쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

이 긴 뼈 절제 및 골수 분리 절차의 전반적인 목표는 긴 뼈를 빠르고 체계적으로 제거하고 추가 후속 분석을 위해 골수를 채취하는 것입니다. 이 방법은 골수 생물학, 암 전이 및 면역학과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 해부 과정이 빠르고 표준화되어 있으며 골수 분리 절차가 상당히 무균 상태이며 마우스를 누운 자세로 배치하여 시작한다는 것입니다.

그런 다음 4개의 발 패드를 모두 발목 관절 아래에 고정하고 마우스에 70% 에탄올을 분사하여 다리에 완전히 적십니다. 그런 다음 엉덩이 바로 위의 하복부 정중선 오른쪽으로 작게 절개하고 다리 아래로 절개를 뻗어 발목 관절을 지나갑니다. 피부를 뒤로 당깁니다.

그런 다음 대퇴골의 근위부 끝에 고정된 대퇴사두근을 잘라 대퇴골의 앞쪽을 노출시키고 핀으로 다리에서 근육을 보드에서 45도 각도로 핀으로 고정합니다. 가위로 대퇴골 뒤쪽을 대고 햄스트링을 무릎 관절에서 잘라냅니다. 그런 다음 대퇴골의 근위부 끝에 고정된 피부와 햄스트링 근육을 뒤로 당겨 뼈의 뒤쪽을 노출시키고 다리에서 햄스트링 근육을 핀으로 고정하여 핀을 45도 각도로 배치합니다.

겸자로 무릎 관절 바로 위에 있는 대퇴골의 말단부를 잡습니다. 그런 다음 대퇴골 샤프트 양쪽에 있는 가위날을 고관절 쪽으로 안내합니다. 대퇴골두에 도달한 후 가위를 비틀어 상단 날을 대퇴골두 바로 위로 움직여 대퇴골을 탈구합니다.

이제 집게로 대퇴골 샤프트의 상단을 잡고 대퇴골두에서 연조직을 잘라내어 비구에서 대퇴골을 분리합니다. 그런 다음 대퇴골, 무릎, 경골을 포함한 다리 뼈 전체를 몸에서 위로 당겨 빼내고 다리를 피부에 연결하는 결합 조직과 근육을 조심스럽게 잘라냅니다. 모든 결합 조직이 제거되면 발목 관절을 과도하게 펴고 경골을 탈구시키는 것처럼 가위를 비틀십시오.

경골의 말단 끝을 잡고 힘줄이 절단되지 않도록 주의하면서 경골을 위로 당겨 몸체와 핀 보드에서 분리합니다. 그런 다음 무릎의 긴 뼈에 붙어 있는 남아 있는 결합 조직과 대퇴골과 경골에 붙어 있는 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다. 골수 분리를 위해 긴 뼈를 준비하려면 슬개골이 반대쪽을 향하고 대퇴골두가 아래를 향하도록 대퇴

무릎 관절을 과도하게 펴고 가위를 비틀어 대퇴골에서 경골을 탈구시킵니다. 그런 다음 대퇴골과 경골을 함께 고정하고 있는 결합 조직을 제거합니다. 다음으로, 앞쪽이 반대쪽을 향하고 대퇴골두가 아래를 향하도록 대퇴골을 잡고 가위를 대퇴골 위쪽으로 유도하여 과두까지 안내합니다.

가위를 앞뒤로 부드럽게 돌려 과두, 슬개골 및 골단을 제거하여 형이상학을 노출시킵니다. 그런 다음 집게, 가위 및 Kimwipes를 사용하여 대퇴골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다. 다음으로 앞쪽이 반대쪽을 향하고 발목 끝이 아래를 향하도록 경골을 잡습니다.

경골 골단이 손상되지 않은 경우 가위를 경골 샤프트 위로 과두로 안내하고 가위를 앞뒤로 부드럽게 돌려 과두와 골단을 제거하여 경골 골단을 노출시킵니다. 그런 다음 방금 설명한 것처럼 경골에 부착된 추가 근육 또는 결합 조직을 제거합니다. 골수를 채취하려면 먼저 18 게이지 바늘을 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥을 통해 밀어 넣습니다.

그런 다음 긴 뼈를 튜브에 넣고 무릎 끝을 아래로 내린 다음 뚜껑을 닫습니다. 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 끼워 넣고, 15초 동안 마이크로 원심분리기에서 10, 000 번 g 이상의 튜브를 원심분리한다. 육안 검사를 통해 골수가 뼈에서 분리되었는지 확인합니다.

뼈는 하얗게 보여야 하고 큰 튜브에서 큰 펠릿이 보여야 합니다. 그런 다음 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 뼈를 버리고 원하는 다운스트림 분석을 위해 적절한 용액에 골수를 현탁시킵니다. 이 신속한 해부 기법은 조직형태 측정 및 조직학을 포함한 여러 다운스트림 분석에 적합합니다.

실제로, 이 대표적인 조직형태 측정 마이크로 CT 3D 재구성에서 입증된 바와 같이, 해면골과 피질 껍질이 모두 유지되어 뼈 조직 형태 측정을 위한 표준화된 구조 매개변수의 정확한 정량화가 가능합니다. H 및 E 염색된 공식 및 고정 및 석회질 처리된 경골의 이 대표적인 조직학적 단면에서 조직학적 분석을 위한 석회화된 뼈와 세포 골수 모두의 무결성 유지를 관찰할 수 있습니다. 또한, 이 절차에 의해 분리된 골수는 파골세포 또는 파골세포의 일차 세포 배양을 포함한 많은 다운스트림 응용 분야에 적합합니다.

일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행된다면 긴 뼈 절개부터 골수 분리까지 약 7분 안에 완료할 수 있습니다. 절차를 시도하는 동안 쉽게 해부할 수 있도록 마우스의 위치를 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 FACS 또는 기타 단일 세포 프로세스와 같은 다른 방법을 수행하여 골수 세포 집단의 변경에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 생쥐의 긴 뼈를 빠르게 절개하고 원심분리로 골수를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.