 특히 분자 사건의 공간적 분포와 혈관 재생과 관련된 간 실질(hepatic parenchyma)이 그렇습니다.
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이 기사는 부분 간 절제술 이후 마우스의 혈관 재생을 시각화하는 워크플로를 제시합니다. 혈관 트리의 대조를 강조하고 혈관 성장의 이미징 및 분석 방법을 개요로 설명합니다.
Visualizing vascular regeneration is critical for assessing liver recovery post-resection, a key consideration in hepatobiliary drug development and surgical adjuvant studies. This workflow enables quantitative evaluation of vascular regrowth, supporting mechanistic de-risking in preclinical models of liver injury and regeneration. By integrating contrast-enhanced micro-CT with histological reconstruction, the method provides translational biomarker alignment between vascular architecture and parenchymal repair.
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, particularly for studies requiring vascular phenotype characterization in liver regeneration models.