쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

이 장골 해부 및 골수 분리 절차의 전반적인 목표는 장골을 빠르고 체계적으로 제거하고, 후속 분석을 위해 골수를 수집하는 것입니다. 이 방법은 골수 생물학, 암 전이 및 면역학 관련 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 해부 과정이 빠르고 표준화되어 있으며, 골수 분리 절차가 상당히 무균적으로 이루어진다는 점입니다. 먼저 마우스를 앙와위로 배치하는 것부터 시작하십시오.

그 다음, 발목 관절 아래의 네 발바닥 패드를 모두 핀으로 고정하고 70% ethanol을 분사하여 다리 전체를 충분히 적십니다. 이어서 하복부의 고관절 바로 위, 중앙선 오른쪽으로 작은 절개를 가한 뒤, 절개선을 다리를 따라 발목 관절 너머까지 확장합니다. 피부를 뒤로 젖혀 당깁니다.

그 다음, 대퇴골의 근위단에 고정된 대퇴사두근을 절개하여 대퇴골의 전면을 노출시키고, 핀을 보드에서 45도 각도로 꽂아 근육을 다리 밖으로 고정합니다. 가위로 대퇴골의 후면을 따라 햄스트링을 무릎 관절에서 절개하여 분리합니다. 그런 다음 대퇴골 근위단에 고정된 피부와 햄스트링 근육을 뒤로 젖혀 뼈의 후면을 노출시키고, 핀을 45도 각도로 꽂아 햄스트링 근육을 다리 밖으로 고정합니다.

포셉을 사용하여 무릎 관절 바로 위의 대퇴골 원위단을 잡습니다. 그런 다음 가위 날을 대퇴골 간의 양측으로 하여 고관절 방향으로 안내합니다. 대퇴골두에 도달하면 가위를 비틀어 위쪽 날을 대퇴골두 바로 위로 이동시켜 대퇴골을 탈구시킵니다.

이제 포셉으로 대퇴골 간부의 윗부분을 잡고, 대퇴골두에서 연조직을 절개하여 비구로부터 대퇴골을 분리합니다. 그런 다음 대퇴골, 무릎, 경골을 포함한 다리뼈 전체를 몸 바깥쪽 위로 당기고, 다리를 피부에 부착시키고 있는 결합 조직과 근육을 조심스럽게 절개하여 제거합니다. 모든 결합 조직이 제거되면, 방금 시연한 것처럼 발목 관절을 과신전시킨 후 가위를 비틀어 경골을 탈구시킵니다.

경골의 원위단을 잡고 힘줄이 끊어지지 않도록 주의하면서, 경골을 몸체와 핀 보드에서 바깥쪽으로 당겨 올립니다. 그 다음 무릎 부위의 장골에 부착된 나머지 결합 조직과 대퇴골 및 경골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다. 골수 분리를 위해 장골을 준비하려면, 슬개골이 바깥쪽을 향하고 대퇴골두가 아래쪽을 향하도록 대퇴골을 잡습니다.

무릎 관절을 과신전시키고 가위를 비틀어 대퇴골에서 경골을 탈구시킵니다. 그런 다음 대퇴골과 경골을 연결하고 있는 모든 결합 조직을 제거합니다. 다음으로, 전면이 바깥쪽을 향하고 대퇴골두가 아래쪽을 향하도록 대퇴골을 잡고, 가위를 대퇴골 간부를 따라 상단의 과(condyles) 방향으로 밀어 올립니다.

가위로 부드럽게 앞뒤로 회전시켜 과상돌기, 슬개골 및 골단(epiphysis)을 제거하여 메타피시스(metaphysis)를 노출시킵니다. 그 다음, 포셉, 가위 및 Kimwipes를 사용하여 대퇴골에 붙어 있는 추가적인 근육이나 결합 조직을 제거합니다. 다음으로, 경골의 전면이 바깥쪽을 향하고 발목 끝이 아래쪽을 향하도록 잡습니다.

경골 골단이 온전한 경우, 가위를 경골 간단을 따라 관절융기 쪽으로 밀어 올린 다음, 가위를 앞뒤로 부드럽게 회전시켜 관절융기와 골단을 제거하여 경골 메타피시스(골단판)를 노출시킵니다. 그 다음 시연한 것과 같이 경골에 부착된 추가 근육이나 결합 조직을 제거합니다. 골수를 채취하려면, 먼저 18 gauge 바늘을 0.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브 바닥에 밀어 넣습니다.

그 다음 긴 뼈의 무릎 쪽 끝이 아래로 향하도록 튜브에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 안에 겹쳐 넣고, 마이크로원심분리기를 사용하여 10,000 ×g 이상의 속도로 15초 동안 원심분리합니다. 육안 검사를 통해 골수가 뼈 밖으로 완전히 배출되었는지 확인합니다.

뼈는 흰색으로 보여야 하며, 더 큰 튜브에는 큰 펠릿이 보여야 합니다. 그런 다음 0.5 milliliter 마이크로원심분리기 튜브에 있는 뼈를 폐기하고, 원하는 후속 분석에 적합한 용액에 골수를 현탁합니다. 이 신속한 해부 기법은 조직 형태 측정법 및 조직학을 포함한 여러 후속 분석에 적합합니다.

실제로, 이 대표적인 조직 형태 측정 micro-CT 3D 재구성 영상에서 알 수 있듯이, 해면골과 피질골 껍질이 모두 유지되어 골 조직 형태 측정에 필요한 표준화된 구조적 파라미터를 정확하게 정량화할 수 있습니다. H and E 염색을 거쳐 고정 및 탈회된 경골의 이 대표적인 조직 절편에서는, 조직학적 분석을 위한 석회화된 뼈와 세포성 골수의 무결성이 모두 유지된 것을 관찰할 수 있습니다. 또한, 이 절차를 통해 분리된 골수는 파골세포 또는 조골세포의 일차 세포 배양을 포함한 많은 후속 응용 분야에 적합합니다.

숙달되면, 적절하게 수행했을 때 긴 뼈 해부부터 골수 분리까지 약 7분 만에 기술을 완료할 수 있습니다. 절차를 수행하는 동안, 해부가 용이하도록 마우스의 위치를 잡는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 절차 이후에 FACS 또는 기타 단일 세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 골수 세포 집단의 변화에 관한 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 마우스의 긴 뼈를 빠르게 해부하고 원심분리를 통해 골수를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.