Name: 일반 마우스의 70 % 부분 간 절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 학습하세요 마우스 부분 간 절제술 후 혈관 재생을 시각화하는 방법을. µCT와 3D 재구성을 활용하여 간 재생에서 혈관 성장을 정량 분석하는 기술을 익히세요.

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저자는 시스템 생물학 네트워크 "Virtual Liver"를 통해 독일 교육 연구부(BMBF)의 자금 지원을 인정하며, 보조금 번호 0315743(ExMI), 0315765(영국 예나), 0315769(MEVIS)를 수여합니다. 저자는 또한 기술 지원에 대해 Frank Schubert에게 감사를 표합니다.

동물 주제와 관련된 절차 링거 Landesamt 대 Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit 싶게 Tierschutz, 독일에 의해 승인되었습니다. 포털 정맥 시스템이 간 정맥 시스템과 별도로 가시화 되었기 때문에, 별도의 동물은 다른 혈관 나무를 위해 필요했다. 1. 시약 준비 <ol><li> 헤파린 생리 식염수 용액 <ol><li> 10 ㎖의 식염수 (5 IU / ㎖)에 0.1 ml의 헤파린을 추가합니다. </li></ol></li><li> 실리콘 화합물의 혼합물을 <ol><li> 한 5 ML 튜브에 2 ml의 MV-120을 추가합니다. 40 % 용액 3 ㎖ 결과 MV 희석제를 첨가하여 MV-120 희석. </li></ol></li></ol> 2. 포털 정맥 시스템 실리콘 주입 <ol><li> 개복술 <ol><li> 마취 유도 챔버에 마우스를 넣고, 2 % 이소 플루 란 0.3 L / 분의 산소를 마취시키다. </li><li> 2 %는의 연속 흡입으로 테이프를 사용하여 운영 테이블에 마취 마우스를 수정oflurane 0.3 L / 분 산소. 마우스의 발가락 - 핀치 철수 반사를 확인하고 반사가없는 경우 작업을 시작합니다. </li><li> 표피층과 근육층위한 전기 coagulator 용 가위를 이용하여 복부에 횡 절개를. 코튼 팁을 사용하여 왼쪽에 장내를 이동하고 식염수를 적신 거즈로 장을 다룹니다. </li></ol></li><li> 카테터 삽입 <ol><li> 마이크로 집게를 사용하여 현미경 포털 정맥을 해부하다. 그 분기에 약 1mm 거리에서, 간외 문맥 아래 하나의 6-0 실크 봉합사를 놓고 나중에 사용하기 위해 느슨하게을 묶어. </li><li> 5 분 동안 전신 헤파린에 대한 음경 정맥 (남성)을 통해 제조 된 헤파린 생리 식염수 용액 또는 (여성) 하대 정맥 주입한다. </li><li> 포털 정맥에 26 게이지 바늘 (26 G) 카테터를 삽입하고 클램프로 고정 </li></ol></li><li> 헤파린 염수 용액 및 실리콘 화합물 관류 <ol><li> 로드 헤파린 생리 식염수 졸5 ML의 주사기에서의 ution 및 관류 장치의 전원을 켭니다. 공기 방울을 방지하기 위해 헤파린 식염수로 완전히 카테터를 채운다. </li><li> 카테터로 확장 튜브를 연결하고 단단히을 수정합니다. / 분 0.4 ML의 관류 속도 헤파린 생리 식염수 관류를 시작합니다. </li><li> 더블 카테터를 고정하고 비장 정맥 및 장간막 정맥에서 혈액의 흐름을 차단하기위한 결찰 사전 배치 6-0 실크 봉합사. 마취 관류를 통해 방혈하여 마우스를 Euthanatize. </li><li> 습윤을 유지하기 위해 전체 재관류 과정 중에 염수를 사용하여 간을 헹군다. </li><li> 뮤직 비디오-120 튜브에 경화제 0.1 ML을 추가합니다. 실리콘 주사기에 헤파린 생리 식염수 주사기를 변경합니다. </li><li> 도관 시스템을 미리 기입하고, 문맥 시스템을 채우기 위해 약 1 분 동안 0.2 ㎖ / 분의 재관류 속도 실리콘 관류 시작. 표면의 혈관이 푸른 켤 때 실리콘 관류를 중지합니다. </li></ol></li><li> 견본 추출 <ol><li> 원위치 UNT 간 유지위원장 실리콘은 완전히 후 약 15 분 ~ 30 중합된다. 그대로 간을 유지하기 위해주의 간 및 인접 기관을 연결하는 인대를 해부하다. 간을 이식편 및 고정을 위해 포르말린에 넣어. </li></ol></li></ol> 3. 간 정맥 시스템 실리콘 주입 <ol><li> 단계 2.1에서 수행으로 개복술을 수행하고 완벽하게 작동 필드를 노출. </li><li> 카테터 삽입 <ol><li> 마이크로 집게를 사용하여 현미경 포털 정맥을 해부하다. 그 분기에 약 1mm 거리에서, 간외 문맥 아래 하나의 6-0 실크 봉합사를 놓고 나중에 사용하기 위해 느슨하게을 묶어. </li><li> 5 분 동안 전신 헤파린에 대한 음경 정맥 (남성)을 통해 제조 된 헤파린 생리 식염수 용액 또는 (여성) 하대 정맥 주입한다. </li><li> 포털 정맥에 바늘 하나 26 G 카테터 (도관 1)를 삽입하고 클램프로 고정합니다. 하대 정맥에 바늘로 다른 26 G 카테터 (도관 2)를 삽입하고 클램프로 고정. </li><li> 6-0 합성, 모노 필라멘트, 비 흡수성 폴리 프로필렌 봉합사를 사용 (왼쪽 및 오른쪽 신장 정맥 포함) 하대 정맥과 그 선단의 가지를 결찰. </li></ol></li><li> 헤파린 염수 용액 및 실리콘 화합물 관류 <ol><li> 5 ML의 주사기에 헤파린 생리 식염수 솔루션을로드하고 관류 장치의 전원을 켭니다. 공기 방울을 방지하기 위해 헤파린 생리 식염수 용액으로 완전히 카테터 1을 입력합니다. 카테터 1로 확장 튜브를 연결하고 단단히 고정합니다. / 분 0.4 ML의 속도로 헤파린 생리 식염수 관류를 시작합니다. </li><li> 더블 카테터를 고정하고 비장 정맥 및 장간막 정맥에서 혈액의 흐름을 차단하기위한 결찰 사전 배치 6-0 실크 봉합사. 마취 관류를 통해 방혈하여 마우스를 Euthanatize. </li><li> 습윤을 유지하기 위해 전체 재관류 과정 중에 염수를 사용하여 간을 헹군다. 뮤직 비디오-120 튜브에 경화제 0.1 ML을 추가합니다. 교환 헤파린 생리 식염수 실리콘 주사기와 주사기입니다. </li><li> suprahepat에 클램프를 놓습니다IC에서 하대 정맥은 간의 유출을 방해합니다. </li><li> (2) 카테터 및보고 객관적으로 간 혈관 볼륨에 도달하기 위해 약 2 분 동안 0.2 ㎖ / min의 관류 속도 실리콘 관류를 시작합니다 확장 튜브를 연결합니다. 표면의 혈관이 푸른 켤 때 실리콘 관류를 중지합니다. </li></ol></li><li> 견본 추출 <ol><li> 간 어떤 부상을 방지 간 인대를 해부하다. 간을 이식편 및 고정을 위해 포르말린에 넣어. </li></ol></li></ol> 4. 마이크로 CT (μCT) 검색 μCT를 사용하여 외식 간 샘플을 검사하려면 다음 단계가 필요합니다. <ol><li> 고정 솔루션에서 간 샘플을 가져 가라. μCT 침대에 간을 놓습니다. μCT에 간 샘플로 μCT 침대를 넣습니다. </li><li> 스캔을 시작하기 전에 topogram 획득. 작은 간 샘플에 대한 하나의 서브 스캔 및 대형 샘플이 subscans를 사용합니다. </li><li> 선택81; 고분해능 CT 프로토콜 (예를 들어,의 HQd-6565-390-90). 이 프로토콜은 부 주사 당 90 초 스캔 시간 하나의 완전한 회전 동안 1032 X 1012 픽셀을 가진 돌출부 (720)를 취득한다. μCT 검사를 시작합니다. </li></ol> 5. 조직 학적 직렬 섹션 <ol><li> μCT 검사 후 전체 파라핀에 간 표본을 포함. 2,000 2,500 섹션의 일련의 결과가 4μm 부에 파라핀 전체 샘플을 잘라. </li><li> 적절한 염색 기술로 얼룩 부분은 허혈성 손상의 마커로 확산 마커 및 HMGB1 같은 기-67와 같은 관심의 분자 이벤트를 시각화합니다. 과학적 질문에 관련하여 염색의 순서를 결정합니다. </li><li> 스테인드 섹션을 디지털화하기 위해 전체 슬라이드 스캐너를 사용합니다. </li><li> (이미 가능) 혈관 트리 (들)의 3 차원 재구성을 수행하고 혈관 트리 (진행중인 연구)에 대한 분자 이벤트의 3D 분포를 시각화. </li></ol>

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<li>Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+vasculature+for+liver+surgical+planning%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.Med.Imaging%22%5BJournal%5D)">Analysis of vasculature for liver surgical planning.</a> IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).</li>
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<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+and+imaging+techniques+to+study+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration.</a> Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).</li>
<li>Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

실리콘 주입 및 μCT 검사에 의한 혈관 트리를 대조하는 혈관 신생 진행 5,7,8,10을 연구하기 위해 자주 종양 모델 및 신경 질환 모델에서 도입되었습니다. 실리콘 주입 방법의 개선 시각화 및 마우스에서 부분 간 절제술 후 혈관 성장을 정량화하기위한 본 연구에서 이루어졌다. 관류 좋은 품질을 달성하기 위해주의를 기울여야하는 중요한 단계가 있습니다. 우선 전신 헤파린 매우 간 내부 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린 또는 식염수 간을 세척하기 전에 권장한다. 튜브로부터의 기포의 제거는 실리콘 관류 좋은 품질을 달성하기 위해 중요하다. 혈류 속도 및 압력의 결정은 제 생리 혈역학 17에 기초한다. 재관류 시간이 주입 된 총 체적을 반사하고 예상 혈관 촬영 추정볼륨 및 계정에 카테터 미리 입력 시스템의 볼륨. 실리콘 혈액 또는 식염수 상이 고점도 화합물이다. 따라서, 여러 가지 실험은 혈류...

간 재생 종종 간 중량 및 부피의 증가를 측정하여 상기 간세포 증식 속도 (16)를 평가함으로써 결정된다. 그러나, 간 재생은 실질 재생뿐만 아니라 혈관 재생 (6)을 유도한다뿐만 아닙니다. 따라서, 혈관 성장은 더 간 재생의 진행에서의 역할에 대해 조사해야합니다. 간장 혈관 시스템의 시각화는 혈관 재생에 대한 우리의 이해를 발전에 매우 중요합니다. 다수의 간접 방법 간 혈관 재생의 기본 분자 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었다. 전통적으로, 사이토 카인의 검출 (VEGF 혈관 내피 성장 인자) 14 길항 (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12)는 4 혈관 재생을 연구 대들보왔다. 그러나 혈관의 정량 분석​​과 함께 3 차원 모형 중요한 해부학을 추가정보는 간 실질 혈관 재생의 중요한 관계를 더 잘 이해한다. 혈관 나무 대조 필요 간 혈관계를 시각화 생쥐 직접 포털 또는 간 정맥 혈관 트리에 방사선 불 투과성이 실리콘 고무 조영제 주입 하였다. 실리콘 및 기관의 외식 중합 후 간 샘플을 CT 스캐너를 이용 μCT 스캐닝을 실시한다. 스캔은 복셀 이미지 표현 초래 실리콘 주입 9를 표본. 품질 관리, 혈관계 먼저 전임상 소프트웨어를 이용하여 3 차원으로 시각화 하였다. 세분화 연조직 강도와 용기의 강도 사이의 임계 값을 설정하여 수행 하였다. 그 결과 혈관 마스크 표면 렌더링을 사용하여 시각되었습니다. 이 소프트웨어는 또한 vascul의 두 개의 매개 변수를 수동으로 측정을 위해 허용아칸소 성장 : 최대 선박 길이와 반경. 전임상 소프트웨어는 다음 3 차원 혈관 나무 재와, 공급 또는 배출 혈관 영역 (13)의 후속하는 계산을 위해 사용 하였다. 또한,이 소프트웨어는 자동적으로 또한 전체 가장자리 길이 또는 총 용기 체적으로 알려진 모든 보이는 혈관 구조의 전체 길이와 같은 혈관 성장의 특정 파라미터를 결정했다. 실리콘 관류 절차 나이브 마우스의 70 % 부분을 절제 (PH)를받은 마우스에서 수행 하였다. 간은 상기 시각화 및 정량화 기술을 이용하여 혈관 및 간 실질 재생을 분석 절제술 후 다른 관찰 시점에서 수집 하였다. (1) 최적의 대조 및 (2)의 잠재적 이점 얻어진 FR 표시를 달성하기 위해 필요한 섬세한 주입 기법을 설명이 영화의 주요 목표는 다음μCT 및 조직 학적 시리얼 섹션을 사용하여 생성 된 시편의 톰 상세한 분석. 영화를 시청 한 후, 판독기는 특정의 혈관계 내로 기술의 유용성 및 적용 성 실리콘 화합물을 주입하는 방법을 더 잘 이해한다.

<table><tbody><tr><td>퍼퓨저&reg; VI</td><td>B.BRAUN</td><td>87 222/0</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus&reg;-akku</td><td>Hirschmann</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>Pipets</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>파인 사이언스 도구 (F&middot; S&미드닷; L)</td><td>No. 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&미드닷; L)</td><td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 클램프 애플리케이터</td><td>파인 사이언스 툴 (F&middot; S&미드닷; L)</td><td>No. 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 마이크로 펜치</td><td>파인 사이언스 도구 (F&middot; S&미드닷; L)</td><td>No. 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 마이크로 펜치</td><td>파인 사이언스 도구 (F&middot; S&미드닷; L)</td><td>No. 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&미드닷; L)</td><td>No. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>B.Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 주사기</td><td>B.Braun</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>연장 및 연결 선</td><td>B.Braun</td><td>4256000</td><td>30 cm, 내부 &oslash; 1.2 mm</td></tr><tr><td>6-0 실크 (Perma-Hand Seide)</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Ethicon</td><td>8711H</td><td></td></tr><tr><td>마이크로필&reg; MV 희석제</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; MV - 120</td><td>FLOW TECH, INC</td><td>MV - 120 (파란색)</td><td></td></tr><tr><td>MV 경화제</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin 2500 I.E./5 ml</td><td>Rotexmedica</td><td>ETI3L318-15</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td>E15117/D DE</td><td></td></tr><tr><td>Imalytics 전임상 소프트웨어</td><td>실험 분자 이미징, RWTH 아헨 대학교, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaVision</td><td>Fraunhofer MEVIS, 브레멘, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0-HT&nbsp; 디지털 슬라이드 스캐너</td><td>Hamamatsu Electronic Press, 일본&nbsp;</td><td>C9600</td><td></td></tr><tr><td>토모스코프 듀오 CT&nbsp;</td><td>CT Imaging GmbH, 독일 에를랑겐</td><td>TomoScope&reg; &nbsp; 시너지</td><td></td></tr></tbody></table>

일반 마우스의 70 % 부분 간 절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

변성 실리콘 주입 절차는 간 혈관 트리 시각화 하였다. 이 절차는 포털 또는 간정맥으로, 26 G 카테터를 통해 실리콘 화합물의 생체 내 주입으로 구성되었다. 실리콘 주입 한 후, 기관은 외식하고 전 생체 마이크로 CT (μCT) 스캔 준비했다. 실리콘 주입 과정은 기술적으로 어려운 것이다. 성공적인 결과를 달성하는 것은 외과 의사에서 광범위한 미세 수술 경험이 필요합니다. 이 절차의 과제 중 하나는 실리콘 화합물에 대한 적절한 관류 레이트를 결정하는 것을 포함한다. 실리콘 화합물의 혈류 속도는 관심 혈관계의 혈류 역학에 기초하여 정의 될 필요가있다. 부적절한 관류 속도는 혈관 나무의 불완전 관류, 인공 팽창 및 파열로 이어질 수 있습니다. 혈관 시스템의 3 차원 재구성 CT 스캔을 기반으로하고 사용하여 달성되었다이러한 HepaVision으로 전임상 소프트웨어. 재구성 된 혈관 트리의 품질을 직접 실리콘 관류의 품질과 관련되었다. 이러한 총 혈관의 볼륨으로의 혈관 성장을 표시해서 산출 혈관 파라미터, 혈관 재구성에 기초하여 산출 하였다. μCT 검사 후 시편의 후속 조직 학적 작업 업에 허용 된 실리콘과 혈관 트리를 대조. 시편 직렬 단면 조직 학적 분석 및 전체 슬라이드 스캔을 실시하고, 그 후 학적 영상에 기초한 혈관 나무의 3D 재구성을 할 수있다. 이것은 분자 이벤트 탐지 및 혈관 트리에 대하여, 그 분포를위한 필수 조건이다. 이 변성 실리콘 주입 과정을 시각화 또한 다른 장기의 혈관 시스템을 재구성 할 수있다. 이 기술은 광범위하게 다양한 전위 동물 A의 혈관 해부학 및 성장에 관한 연구에 적용되어야차 질환 모델.

품질 기준 실리콘 주입 품질 절차 중에 육안으로 판단 할 수있다. 간 표면에 작은 혈관 푸른 화합물로 점진적으로 입력합니다. 정상 혈관 구조 간 표면에서 관찰하면, 실리콘 고무 사출 품질이 양호 하였다. 관류 량이 불충분하면, 간 표면에 작은 용기는 완전히 충전되지 않았다. 장기의 표면에 요철 푸른 반점으로 나타낸 바와 같이 반대로 충전물 혈관 파열을 일으켰다. 모두 3 차원 재구성 궁극적 절차 실패를 렌더링 할 때 어려움을 일으키는 원인이된다. 사출 품질보다 나은 평가를 위해 임상 소프트웨어를 이용하여 3 차원 혈관 재구성 하였다 μCT 스캐닝을 수행 하였다. 사출 성공적 WH로 측정되었다분할 도중 눈에 보이는 혈관 외...

혈관 재생을 시각화하는 데 사용되는 도구에는 혈관 나무를 대조하는 방법이 필요합니다. 이 필름은 혈관 나무의 최적 대비를 달성하는 데 사용되는 섬세한 주입 기술을 보여주고 μCT 및 조직학적 연속 절편을 사용하여 결과 표본의 자세한 분석으로 인한 잠재적 이점을 설명했습니다.

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

정상 생쥐에서 70% 부분 간 절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화. 전통적으로 간 재생은 간 무게와 부피의 증가를 측정하거나 간세포 증식률을 결정함으로써 평가합니다. 최근 저희는 생쥐의 혈관성 간 재생에 관심을 가지고 있으며, 혈관 성장을 시각화하고 정량화하고자 합니다.따라서, 혈관 재생 이미징을 위한 워크플로우를 설정합니다. 이 워크플로우는 혈관망 조영, CT 스캔 획득, 3D 재구성, 그리고 결과 이미지의 정량적 및 정성적 분석의 네 단계로 구성됩니다. 워크플로우는 혈관망 조영부터 시작됩니다.먼저 정상 간 또는 절제된 간을 노출시킨 다음, 관심 있는 혈관 체계에 따라 문맥 또는 간정맥에 중합성 실리콘 조영제를 주입합니다. 다음으로, 적출된 간을 MicroCT로 스캔합니다. 스캔 후에는 Imalytics 전임상 소프트웨어를 사용하여 3D 혈관 재구성을 수행합니다.결과 이미지의 기술적 품질이 충분하다면, HepaVision을 사용하여 3D 재구성을 수행할 수 있습니다. 이 프로그램은 임상에서 간담도 수술 계획을 세우는 데 사용됩니다. 이 프로그램은 혈관망의 3D 시각화뿐만 아니라, 공급 및 배출 혈관을 기반으로 전체 간 및 각 엽의 간 부피를 시각화하고 계산할 수 있게 해줍니다.재구성 후에는 계산 기법을 활용하여 특정 혈관의 길이 및 직경과 같이 혈관 성장을 나타내는 추가 매개변수를 결정할 수 있습니다. 이를 통해 혈관 성장에 대한 정량적 기술이 가능해집니다. 한편, 포르말린으로 고정한 Microfil 샘플은 연속 절편으로 제작하여 절단할 수 있습니다.연속 절편은 염색 후 전슬라이드 스캐너를 사용하여 디지털화할 수 있습니다. 연속 절편의 강체 및 탄성 등록을 거치면, 문맥 및 간정맥 시스템 모두의 3D 혈관수를 재구성할 수 있습니다. 향후 단계에서는 분자적 사건의 공간적 분포를 탐색하고자 합니다.간 재생 과정에서 주목할 만한 분자적 사건의 한 예는 간세포 핵 내 증식 마커 Ki-67의 출현과 3D 재구성된 혈관 나무에서의 공간적 분포입니다. 다음으로, Microfil 주입법을 수행하는 방법에 대해 자세히 소개하겠습니다. 시약 준비 단계입니다.Microfil 화합물 혼합물을 위해 MV 희석액, MV 화합물(본 실험에서는 청색 MV-120) 및 경화제가 필요합니다. 또한 피펫, 튜브 및 피펫터가 필요합니다. 5 mL 튜브 하나에 MV-120 2 mL를 준비합니다.그 다음 MV 희석액 3 mL를 첨가하여 희석합니다. 부드럽게 흔들어 섞어 줍니다. 헤파린 식염수의 경우, 식염수 10 mL에 헤파린 1 mL를 첨가합니다.수술대 준비 단계입니다. 먼저 현미경이 필요하며, 다음으로 일련의 소모품이 필요합니다. 6-0 silk 및 6-0 polypropylene 봉합사, 5 mL 및 1 mL 주사기, 30 gauge 및 21 gauge 바늘, 주사기와 카테터 연결용 연장 튜브, 바늘이 삽입된 26 gauge 카테터, 면봉 및 거즈를 준비합니다.셋째, 수술 도구가 필요합니다. 미세 수술 도구, 클램프 및 전기 응고기가 필요합니다. 넷째, 관류 펌프가 필요합니다.동물 준비. 마우스 인덕션 챔버에 마우스를 넣고 2% isoflurane과 분당 0.3 milliliter 산소로 마취시킵니다. 2% isoflurane과 분당 0.3 milliliter 산소를 지속적으로 흡입시키면서, 마취된 마우스를 테이프를 사용하여 수술대 위에 고정합니다.Microfil 주입, 문맥계. 피부층에는 가위를, 근육층에는 전기 응고기를 사용하여 복부를 횡단 절개합니다. 면봉을 이용해 장을 왼쪽으로 밀어내고 식염수에 적신 거즈로 장을 덮어줍니다.현미경 하에서 문맥을 박리합니다. 간외 문맥의 분지점에서 약 1 mm 거리의 하단에 6-0 실크 봉합사를 배치합니다. 나중에 사용할 수 있도록 느슨하게 묶어둡니다.전신 헤파린화를 위해 헤파린 식염수를 음경 정맥에 5분 동안 주입하십시오. 이 애니메이션은 카테터 삽입 과정을 보여줍니다. 먼저, 6-0 실크 봉합사를 간외문맥 아래에 배치한 다음, 26 gauge 카테터를 문맥에 삽입하고 클램프로 고정하십시오.카테터를 고정하고 비정맥과 장간막정맥으로부터의 혈류를 차단하기 위해 미리 배치한 봉합사를 결찰합니다. 여기에서 수술 절차를 시연하겠습니다. 바늘이 달린 26 gauge 카테터를 삽입합니다.카테터를 더 깊숙이 삽입하면서 동시에 바늘을 천천히 뺍니다. 클램프를 사용하여 카테터를 고정합니다. 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 카테터를 헤파린 식염수로 완전히 채웁니다.연장 튜브를 카테터에 연결하고 단단히 고정합니다. 퍼퓨전 펌프를 켭니다. 0.4 milliliter per minute의 유속으로 헤파린 식염수 퍼퓨전을 시작합니다.관류 직후 우엽이 창백해지는 것을 확인하십시오. 전체 관류 과정 동안 간이 촉촉하게 유지되도록 식염수로 헹구어 줍니다. 마취 상태에서 관류를 통한 방혈로 마우스를 안락사시킵니다.전체 간이 창백해질 때까지 몇 분 동안 헤파린 관류를 계속합니다. Microfil 관류 전에, 중합 과정을 가속화하기 위해 준비된 Microfil 화합물에 경화제 0.1 milliliter를 첨가합니다. Microfil 화합물을 5 milliliter 주사기와 연장 튜브에 충전합니다.이전과 동일하게 카테터에 헤파린 식염수를 주입하여 공기 방울을 제거합니다. 튜브를 카테터에 연결하고 단단히 고정합니다. 0.2 mL/min의 유속으로 약 1~2분 동안 Microfil 주입을 시작합니다.파란색 약제가 간문맥 분지로 천천히 퍼지는 것을 관찰하십시오. 빨간색 원으로 표시된 것과 같이 각 간엽의 표면에 파란색 혈관 구조가 나타나면 관류를 중단하십시오. Microfil 화합물의 중합 반응을 위해 간을 최소 15분 동안 그대로 두십시오.Microfil 주입, 간정맥계. 이 절차는 기본적으로 문맥계 주입과 동일한 단계를 따릅니다. 간외 문맥의 분지점으로부터 약 1mm 거리의 하단에 6-0 silk 봉합사를 배치하십시오.그 다음 문맥(portal vein)에 카테터를 삽입하고 클램프로 고정합니다. 하대정맥(inferior vena cava)에도 또 다른 카테터를 삽입하고 마찬가지로 클램프로 고정합니다. 카테터를 고정하고 비정맥(splenic vein)과 장간막정맥(mesenteric vein)으로부터의 혈류를 차단하기 위해 미리 배치한 봉합사를 결찰합니다.간의 유출을 차단하기 위해 간상하대정맥에 클램프를 설치합니다. 양측 신정맥과 하대정맥 원위부를 포함한 하대정맥의 분지들을 결찰합니다. 카테터 1을 통해 헤파린 식염수로 간을 세척합니다.카테터 2를 통해 Microfil 화합물로 간정맥계를 관류합니다. 결과는 Micro CT 재구성 이미지입니다. Micro CT 스캐닝 후 Imalytics 전임상 소프트웨어를 사용하여 3D 혈관 재구성 영상을 얻었습니다.문맥 및 간정맥 시스템 모두에서 혈관 재생은 주요 혈관 구조의 신장 및 확장과 더불어 더 작은 혈관들의 분지 형성으로 나타났습니다. 수술 후 2일째에 잔존 엽의 혈관수가 신장되었습니다. 수술 후 7일째에는 동일한 주요 문맥과 간정맥에서 추가적인 작은 분지들이 관찰되었습니다.결과, 간 혈관 트리 및 그에 따른 간 구역의 3D 색상 코드 재구성. HepaVision을 통한 색상 코드 재구성 후, 모든 3차원 상에서 각 간엽을 쉽게 시각화할 수 있었습니다. 표에 나타낸 바와 같이, 정상 간의 간정맥 시스템에 대해 전체 간 및 각 간엽의 간 부피가 결정되었으며, 그 결과가 여기에 표시되어 있습니다.결과, 연속 절편 및 재구성. 한편, 포르말린으로 고정된 Microfil 샘플을 연속 절편화하였다. 염색된 연속 절편은 전슬라이드 스캐너를 사용하여 디지털화되었으며, 두 시스템의 혈관망 재구성에 사용되었다.이는 강체 및 탄성 등록 전후의 마우스 간 연속 절편 스택의 횡단면입니다. 컴퓨터 등록 후에는 문맥 및 간정맥 시스템을 단일 3D 모델로 재구성할 수 있습니다. 수동 및 계산적으로 시간이 많이 소요되는 이 단계는 추가적인 최적화가 필요합니다.다음 단계인 혈관 트리와 관련한 분자적 사건의 공간적 분포 시각화는 현재 개발 중입니다. 이 단계는 조영 처리된 혈관 트리에서 얻은 Micro CT 정보와 조직학적 정보를 융합하거나, 순수하게 조직학적 정보만을 3D로 시각화하는 방식으로 구상될 수 있습니다. 이 경우, Micro CT 정보는 까다로운 조직학 기반의 3D 재구성 과정에서 품질 관리 수단으로 활용될 것입니다.이를 달성하면 간 재생을 더 효과적으로 조사할 수 있는 도구를 갖게 됩니다. 특히 분자적 사건의 공간적 분포와 혈관 재생과 관련된 간 실질을 조사하는 데 유용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 끄 덕의 부분 hepatectomy (PHx) 및 비장을 통해 세포 이식 수행을 위한 프로토콜을 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 쥐. 이 프로토콜에서 절 개 노출 하 고 셀의 intrasplenic 이식에 대 한 또 다른 절 개에 의해 따라 간 좌 엽 resect 이루어집니다.

끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스

여기, 우리 신생아 (0 일) 쥐에서 왼쪽된 간 엽의 부분 절제 하는 새로운 방법을 제시. 이 새로운 프로토콜은 급성 간 상해 및 신생아 속에서 상해 응답 공부 적합 합니다.

부분 Lobular Hepatectomy: Morphologic 간 재생에 대 한 수술 모델

우리 더 vivo에서 부분 간 미래에 엔지니어링을 공부에 대 한 전제 조건으로 쥐에서 vivo에서 단일 간 엽 관류 모델에 대 한 새로운 수술 기법을 설정 합니다.

Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

이 프로토콜은 간 재생의 연구를 가능하게 하기 위하여 성인 얼룩말물고기에 있는 간의 복부 엽을 제거하기 위한 절차를 기술합니다.

성인 얼룩말 피시의 부분 간 절제술

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

이 프로토콜에서는 마우스에서 성공적인 orthotopic 간 이식(OLT) 모델의 구현에 대해 논의합니다. 또한 마우스에서 성공적인 OLT 후 동종이식 개통을 추가로 분석하기 위한 보조제, 특히 microcomputationd tomography(microCT) 스캔을 활용하는 보조제에 대해서도 논의합니다.

Microcomputed Tomography 혈관 조영술을 활용한 마우스의 성공적인 Orthotopic 간 이식

단계적 간절제술(ALPPS)을 위한 간 분할 및 문맥 결찰술의 연관성은 1단계 수술 후 몇 주 후에 놀라운 간 재생을 초래하는 것으로 나타났습니다. ALPPS를 받은 동물 모델은 잠재적인 간 재생 능력을 탐색하고 유리한 임상 결과를 달성하기 위해 개발되었습니다.

현미경 검사의 도움을 받은 병기 간절제술 절차를 위한 연관 간 분할 및 문맥 결찰의 마우스 모델

이 프로토콜은 마우스 orthotopic 간 이식에서 커프 기술을 사용하여 혈관 재건을 위한 기술 정보를 제공합니다.

Mouse Orthotopic Liver Transplantation에서 Cuff Technique을 사용한 혈관 재건

환자 종양에서 생성된 오가노이드를 생쥐 간에 항소적으로 주입합니다. 종양이 없는 간 조직의 절제는 종양이 위치한 간 조직에 재생 환경을 조성합니다.

간 재생이 종양 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 간세포 암 환자 유래 오가노이드 이종이식 모델

부분 2/3(66%) 간절제술의 마우스 모델은 문헌에 잘 설명되어 있지만, 간 이식 후 소형 증후군을 모방한 더 확장된 간절제술은 거의 사용되지 않았습니다. 우리는 건강한 마우스에서 약 50%의 수술 후 치사율을 초래하는 마우스 모델에서 확장된 78% 간 절제술 절차에 대해 설명합니다.

마우스 수술 모델에서 확장된 78% 간절제술

이 프로토콜은 간별 세포 형태를 온전한 간 조직에서 시각화하고 모델링하기 위한 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 이 접근법은 마우스 유전학을 이용한 형광 표 지, 현장 간 관류 기반 조직 준비, 그리고 광학 투명성을 달성하기 위한 수정된 iDISCO 조직 클리어링 방법을 결합합니다.

간 섬유증 마우스 모델에서 간 별형 세포 형태 매핑

학습하세요 마우스 부분 간 절제술 후 혈관 재생을 시각화하는 방법을. µCT와 3D 재구성을 활용하여 간 재생에서 혈관 성장을 정량 분석하는 기술을 익히세요.

일반 마우스의 70 % 부분 간 절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화

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