세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

이 절차의 전반적인 목표는 면봉에서 고품질 DNA와 RNA를 분리한 다음 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 사용하여 박테리아 구성을 결정하는 것입니다. 이 방법은 연구자가 주어진 인간 샘플에 어떤 박테리아가 포함되어 있는지 식별하고 특정 박테리아와 숙주 특성 또는 질병 상태 간의 연관성을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 인간의 질 박테리아 군집에 대한 통찰력을 제공하기 위해 고안되었지만, 이 방법은 콧구멍, 입, 피부, 직장과 같은 다른 신체 부위 및 다른 유기체의 박테리아 군집을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

이 비디오는 프로토콜의 까다로운 부분을 강조하며 염기서열분석 부분이나 염기서열분석 분석은 다루지 않습니다. 제 연구실의 기술자인 Brittany Bowman이 시연합니다. 함께 제공된 문서에 설명된 대로 젖은 얼음에 수집 및 보관된 자궁경부 면봉으로 이 절차를 시작합니다.

핵산 추출을 준비하기 위해 후드의 모든 표면과 후드로 가져온 모든 품목을 표백제로 청소한 다음 RNase, DNase 및 DNA를 제거하는 오염 제거제를 세척합니다. 후드에 샘플당 하나의 비드 구슬 튜브를 놓습니다. 각 튜브에 NaCl-Tris-EDTA 완충액 500마이크로리터, 20%SDS 210마이크로리터, 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 500마이크로리터를 추가합니다.

면봉을 주의 깊게 취급하는 것은 이 프로토콜로 명확한 결과를 얻는 데 중요합니다. 면봉을 떨어뜨리지 않고 옮기려면 약간의 연습이 필요하며 이와 같은 중공 축 면봉을 사용하면 더 쉽습니다. 멸균 집게를 사용하여 운송 바이알에서 비드 비드 튜브로 면봉을 옮깁니다.

면봉 머리를 튜브의 내벽에 최소 30초 동안 철저히 문지릅니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 장갑을 교체하고 다음 샘플로 면봉 절차를 반복합니다.

모든 샘플을 세게 문지르면 최소 10분 동안 얼음에서 식힙니다. 면봉을 제거하는 데 10분이 지난 후 멸균 핀셋으로 손잡이를 잡고 깨끗한 P200 팁을 사용하여 튜브 벽 안쪽에 머리를 대고 누릅니다. 이 과정은 면봉에서 액체를 방출하여 핵산 회수를 증가시킵니다.

비드 비딩 튜브를 비드 비더에 넣고 섭씨 4도에서 2분 동안 샘플을 균질화합니다. 다음, 3 분 동안 6, 000 gs 및 4 섭씨 온도에 구슬 구슬로 장식하는 파편을 펠릿 만들고 수성과 석탄상 분리하기 위하여 관을 분리기로 만드십시오. 스핀 후에는 일반적으로 세 단계를 볼 수 있습니다.

최상층은 DNA와 RNA를 포함하는 수성상입니다. 맨 아래층은 세포와 면봉의 지질과 파편을 포함하는 유기상입니다. 간기(interphase)라고 하는 얇은 흰색 중간층에는 단백질이 포함되어 있습니다.

약 500-600 마이크로리터의 수성상을 멸균 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 같은 부피의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올을 첨가합니다. 반전과 짧은 소용돌이에 의한 혼합.

튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 탈수 후 수성상을 새로운 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 계면 또는 기본 페놀 상에서 물질을 전달하지 않도록 주의하십시오.

전달된 부피를 기록하고 향후 단백질 분리를 위해 페놀 단계를 저장하십시오. 다음으로, 0.8 부피의 이소프로판올과 0.1 부피의 3 몰 아세트산 나트륨을 첨가합니다. 반전과 잠시 와류로 철저히 혼합하십시오.

튜브를 섭씨 20도에서 최소 2시간 동안 그리고 밤새 냉각하여 핵산을 침전시킵니다. 침전 후 튜브를 30분 동안 원심분리합니다. 탈수 후 피펫을 조심스럽게 사용하여 상층액을 제거하고 펠릿은 그대로 둡니다.

500 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 펠릿을 건드리지 않고 부드러운 와류 또는 피펫팅으로 펠릿을 제거합니다. 5분 동안 원심분리기를 사용합니다.

P10 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 에탄올을 제거하고 폐기합니다. 펠릿을 실온에서 15분 동안 자연 건조합니다. 펠릿을 20마이크로리터의 UltraPure 0.1X-Tris-EDTA 완충액에 재현탁합니다.

샘플을 얼음 위에서 10분 동안 식히고 반복해서 피펫을 사용하여 완전히 재현탁합니다. 분광 광도계를 사용하여 핵산 농도를 측정합니다. 원하는 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 컬럼 클린업 키트를 사용하여 RNA에서 DNA를 분리합니다.

PCR 설정은 이 절차에서 중요한 단계입니다. 시약, PCR 후드 및 장갑의 멸균을 보장하여 오염을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 빠르지만 조심스럽게 작업하고 후드 안팎으로 물건을 옮길 때 적절한 기술을 사용하십시오.

마이크로 원심분리기 튜브를 위한 깨끗한 탁상용 쿨러 랙과 후드에 PCR 플레이트 쿨러를 놓습니다. 8-well 스트립 튜브에 개별 캡으로 라벨을 붙이고 PCR 쿨러에 넣습니다. 증폭은 3회씩 수행해야 하며 각 프라이머 쌍에 대해 템플릿 없는 수분 조절이 포함되어야 합니다.

마스터 믹스를 위해 쿨러에 마이크로 원심분리기 튜브를 놓습니다. 그런 다음 각 샘플에 대해 첨부 문서에 설명된 대로 초순수, 5X HF 완충액, DNTP, 515F 포워드 프라이머 및 3% DMSO를 결합합니다. 그런 다음 마스터 믹스에 중합효소를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.

첫 번째 웰에 90 마이크로 리터의 마스터 믹스와 2 마이크로 리터의 리버스 프라이머를 넣고 잘 섞습니다. 그런 다음 템플릿 없음 컨트롤 역할을 하는 네 번째 우물에 마스터 23마이크로리터와 물 2마이크로리터를 넣고 섞습니다. 다음으로, 6마이크로리터의 적절한 샘플을 첫 번째 웰에 추가합니다.

철저히 혼합하고 25마이크로리터를 두 번째 웰로 옮깁니다. 팁을 변경한 다음 첫 번째 우물에서 세 번째 우물로 25마이크로리터를 더 옮깁니다. 모든 우물을 단단히 덮으십시오.

우물 내부나 뚜껑을 만지지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 각 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. 모든 샘플이 준비되면 스트립 튜브를 빠르게 회전시켜 열순환기로 옮기고 프로그램을 실행합니다.

실행이 완료되면 튜브를 빠르게 돌려 벽에서 액체를 모으십시오. 그런 다음 깨끗한 실험실 벤치에서 각 샘플의 3중 PCR 반응을 라벨링된 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 결합합니다. 25마이크로리터의 각 무템플릿 제어 장치를 별도의 멸균 튜브로 옮깁니다.

아직 다른 샘플의 앰플리콘을 결합하지 마십시오. 성공적인 PCR 증폭을 검증하려면 각 샘플의 5마이크로리터를 1.5% 아가로스 겔에 로드하고 120볼트에서 30-60분 동안 전기영동을 수행합니다. 자외선 아래에서 젤을 봅니다.

약 380개의 염기쌍 주위에 있는 하나의 강한 띠를 기록하여 각 샘플의 성공적인 증폭을 확인합니다. 이중 밴드가 있는 경우 다른 역 바코드로 샘플을 다시 증폭합니다. 밴드가 전혀 없는 경우 동일한 역 바코드 또는 새 역 바코드가 있는 프라이머를 사용하여 샘플을 다시 증폭합니다.

재증폭에 실패한 경우 PCR inhibitor가 샘플에 존재할 수 있으며, 이 경우 column based DNA cleanup을 수행하여 PCR inhibitor를 제거합니다. 나머지 70마이크로리터의 앰플리콘은 섭씨 20도에서 보관하십시오. no template control의 나머지 20마이크로리터는 밴드를 생성하지 않았다고 가정합니다.

앰플리콘 풀을 만들려면 단일 멸균 튜브에 각 앰플리콘을 2-5마이크로리터로 결합하십시오. 샘플의 밴드가 약하면 나머지 샘플에 비해 부피의 두 배를 추가합니다. 그런 다음 키트를 사용하여 PCR 프라이머를 제거합니다.

해당되는 경우, primer-free 앰플리콘 풀을 결합하여 최종 라이브러리를 생성합니다. 분광 광도계 또는 형광 측정 시스템을 사용하여 라이브러리의 DNA 농도를 측정합니다. 마지막으로 샘플을 2나노몰로 희석하고 염기서열분석을 위해 보냅니다.

염기서열 분석에 대한 자세한 정보는 함께 제공되는 문서에 나와 있습니다. 고품질 DNA와 RNA를 분리하고 DNA를 이 비디오에 설명된 대로 16S rRNA 유전자 V4 영역의 PCR 증폭을 위한 템플릿으로 사용했습니다. 겔 전기영동은 템플릿으로 증폭된 모든 샘플에서 약 380개의 염기쌍을 포함한 단일 밴드의 존재를 확인하는 데 사용되었습니다.

동일한 프라이머 쌍과 병렬로 실행되는 템플릿 없음 컨트롤에는 밴드가 없었습니다. 그런 다음 PCR 앰플리콘을 단일 튜브로 결합하고 정량화하고 염기서열분석 전에 추가로 희석했습니다. 여기에 표시된 것은 판독의 각 위치에서 시퀀스 품질 점수의 대표적인 막대 플롯입니다.

염기쌍이 200개 미만인 경우 염기서열 품질이 떨어지는 것은 정상입니다. 그러나 평균 품질 점수는 30 이상으로 유지되어야 합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 페놀 클로로포름 기반 추출을 사용하여 면봉에서 DNA와 RNA를 분리하고, 16SR 리보솜 RNA 유전자의 V4 영역을 증폭하고, 고처리량 염기서열분석을 위한 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플 채취, 핵산 추출 및 PCR 증폭 중에 오염을 방지하기 위해 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 페놀 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 통풍이 잘되는 후드에서 작업하고 불침투성 장갑, 측면 보호막이 있는 보안경, 실험실 가운을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것과 같은 예방 조치를 취하는 것을 잊지 마십시오.