공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

이 실험 절차의 전반적인 목표는 생산 수율과 재사용성을 향상시키기 위해 알긴산 비드에 고정화된 결합 전세포 생체촉매 시스템의 사용법을 시연하는 것입니다. 본 연구에서는 생체촉매 고정화, 안정성, 보조인자 재생 및 전세포 생체촉매와 같은 생체촉매 분야의 핵심 질문들에 답하였습니다. 이 기술의 주요 장점은 보조인자 의존적 경로를 통해 많은 중요한 생체분자의 생산을 개선할 수 있는 단순하면서도 유연한 접근 방식을 제공한다는 점입니다.

본 프로토콜에서는 두 가지 재조합 E coli 균주가 사용됩니다. NADH oxidase를 발현하는 SpNOx E coli와 L-arabinitol dehydrogenase를 발현하는 HjLAD E coli입니다. 두 E coli 균주에 대한 절차가 동일하므로, HjLAD E coli를 대상으로만 시연하겠습니다.

15 µg/mL의 Ket-A-My-Sin이 첨가된 3 mL의 LB 배지에 HjLAD E coli 단일 콜로니를 접종하고, 진탕 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 15 µg/mL의 Ket-A-My-Sin이 포함된 200 mL의 신선한 LB 배지에 배양액을 1:100 비율로 희석하고, OD 600이 약 0.6에 도달할 때까지 37 °C, 250 RPM에서 배양합니다. 배양액에 0.1 mM IPTG를 첨가하여 HjLAD 단백질 발현을 유도하고, 25 °C, 200 RPM에서 6시간 동안 배양합니다.

3200 ×g, 4 °C에서 20분간 원심분리하여 유도된 세포를 수확합니다. 상층액을 제거하고, 다음 섹션에서 설명하는 방식대로 세포 펠릿 처리를 진행합니다. 이 절차를 시작하기 위해, HjLAD E coli와 SpNox E coli의 세포 펠릿을 각각 50 mM Tris-Hcl 버퍼에 세포 밀도가 L당 건조 세포 중량 5 g이 되도록 현탁합니다.

14 mL 라운드 바텀 튜브에 5 g dry cell weight/L HjLAD E. coli 600 µL, 5 g dry cell weight/L SpNOx E. coli 600 µL, 20 mM NAD+ 100 µL, 그리고 2 M L-aribinitol 150 µL를 혼합합니다. 50 mM Tris-HCl 550 µL를 첨가하여 반응 부피를 2 mL로 맞춥니다. 반응 혼합물을 30 °C, 200 RPM에서 8시간 동안 배양합니다.

8시간 후, 혼합물을 3200 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하고 반응 상층액을 수집합니다. 비색법으로 L-xylulose 생성량을 정량하기 위해, 수집한 상층액 100 µL를 1.5 mL 튜브에 취합니다. 여기에 1.5% cysteine 50 µL, 70% sulfuric acid 900 µL, 그리고 에탄올에 용해된 0.1% Kar-Piz-All 50 µL를 첨가하고, 튜브를 세 번 뒤집어 가볍게 섞어줍니다.

반응 혼합물을 37 °C에서 200 RPM으로 20분 동안 배양합니다. 분광광도계를 사용하여 560 nm에서 반응 혼합물의 광학 흡광도를 측정합니다. 4% alginate 용액을 준비하여 고정화 프로토콜을 시작합니다.

0.8g의 알긴산 나트륨을 20mL의 증류수에 넣고, 혼합물을 가열하여 알긴산 나트륨을 녹입니다. 4% 알긴산 용액 1.2mL에 리터당 5g 건조 세포 중량의 HjLAD E coli 600µL와 리터당 5g 건조 세포 중량의 SpNOx E coli 600µL를 첨가합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 파이펫팅으로 세포와 알긴산을 부드럽게 혼합합니다.

균일한 크기, 형태 및 강도를 가진 알긴산 비드를 형성하려면, 모든 비드를 충분히 덮을 수 있는 부피의 염화칼슘 용액에 세포-알긴산 현탁액을 최적의 거리에서 천천히 한 방울씩 첨가하는 것이 중요합니다. 바늘을 사용하여 주사기로 알긴산 세포 현탁액을 흡입한 후, 지속적으로 교반 중인 100 milliliter 비커 내의 0.3 molar 염화칼슘 용액에 혼합액을 한 방울씩 첨가하십시오. 가교 결합이 일어날 수 있도록 교반 없이 실온에서 2~3시간 동안 비드를 염화칼슘 용액에 그대로 둡니다.

비드가 흐트러지지 않도록 주의하며 염화칼슘 용액을 15 mL 원심분리관에 조심스럽게 부어 제거합니다. 남은 비드를 다른 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 과도한 염화칼슘과 캡슐화되지 않은 세포를 제거하기 위해, 50 mM Tris-HCl 완충액으로 비드를 세척합니다.

비드에 버퍼 10 milliliters를 추가하고, 현탁액을 3~5분 동안 가만히 둡니다. 비드가 바닥에 가라앉으면 버퍼를 다른 용기에 따라냅니다. 이러한 방식으로 비드를 3회 세척합니다.

어느 단계에서도 비드를 원심 분리하지 마십시오. 원심 분리 시 비드가 파열될 수 있습니다. 사용한 Tris-HCl 세척 버퍼를 버리지 마십시오. 이전에 수집한 염화 칼슘 용액과 함께 사용한 세척 버퍼 30 milliliters를 함께 회수하십시오.

회수된 염화칼슘 및 Tris-HCl 용액을 3200 ×g에서 20분 동안 원심분리하여 고정되지 않은 E coli 세포를 펠렛화합니다. 세척된 비드를 튜브로 옮깁니다. 이어서, 세포 펠렛 대신 세척된 비드 전체를 사용하여 세포 펠렛에 대해 입증된 절차에 따라 L-xylulose 생합성을 평가합니다.

L-xylulose 생산을 위한 고정화 생촉매의 안정성을 평가하기 위해, 형성된 비즈를 수집합니다. 그리고 앞서 설명한 대로 원심분리 없이 10 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액으로 2회 세척합니다. 세척된 모든 비즈를 사용하여 앞서 시연한 것과 같이 L-xylulose 생산 반응을 수행합니다.

앞서 시연한 바와 같이, 비색 분석법을 통해 L-xylulose 생산량을 정량합니다. 원하는 횟수만큼 L-xylulose 생산 반응을 반복하고, 각 사이클의 반응 상층액에 생성된 L-xylulose의 양을 측정합니다. 이 결합된 전세포 생촉매 시스템에 의해 L-xylulose 생산이 증대됩니다.

150 millimolar의 L-aribinitol 초기 농도에서, HjLAD E coli 생촉매만을 사용했을 때 79%의 L-xylulose 수율을 얻었습니다. 이와 비교하여, HjLAD E coli와 SpNOx E coli 세포를 1:1 비율로 사용했을 때는 96%의 L-xylulose 수율을 나타냈습니다. 생촉매 고정화 효율에 영향을 미치는 변수들을 평가한 결과, 알긴산나트륨 농도가 1%에서 3% 범위로 증가함에 따라 효율이 증가하는 것으로 나타났습니다.

하지만 2%보다 높은 알긴산나트륨 농도는 L-xylulose 수율의 감소를 초래합니다. 알긴산나트륨 농도를 2%로 설정했을 때, 고정화 및 L-xylulose 수율을 위한 최적의 염화칼슘 농도는 0.3 M로 결정되었습니다. 생촉매의 재사용성을 평가하였습니다.

이 그래프에서 고정화된 결합 전세포 생촉매와 유리 결합 전세포 생촉매의 7회 연속 재사용에 따른 L-xylulose 생산량이 각각 진한 회색과 연한 회색으로 표시되어 있습니다. 고정화된 결합 전세포 생촉매의 최대 L-xylulose 수율은 유리 결합 전세포 시스템보다 낮지만, 고정화를 통해 재사용성이 향상되었습니다. 7회의 연속 재사용 주기 끝에 고정화된 생촉매는 안정성을 유지했으며, 초기 L-xylulose 수율의 65%를 유지하였습니다.

이 기술이 개발된 이후, 생촉매 분야의 연구자들은 완전한 다세포 생촉매의 수율과 보조인자가 관여하는 주요 반응을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.