Name: 쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 배우세요 쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 원심분리를 이용한 골수 격리 기법을 통해 뼈와 골수의 무결성을 유지하며 7분 내에 완료할 수 있는 신속하고 표준화된 방법입니다.

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이 작업은 NCI 보조금 번호 U54CA143803, CA163124, CA093900 및 K.J.P.에 대한 CA143055의 지원을 받았습니다. 저자는 Weilbaecher 연구실의 전현직 구성원, 특히 Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla, Hongju Deng과 Brady Urological Institute의 구성원, 특히 원고를 비판적으로 읽어준 Pienta 실험실의 구성원에게 감사를 표합니다.

모든 동물 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 요약된 권장 사항에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 뒷다리 긴 뼈 해부
<ol>
	<li>기관 지침에 따라 쥐를 안락사시킵니다.</li>
	<li>마우스를 누운 자세로 놓고 발목 관절 아래의 마우스 발 패드를 통해 네 다리를 모두 고정하여 부착합니다.</li>
	<li>마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 다리를 완전히 적십니다.</li>
	<li>엉덩이 바로 위의 하복부 정중선 오른쪽으로 작게 절개합니다.</li>
	<li>절개 부위를 다리 아래로 뻗어 발목 관절을 지나갑니다.</li>
	<li>피부를 뒤로 당기고 대퇴골 근위 끝에 고정된 대퇴사두근을 절단하여 대퇴골의 앞쪽을 노출시키고 다리에서 핀을 빼내어 핀을 보드에서 45도 각도로 배치합니다.</li>
	<li>가위의 칼날을 대퇴골 뒤쪽에 대고 햄스트링을 무릎 관절에서 잘라냅니다.</li>
	<li>대퇴골의 근위부 끝에 고정된 피부와 햄스트링 근육을 뒤로 당겨 대퇴골의 뒤쪽을 노출시키고 다리에서 핀을 빼내고 핀을 보드에서 45도 각도로 배치합니다.</li>
	<li>겸자로 무릎 관절 바로 위에 있는 대퇴골의 말단부를 잡습니다. 대퇴골 샤프트 양쪽에 있는 가위의 날을 고관절 쪽으로 안내하고 대퇴골 자체가 절단되지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>가위가 약간 열리는 것으로 표시된 대퇴골두에 도달한 후 가위의 상단 날이 대퇴골두 바로 위로 이동하여 대퇴골두 아래의 뼈가 부러지지 않도록 주의하면서 가위를 비틀어 대퇴골을 탈구시킵니다.</li>
	<li>집게로 대퇴골 샤프트의 상단을 잡고 대퇴골두에서 연조직을 잘라내어 비구에서 분리합니다.</li>
	<li>대퇴골, 무릎, 경골을 포함한 다리 뼈 전체를 몸에서 위로 당겨 다리와 피부를 연결하는 결합 조직과 근육을 조심스럽게 잘라냅니다.</li>
	<li>발목 관절을 과도하게 펴고 다시 가위를 비틀어 경골을 탈구합니다.</li>
	<li>경골의 말단 끝을 잡고 힘줄이 끊어지지 않도록 주의하면서 경골을 위로 당겨 몸체와 핀 보드에서 분리합니다.</li>
	<li>긴 뼈를 무릎 부분의 마우스에 부착하는 남아 있는 결합 조직을 잘라냅니다.</li>
	<li>대퇴골과 경골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다.</li>
	<li>뼈가 손상되지 않은 상태로 유지되어야 하는 모든 응용 프로그램(조직학, 조직 형태 측정, 생체 역학 테스트 등)의 경우 표준 사내 프로토콜(4-7 참조)을 진행하십시오. 골수를 분리하려면 섹션 2로 진행하십시오.</li>
</ol>
2. 골수 분리를 위한 긴 뼈 준비
<ol>
	<li>겸자를 사용하여 슬개골이 반대쪽을 향하고 근위부 끝(대퇴골두)이 아래로 향하도록 대퇴골을 잡습니다.</li>
	<li>무릎 관절을 과도하게 펴고 가위를 비틀어 경골과 대퇴골을 탈구시킵니다.</li>
	<li>대퇴골과 경골을 함께 고정하는 결합 조직을 절단합니다.</li>
	<li>겸자를 사용하여 앞쪽이 반대쪽을 향하고 근위부 끝(대퇴골 머리 끝)이 아래로 향하도록 대퇴골을 잡습니다.</li>
	<li>가위를 대퇴골 샤프트 위로 올려 과두로 안내합니다.</li>
	<li>가위를 앞뒤로 부드럽게 돌려 과두, 슬개골 및 골단을 제거하여 형이상물을 노출시킵니다.</li>
	<li>집게, 가위 및 Kimwipes를 사용하여 대퇴골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다.</li>
	<li>겸자를 사용하여 앞쪽이 반대쪽을 향하고 원위 끝(발목 끝)이 아래로 향하도록 경골을 잡습니다.</li>
	<li>경골 골단이 손상되지 않은 경우 가위를 경골 샤프트 위로 과두로 안내합니다.</li>
	<li>가위를 앞뒤로 부드럽게 돌려 과두와 골단을 제거하여 형이상물을 노출시킵니다.</li>
	<li>집게, 가위, Kimwipes를 사용하여 경골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다.</li>
</ol>
3. 골수 격리
<ol>
	<li>18g 바늘을 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 바닥으로 밀어 넣습니다.</li>
	<li>긴 뼈(최대 대퇴골 2개와 경골 2개)를 튜브에 넣고 무릎 끝이 아래로 내려가 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 중첩합니다.</li>
	<li>마이크로 원심분리기에서 ≥10,000 x g의 중첩된 튜브를 15초 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>육안 검사를 통해 골수가 뼈에서 분리되었는지 확인합니다. 뼈는 하얗게 보여야 하며 더 큰 튜브에 큰 시각적 펠릿이 있어야 합니다.</li>
	<li>뼈가 있는 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 버립니다.</li>
	<li>적절한 용액(예: PBS, 배양 배지, FACS 완충액)에 골수를 현탁하고 실험 프로토콜(DNA, RNA 또는 단백질 분리, FACS 분석 또는 1차 세포 배양)을 진행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

우리는 마우스 뒷뼈 제거 및 후속 골수 분리를 위한 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 뼈와 골수의 높은 구조적 및 세포적 완전성을 유지하고 처리 시간이 짧아 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 사용자 유발 골절 또는 뼈 채점 가능성을 최소화합니다. 또한, 골수를 분리하는 원심분리법은 골수 공간을 노출시키기 위해 뼈를 절단하거나 골수를 세척하기 위해 체액을 절단할 필요가 없어 잠재적인 오염 지점을 줄일 수 있습니다. 또한 원심분리기 기술은 다른 방법보다 실습 시간이 짧고 처리량이 상대적으로 높아 처리 시간이 단축됩니다.
높은 변이는 높은 마우스 간 표현형 변이로 인해 생체 내 마우스 연구에 내재되어 있습니다. 비용이 많이 들고 노동 집약적인 마우스 연구의 연구 효과를 극대화하기 위해서는 기술적 실험 오류를 최소화하는 것이 중요합니다9,10. 동물 희생에서 다운스트림 분석 또는 조직 고정까지의 시간은 미묘한 변화를 극복하고 그룹 간의 큰 차이를 줄일 수 있는 실험적 변화를 도입합니다. 따라서 정확한 데이터 분석을 위해서는 샘플의 신속한 처리가 필수적입니다. 여기에 설명된 장골 해부 및 골수 분리 기술은 기술적 변동을 줄이기 위해 동물 및 샘플의 신속한 처리에 최적화되어 있습니다.
이 프로토콜은 뼈 조직 자체의 조사 또는 골수 세포의 조사를 포함하여 많은 연구 분야에 널리 적용될 수 있습니다. 또한, 긴 뼈 해부에 대한 이러한 간단한 접근 방식을 통해 관련 분야의 연구자들은 제대로 연구되지 않은 병리에서 골수 기능 장애에 대한 지식을 확장하기 위해 뼈 기여도를 직접 조사할 수 있습니다.

긴 뼈와 골수의 세포에 대한 연구는 뼈 생물학, 암 생물학, 면역학, 혈액학 및 생체 역학을 포함하되 이에 국한되지 않는 수많은 연구 분야의 중심입니다. 뼈는 연골과 함께 골격을 형성하여 내부 장기의 하중을 기계적으로 지지하고 보호하는 매우 역동적인 기관입니다. 또한 뼈의 미네랄 성분은 중요한 신호 분자인 칼슘과 인뿐만 아니라 다른 요인을 저장하는 흡수원입니다1. 마지막으로, 뼈는 골수를 수용하며, 대사 활동이 활발한 뼈 형성 조골세포 및 뼈 흡수 파골세포와 함께 조혈 세포 및 림프 세포 집단을 유지하는 데 필요한 줄기세포 틈새를 제공합니다.
뼈와 골수는 많은 질환에 영향을 미치며, 종종 골수 기능 장애, 심한 뼈 통증 및 병리학적 골절로 이어집니다. 뼈는 많은 고형 종양, 특히 유방암과 전립선암에서 흔히 발생하는 전이 부위로, 종양 세포가 골수 틈새와 직접 접촉하여 뼈 전이의 악순환을 시작하고 조혈 줄기세포를 대체하는 곳입니다2,3. 골수종과 백혈병을 포함한 조혈 악성 종양은 골수 기능 장애와 건강한 뼈 리모델링의 조절 저하를 특징으로 한다1. 다른 비악성 골격계 질환도 골관절염, 골다공증, 척추측만증 및 구루병과 같은 활발한 연구 분야입니다. 건강한 사람이라도 뼈의 생체역학적 결함은 고통스러운 골절로 이어집니다. 이러한 모든 질환은 이환율과 사망률을 줄이기 위한 새로운 예방 조치와 치료 요법을 식별하는 것을 목표로 하는 활발한 연구 분야를 나타냅니다.
생리학적, 병리학적 조건 하에서 뼈와 골수의 과다한 역할을 연구하기 위해서는 연구자들이 대규모 생체 내 실험의 신속한 처리를 위해 쥐의 긴 뼈를 해부하는 간단하고 효율적인 표준화된 방법을 갖는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 해부 프로토콜은 체외 이미징, 조직학, 조직 형태 측정 및 강도 테스트를 포함한 모든 긴 뼈 분석에 적합합니다. 마찬가지로, 골수 세포 회수율이 높고 사용자 간 변동성이 낮은 표준화된 골수 분리 방법은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 정량 PCR(qPCR)과 같은 실험 분석뿐만 아니라 골수 세포의 일차 세포 배양과 같은 다운스트림 응용 분야에 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>핀보드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 가위&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 겸</td><td></td><td></td><td></td></tr>자 <tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>16G 바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

뼈와 골수에 대한 연구는 기초 뼈 생물학, 면역학, 혈액학, 암 전이, 생체 역학 및 줄기 세포 생물학을 포함한 많은 연구 분야에서 매우 중요합니다. 그러나 건강하고 병리적인 상태에서 뼈의 중요성에도 불구하고 뼈 해부 및 골수 분리에 대한 전문 지식이 부족하기 때문에 대체로 연구가 부족한 기관입니다. 마우스는 뼈와 골수에 미치는 영향을 연구하는 일반적인 모델 유기체이므로 대규모 실험 코호트 처리를 위한 긴 뼈 절개 및 골수 분리를 위한 표준화되고 효율적인 방법이 필요합니다. 우리는 대퇴골과 경골을 제거하기 위한 간단한 해부 절차를 설명하며, 이는 조직 형태학적 분석 및 강도 테스트를 포함하되 이에 국한되지 않는 다운스트림 응용 분야에 적합합니다. 또한 취급 시간이 제한된 원심분리를 통해 긴 뼈에서 골수를 신속하게 분리하는 절차를 간략하게 설명하며, 이는 세포 분류, 일차 세포 배양 또는 DNA, RNA 및 단백질 추출에 이상적입니다. 이 프로토콜은 실험 오류를 제한하기 위해 시료를 신속하게 처리할 수 있도록 간소화되었으며, 사용자 간 변동성을 최소화하도록 표준화되었습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 골 조직의 손상을 최소화하면서 마우스의 대퇴골과 경골을 신속하게 해부할 수 있도록 최적화되었습니다. 이 기술은 생체 역학 연구, 조직 형태 측정(그림 1A - B) 및 조직학(그림 1C)을 포함한 다양한 하위 분석에 적합합니다4,7. 대표적인 조직 형태 측정 microCT 3D 재구성 이미지(그림 1A - B)를 통해 해면골과 피질골 껍질이 모두 유지됨을 확인할 수 있으며, 이를 통해 소주 개수, 두께, 간격, 골 부피, 피질 두께 등 골 조직 형태 측정의 표준화된 구조적 매개변수를 정확하게 정량화할 수 있습니다8. 대표적인 조직 절편은 H&amp;E 염색을 거친 포르말린 고정 및 탈칼슘 처리된 경골을 보여줍니다(그림 1C). 이 이미지는 조직학적 분석을 위한 석회화된 뼈와 세포성 골수의 무결성을 보여줍니다.
골수 분리 절차는 골수 공간의 무균 상태를 유지하며, 오염을 줄이기 위해 조작 과정을 최소화하였고, 긴 뼈를 절단할 필요가 없어 골수 수율의 손실을 줄여줍니다. 이렇게 분리된 골수는 유세포 분석5 및 PCR 분석을 포함한 다양한 후속 응용 단계에 적합합니다. 또한, 이 절차는 파골세포 및 조골세포를 포함한 골수 세포의 일차 세포 배양을 위한 골수 분리에 사용할 수 있습니다 (그림 2A - B)4,6.
<img alt="골 CT 스캔 및 조직학 이미지; 구조적 분석 및 세포 세부 사항 관찰." src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 1"> 
그림 1. 마우스 긴 뼈의 조직 형태학적 및 조직학적 분석. (마우스 경골의 3차원 microCT 재구성 영상으로, 다음을 보여줌:A) 외측 피질 껍질과 (B) 소주골(척도 막 = 0.5 mm). (C) 조직학적 H&amp;탈칼슘화 및 절편화된 경골의 E 염색 (4배). 이미지는 미국 워싱턴 대학교 의과대학의 Katherine Weilbaecher 제공. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="조직학적 절편 및 세포 배양 분석, 현미경 이미지, 조직 형태학, 시료 연구." src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="그림 2"> 
그림 2. 파골세포 및 조골세포 분화를 위한 일차 골수 세포 배양. (A) 파골세포 분화 배지에서 7일간 배양 후 다핵 파골세포에 대한 TRAP 염색 (4배 확대). (B) 골모세포를 위한 알칼라인 포스파타아제(보라색) 및 골분화 유도 배지에서 21일 배양 후의 광물화를 확인하기 위한 알리자린 레드(빨간색) 염색. 이미지 제공: 미국 워싱턴 대학교 의과대학 Katherine Weilbaecher. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 실험용 쥐의 뒷다리, 긴 뼈(대퇴골 및 경골)를 해부하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 골수 공간에서 골수를 제거하기 위해 원심분리를 사용하는 이러한 뼈에서 골수를 신속하게 분리하는 기술에 대해 설명합니다.

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

이 장골 해부 및 골수 분리 절차의 전반적인 목표는 장골을 빠르고 체계적으로 제거하고, 후속 분석을 위해 골수를 수집하는 것입니다. 이 방법은 골수 생물학, 암 전이 및 면역학 관련 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 해부 과정이 빠르고 표준화되어 있으며, 골수 분리 절차가 상당히 무균적으로 이루어진다는 점입니다. 먼저 마우스를 앙와위로 배치하는 것부터 시작하십시오.그 다음, 발목 관절 아래의 네 발바닥 패드를 모두 핀으로 고정하고 70% ethanol을 분사하여 다리 전체를 충분히 적십니다. 이어서 하복부의 고관절 바로 위, 중앙선 오른쪽으로 작은 절개를 가한 뒤, 절개선을 다리를 따라 발목 관절 너머까지 확장합니다. 피부를 뒤로 젖혀 당깁니다.그 다음, 대퇴골의 근위단에 고정된 대퇴사두근을 절개하여 대퇴골의 전면을 노출시키고, 핀을 보드에서 45도 각도로 꽂아 근육을 다리 밖으로 고정합니다. 가위로 대퇴골의 후면을 따라 햄스트링을 무릎 관절에서 절개하여 분리합니다. 그런 다음 대퇴골 근위단에 고정된 피부와 햄스트링 근육을 뒤로 젖혀 뼈의 후면을 노출시키고, 핀을 45도 각도로 꽂아 햄스트링 근육을 다리 밖으로 고정합니다.포셉을 사용하여 무릎 관절 바로 위의 대퇴골 원위단을 잡습니다. 그런 다음 가위 날을 대퇴골 간의 양측으로 하여 고관절 방향으로 안내합니다. 대퇴골두에 도달하면 가위를 비틀어 위쪽 날을 대퇴골두 바로 위로 이동시켜 대퇴골을 탈구시킵니다.이제 포셉으로 대퇴골 간부의 윗부분을 잡고, 대퇴골두에서 연조직을 절개하여 비구로부터 대퇴골을 분리합니다. 그런 다음 대퇴골, 무릎, 경골을 포함한 다리뼈 전체를 몸 바깥쪽 위로 당기고, 다리를 피부에 부착시키고 있는 결합 조직과 근육을 조심스럽게 절개하여 제거합니다. 모든 결합 조직이 제거되면, 방금 시연한 것처럼 발목 관절을 과신전시킨 후 가위를 비틀어 경골을 탈구시킵니다.경골의 원위단을 잡고 힘줄이 끊어지지 않도록 주의하면서, 경골을 몸체와 핀 보드에서 바깥쪽으로 당겨 올립니다. 그 다음 무릎 부위의 장골에 부착된 나머지 결합 조직과 대퇴골 및 경골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다. 골수 분리를 위해 장골을 준비하려면, 슬개골이 바깥쪽을 향하고 대퇴골두가 아래쪽을 향하도록 대퇴골을 잡습니다.무릎 관절을 과신전시키고 가위를 비틀어 대퇴골에서 경골을 탈구시킵니다. 그런 다음 대퇴골과 경골을 연결하고 있는 모든 결합 조직을 제거합니다. 다음으로, 전면이 바깥쪽을 향하고 대퇴골두가 아래쪽을 향하도록 대퇴골을 잡고, 가위를 대퇴골 간부를 따라 상단의 과(condyles) 방향으로 밀어 올립니다.가위로 부드럽게 앞뒤로 회전시켜 과상돌기, 슬개골 및 골단(epiphysis)을 제거하여 메타피시스(metaphysis)를 노출시킵니다. 그 다음, 포셉, 가위 및 Kimwipes를 사용하여 대퇴골에 붙어 있는 추가적인 근육이나 결합 조직을 제거합니다. 다음으로, 경골의 전면이 바깥쪽을 향하고 발목 끝이 아래쪽을 향하도록 잡습니다.경골 골단이 온전한 경우, 가위를 경골 간단을 따라 관절융기 쪽으로 밀어 올린 다음, 가위를 앞뒤로 부드럽게 회전시켜 관절융기와 골단을 제거하여 경골 메타피시스(골단판)를 노출시킵니다. 그 다음 시연한 것과 같이 경골에 부착된 추가 근육이나 결합 조직을 제거합니다. 골수를 채취하려면, 먼저 18 gauge 바늘을 0.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브 바닥에 밀어 넣습니다.그 다음 긴 뼈의 무릎 쪽 끝이 아래로 향하도록 튜브에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 안에 겹쳐 넣고, 마이크로원심분리기를 사용하여 10,000 ×g 이상의 속도로 15초 동안 원심분리합니다. 육안 검사를 통해 골수가 뼈 밖으로 완전히 배출되었는지 확인합니다.뼈는 흰색으로 보여야 하며, 더 큰 튜브에는 큰 펠릿이 보여야 합니다. 그런 다음 0.5 milliliter 마이크로원심분리기 튜브에 있는 뼈를 폐기하고, 원하는 후속 분석에 적합한 용액에 골수를 현탁합니다. 이 신속한 해부 기법은 조직 형태 측정법 및 조직학을 포함한 여러 후속 분석에 적합합니다.실제로, 이 대표적인 조직 형태 측정 micro-CT 3D 재구성 영상에서 알 수 있듯이, 해면골과 피질골 껍질이 모두 유지되어 골 조직 형태 측정에 필요한 표준화된 구조적 파라미터를 정확하게 정량화할 수 있습니다. H and E 염색을 거쳐 고정 및 탈회된 경골의 이 대표적인 조직 절편에서는, 조직학적 분석을 위한 석회화된 뼈와 세포성 골수의 무결성이 모두 유지된 것을 관찰할 수 있습니다. 또한, 이 절차를 통해 분리된 골수는 파골세포 또는 조골세포의 일차 세포 배양을 포함한 많은 후속 응용 분야에 적합합니다.숙달되면, 적절하게 수행했을 때 긴 뼈 해부부터 골수 분리까지 약 7분 만에 기술을 완료할 수 있습니다. 절차를 수행하는 동안, 해부가 용이하도록 마우스의 위치를 잡는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 절차 이후에 FACS 또는 기타 단일 세포 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 골수 세포 집단의 변화에 관한 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 마우스의 긴 뼈를 빠르게 해부하고 원심분리를 통해 골수를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

murine-hind-limb-long-bone-dissection-and-bone-marrow-isolation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 백혈병과 같은 혈액 질환이 있는 환자의 전체 BM 결함을 조사하기 위해 마우스의 뒷다리에서 신선한 전체 골수를 분리하는 자세한 프로토콜을 설명합니다.

쥐 뒷다리에서 채취한 골수

이 비디오에서는 생쥐의 긴 뼈에서 골수 기질 세포의 분리 및 배양을 보여줍니다. 분리된 부착 BMSC는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

이 프로토콜은 마우스를 희생하지 않고 대퇴골수(BM)를 연속적으로 샘플링하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 시간 경과에 따른 마우스의 BM 구성에 대한 종단 연구를 용이하게 하고 생체 외 및 이식 연구를 위해 BM 내 세포에 대한 직렬 액세스를 제공합니다.

라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

여기에서는 번역 응용을 위해 이질적인 골수에서 다량의 쥐 단핵구를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 다른 방법과 비교했을 때, 이 새로운 방법은 높은 구배 자기 세포 분리(MACS)와 같은 값비싼 방법을 피함으로써 희생되는 동물의 수를 줄이고 비용을 절감하는 데 도움이 됩니다.

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

이 프로토콜 포함 murine 긴 뼈와 골 절연, 골 수 세포를 생성 하 고 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극을 사용 하 여 생산의 해 부 또는 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 그리고 안티-c-fms 항 체, M-CSF 수용 체에 의해 그들의 체포.

Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

여기서 우리는 금 본위 것으로 보인다 orthotopic 쥐 뒷다리 - 사지 이식 절차를...

쥐에서 Orthotopic 힌드 - 림브 이식

배우세요 쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 원심분리를 이용한 골수 격리 기법을 통해 뼈와 골수의 무결성을 유지하며 7분 내에 완료할 수 있는 신속하고 표준화된 방법입니다.

쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

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