일반 마우스의 70 % 부분 간 절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화

정상 생쥐에서 70% 부분 간 절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화. 전통적으로 간 재생은 간 무게와 부피의 증가를 측정하거나 간세포 증식률을 결정함으로써 평가합니다. 최근 저희는 생쥐의 혈관성 간 재생에 관심을 가지고 있으며, 혈관 성장을 시각화하고 정량화하고자 합니다.

따라서, 혈관 재생 이미징을 위한 워크플로우를 설정합니다. 이 워크플로우는 혈관망 조영, CT 스캔 획득, 3D 재구성, 그리고 결과 이미지의 정량적 및 정성적 분석의 네 단계로 구성됩니다. 워크플로우는 혈관망 조영부터 시작됩니다.

먼저 정상 간 또는 절제된 간을 노출시킨 다음, 관심 있는 혈관 체계에 따라 문맥 또는 간정맥에 중합성 실리콘 조영제를 주입합니다. 다음으로, 적출된 간을 MicroCT로 스캔합니다. 스캔 후에는 Imalytics 전임상 소프트웨어를 사용하여 3D 혈관 재구성을 수행합니다.

결과 이미지의 기술적 품질이 충분하다면, HepaVision을 사용하여 3D 재구성을 수행할 수 있습니다. 이 프로그램은 임상에서 간담도 수술 계획을 세우는 데 사용됩니다. 이 프로그램은 혈관망의 3D 시각화뿐만 아니라, 공급 및 배출 혈관을 기반으로 전체 간 및 각 엽의 간 부피를 시각화하고 계산할 수 있게 해줍니다.

재구성 후에는 계산 기법을 활용하여 특정 혈관의 길이 및 직경과 같이 혈관 성장을 나타내는 추가 매개변수를 결정할 수 있습니다. 이를 통해 혈관 성장에 대한 정량적 기술이 가능해집니다. 한편, 포르말린으로 고정한 Microfil 샘플은 연속 절편으로 제작하여 절단할 수 있습니다.

연속 절편은 염색 후 전슬라이드 스캐너를 사용하여 디지털화할 수 있습니다. 연속 절편의 강체 및 탄성 등록을 거치면, 문맥 및 간정맥 시스템 모두의 3D 혈관수를 재구성할 수 있습니다. 향후 단계에서는 분자적 사건의 공간적 분포를 탐색하고자 합니다.

간 재생 과정에서 주목할 만한 분자적 사건의 한 예는 간세포 핵 내 증식 마커 Ki-67의 출현과 3D 재구성된 혈관 나무에서의 공간적 분포입니다. 다음으로, Microfil 주입법을 수행하는 방법에 대해 자세히 소개하겠습니다. 시약 준비 단계입니다.

Microfil 화합물 혼합물을 위해 MV 희석액, MV 화합물(본 실험에서는 청색 MV-120) 및 경화제가 필요합니다. 또한 피펫, 튜브 및 피펫터가 필요합니다. 5 mL 튜브 하나에 MV-120 2 mL를 준비합니다.

그 다음 MV 희석액 3 mL를 첨가하여 희석합니다. 부드럽게 흔들어 섞어 줍니다. 헤파린 식염수의 경우, 식염수 10 mL에 헤파린 1 mL를 첨가합니다.

수술대 준비 단계입니다. 먼저 현미경이 필요하며, 다음으로 일련의 소모품이 필요합니다. 6-0 silk 및 6-0 polypropylene 봉합사, 5 mL 및 1 mL 주사기, 30 gauge 및 21 gauge 바늘, 주사기와 카테터 연결용 연장 튜브, 바늘이 삽입된 26 gauge 카테터, 면봉 및 거즈를 준비합니다.

셋째, 수술 도구가 필요합니다. 미세 수술 도구, 클램프 및 전기 응고기가 필요합니다. 넷째, 관류 펌프가 필요합니다.

동물 준비. 마우스 인덕션 챔버에 마우스를 넣고 2% isoflurane과 분당 0.3 milliliter 산소로 마취시킵니다. 2% isoflurane과 분당 0.3 milliliter 산소를 지속적으로 흡입시키면서, 마취된 마우스를 테이프를 사용하여 수술대 위에 고정합니다.

Microfil 주입, 문맥계. 피부층에는 가위를, 근육층에는 전기 응고기를 사용하여 복부를 횡단 절개합니다. 면봉을 이용해 장을 왼쪽으로 밀어내고 식염수에 적신 거즈로 장을 덮어줍니다.

현미경 하에서 문맥을 박리합니다. 간외 문맥의 분지점에서 약 1 mm 거리의 하단에 6-0 실크 봉합사를 배치합니다. 나중에 사용할 수 있도록 느슨하게 묶어둡니다.

전신 헤파린화를 위해 헤파린 식염수를 음경 정맥에 5분 동안 주입하십시오. 이 애니메이션은 카테터 삽입 과정을 보여줍니다. 먼저, 6-0 실크 봉합사를 간외문맥 아래에 배치한 다음, 26 gauge 카테터를 문맥에 삽입하고 클램프로 고정하십시오.

카테터를 고정하고 비정맥과 장간막정맥으로부터의 혈류를 차단하기 위해 미리 배치한 봉합사를 결찰합니다. 여기에서 수술 절차를 시연하겠습니다. 바늘이 달린 26 gauge 카테터를 삽입합니다.

카테터를 더 깊숙이 삽입하면서 동시에 바늘을 천천히 뺍니다. 클램프를 사용하여 카테터를 고정합니다. 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 카테터를 헤파린 식염수로 완전히 채웁니다.

연장 튜브를 카테터에 연결하고 단단히 고정합니다. 퍼퓨전 펌프를 켭니다. 0.4 milliliter per minute의 유속으로 헤파린 식염수 퍼퓨전을 시작합니다.

관류 직후 우엽이 창백해지는 것을 확인하십시오. 전체 관류 과정 동안 간이 촉촉하게 유지되도록 식염수로 헹구어 줍니다. 마취 상태에서 관류를 통한 방혈로 마우스를 안락사시킵니다.

전체 간이 창백해질 때까지 몇 분 동안 헤파린 관류를 계속합니다. Microfil 관류 전에, 중합 과정을 가속화하기 위해 준비된 Microfil 화합물에 경화제 0.1 milliliter를 첨가합니다. Microfil 화합물을 5 milliliter 주사기와 연장 튜브에 충전합니다.

이전과 동일하게 카테터에 헤파린 식염수를 주입하여 공기 방울을 제거합니다. 튜브를 카테터에 연결하고 단단히 고정합니다. 0.2 mL/min의 유속으로 약 1~2분 동안 Microfil 주입을 시작합니다.

파란색 약제가 간문맥 분지로 천천히 퍼지는 것을 관찰하십시오. 빨간색 원으로 표시된 것과 같이 각 간엽의 표면에 파란색 혈관 구조가 나타나면 관류를 중단하십시오. Microfil 화합물의 중합 반응을 위해 간을 최소 15분 동안 그대로 두십시오.

Microfil 주입, 간정맥계. 이 절차는 기본적으로 문맥계 주입과 동일한 단계를 따릅니다. 간외 문맥의 분지점으로부터 약 1mm 거리의 하단에 6-0 silk 봉합사를 배치하십시오.

그 다음 문맥(portal vein)에 카테터를 삽입하고 클램프로 고정합니다. 하대정맥(inferior vena cava)에도 또 다른 카테터를 삽입하고 마찬가지로 클램프로 고정합니다. 카테터를 고정하고 비정맥(splenic vein)과 장간막정맥(mesenteric vein)으로부터의 혈류를 차단하기 위해 미리 배치한 봉합사를 결찰합니다.

간의 유출을 차단하기 위해 간상하대정맥에 클램프를 설치합니다. 양측 신정맥과 하대정맥 원위부를 포함한 하대정맥의 분지들을 결찰합니다. 카테터 1을 통해 헤파린 식염수로 간을 세척합니다.

카테터 2를 통해 Microfil 화합물로 간정맥계를 관류합니다. 결과는 Micro CT 재구성 이미지입니다. Micro CT 스캐닝 후 Imalytics 전임상 소프트웨어를 사용하여 3D 혈관 재구성 영상을 얻었습니다.

문맥 및 간정맥 시스템 모두에서 혈관 재생은 주요 혈관 구조의 신장 및 확장과 더불어 더 작은 혈관들의 분지 형성으로 나타났습니다. 수술 후 2일째에 잔존 엽의 혈관수가 신장되었습니다. 수술 후 7일째에는 동일한 주요 문맥과 간정맥에서 추가적인 작은 분지들이 관찰되었습니다.

결과, 간 혈관 트리 및 그에 따른 간 구역의 3D 색상 코드 재구성. HepaVision을 통한 색상 코드 재구성 후, 모든 3차원 상에서 각 간엽을 쉽게 시각화할 수 있었습니다. 표에 나타낸 바와 같이, 정상 간의 간정맥 시스템에 대해 전체 간 및 각 간엽의 간 부피가 결정되었으며, 그 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

결과, 연속 절편 및 재구성. 한편, 포르말린으로 고정된 Microfil 샘플을 연속 절편화하였다. 염색된 연속 절편은 전슬라이드 스캐너를 사용하여 디지털화되었으며, 두 시스템의 혈관망 재구성에 사용되었다.

이는 강체 및 탄성 등록 전후의 마우스 간 연속 절편 스택의 횡단면입니다. 컴퓨터 등록 후에는 문맥 및 간정맥 시스템을 단일 3D 모델로 재구성할 수 있습니다. 수동 및 계산적으로 시간이 많이 소요되는 이 단계는 추가적인 최적화가 필요합니다.

다음 단계인 혈관 트리와 관련한 분자적 사건의 공간적 분포 시각화는 현재 개발 중입니다. 이 단계는 조영 처리된 혈관 트리에서 얻은 Micro CT 정보와 조직학적 정보를 융합하거나, 순수하게 조직학적 정보만을 3D로 시각화하는 방식으로 구상될 수 있습니다. 이 경우, Micro CT 정보는 까다로운 조직학 기반의 3D 재구성 과정에서 품질 관리 수단으로 활용될 것입니다.

이를 달성하면 간 재생을 더 효과적으로 조사할 수 있는 도구를 갖게 됩니다. 특히 분자적 사건의 공간적 분포와 혈관 재생과 관련된 간 실질을 조사하는 데 유용합니다.