공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

이 실험 절차의 전반적인 목표는 생산 수율 및 재사용성 향상을 위해 알긴산 비드에 고정된 결합된 전체 세포 바이오 촉매 시스템의 사용을 입증하는 것입니다. 이것이 제 주제이며, 저는 생체 촉매 고정, 안정성, 보조 인자 재생 및 전체 세포 생체 촉매와 같은 생물 촉매 분야의 주요 질문에 답했습니다. 이 기술의 주요 장점은 보조 인자 의존 경로를 통해 많은 중요한 생체 분자의 생산을 개선하기 위한 간단하면서도 유연한 접근 방식을 제공한다는 것입니다.

이 프로토콜에는 두 가지 재조합 대장균 균주가 사용됩니다. NADH 산화효소를 발현하는 SpNOx E coli와 L-arabinitol dehydrogenase를 발현하는 HjLAD E coli. 이 절차는 두 대장균 균주에 대해 동일하기 때문에 HjLAD 대장균에 대해서만 입증됩니다.

HjLAD E 대장균 단일 콜로니에 3ml의 LB 배지를 접종하고 1밀리리터당 15마이크로그램의 Ket-A-My-Sin을 보충한 다음 인큐베이터 쉐이커에서 밤새 배양합니다. 다음 날, Ket-A-My-Sin의 밀리리터 당 15 마이크로 그램을 함유 한 200 밀리리터의 신선한 LB에 배양액을 1에서 100으로 희석하고, OD 600이 약 0.6에 도달 할 때까지 250 RPM에서 섭씨 37 도에서 배양한다. 배양액에 0.1 millimolar IPTG를 첨가하고 섭씨 25도, 200RPM에서 6시간 동안 배양하여 HjLAD 단백질 발현을 유도합니다.

유도된 세포를 3200배 G와 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 수확합니다. 상등액을 버리고 다음 세그먼트에서 설명된 대로 세포 펠릿 처리를 진행합니다. 이 절차를 시작하기 위해 HjLAD E coli와 SpNox E coli의 세포 펠릿을 50 밀리몰의 Tris-Hcl 완충액에 리터당 5g의 건조 세포 중량의 세포 밀도로 별도로 현탁시킵니다.

14 밀리리터 원형 바닥 튜브에 HjLAD E 대장균 1리터당 5g 건조 셀 중량 600 마이크로리터, SpNOx E 대장균 1리터당 5g 건조 셀 중량 600 마이크로리터, 20 밀리몰 NAD 플러스 100 마이크로리터 및 2몰 L-아리비니톨 150 마이크로리터를 혼합합니다. 550 밀리 리터의 50 밀리 몰 Tris-HCl을 첨가하여 반응 부피를 2 밀리리터로 가져옵니다. 반응 혼합물을 섭씨 30도 및 200RPM에서 8시간 동안 배양합니다.

8 시간 후, 3200 회 G와 4 °C에서 10 분 동안 혼합물을 원심 분리하고 반응 상등액을 수집한다. 비색 분석으로 L-자일룰로스 생산을 정량화하려면 수집된 상등액 100마이크로리터를 1.5밀리터 튜브로 흡인합니다. 에탄올에 1.5% 시스테인 50μl, 70% 황산 900μl, 0.1%Kar-Piz-All 50μl를 넣고 튜브를 3회 뒤집어 부드럽게 섞는다.

반응 혼합물을 섭씨 37도 및 200rpm에서 20분 동안 배양합니다. 분광 광도계를 사용하여 560 나노미터에서 반응 혼합물의 광학 흡광도를 측정합니다. 4% 알긴산 용액을 준비하여 고정 프로토콜을 시작합니다.

증류수 0.8ml에 알긴산나트륨 20g을 넣고 혼합물을 가열하여 알긴산나트륨을 용해시킵니다. HjLAD E 대장균 1리터당 5g 건조 셀 중량 600마이크로리터와 SpNOx E 대장균 1리터당 5g 건조 셀 중량 600마이크로리터를 4% 알긴산 용액 1.2ml에 추가합니다. 세포와 알긴산을 부드러운 피펫팅으로 혼합하여 기포 형성을 방지합니다.

균일한 크기, 형태 및 강성을 가진 알긴산 비드의 형성을 보장하려면 모든 비드를 덮을 수 있는 충분한 부피의 염화칼슘 용액에 최적의 거리로 알긴산 현탁액을 천천히 적어 넣는 방식으로 추가하는 것이 중요합니다. 바늘을 사용하여 알긴산 세포 현탁액을 주사기에 흡입한 다음 혼합물을 100ml 비이커의 0.3몰 염화칼슘 용액에 계속 교반하면서 첨가합니다. 가교가 일어나도록 교반하지 않고 실온에서 2-3시간 동안 염화칼슘 용액에 비드를 그대로 두십시오.

염화칼슘 용액을 15ml 원추형 튜브에 조심스럽게 부어 구슬을 방해하지 않고 염화칼슘 용액을 디캔팅합니다. 나머지 구슬을 다른 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 과도한 염화칼슘과 캡슐화되지 않은 세포를 제거하려면 50밀리몰의 Tris-HCl 완충액으로 비드를 세척합니다.

비드에 10ml의 완충액을 추가하고 현탁액이 3-5분 동안 방해받지 않고 그대로 두도록 합니다. 비드가 바닥에 가라앉으면 버퍼를 다른 용기에 디캔팅합니다. 이런 식으로 구슬을 세 번 씻으십시오.

주어진 단계에서 구슬을 원심 분리하지 마십시오. 사용한 Tris-HCl 세척 버퍼를 버리지 마십시오. 사용한 세척 완충액 30ml를 이전에 수집한 사용한 염화칼슘 용액으로 당깁니다.

끌어낸 염화칼슘과 Tris-HCl 용액을 20분 동안 3200배 G로 원심분리하여 고정되지 않은 대장균 세포를 펠렛으로 만듭니다. 세척된 비드를 튜브로 옮깁니다. 그 후, 세포 펠릿에 대해 입증된 절차에 따라 L-자일룰로스 생합성을 평가하되 세포 펠릿 대신 세척된 모든 비드를 사용합니다.

L-자일룰로스 생산을 위해 고정화된 생체 촉매의 안정성을 평가하려면 비드가 형성된 후 수집하십시오. 그리고 앞서 그림과 같이 원심분리 없이 10밀리리터의 50밀리몰 Tris-HCl 버퍼로 두 번 세척합니다. 세척된 모든 비드를 사용하여 앞서 설명한 바와 같이 L-자일룰로스 생산을 위한 반응을 수행합니다.

앞서 설명한 바와 같이 비색 분석에 의한 L-자일룰로스 생산을 정량화합니다. 원하는 생산 주기 수에 대해 L-자일룰로스 생산 반응을 반복하고 각 주기에서 반응 상등액에서 생성된 L-자일룰로스의 양을 측정합니다. L-자일룰로스 생산은 이 결합된 전세포 바이오 촉매 시스템에 의해 향상됩니다.

150 밀리몰 L-아리비니톨의 초기 농도에서 시작하여 HjLAD E coli 생체 촉매를 단독으로 사용하여 79% L-자일룰로스의 수율을 생성했습니다. 이에 비해 HjLAD E 대장균 및 SpNOx E 대장균 세포를 1:1 비율로 사용하면 96% L-자일룰로오스의 수율이 생성되었습니다. 생체 촉매 고정 효율에 영향을 미치는 파라미터를 평가한 결과, 알긴산 나트륨 농도가 1-3% 범위에서 증가함에 따라 효율이 증가하는 것으로 나타났습니다.

그러나 알긴산 나트륨 농도가 2%보다 크면 L-자일룰로스 수율이 감소합니다. 2%의 알긴산나트륨 농도를 사용하여 고정을 위한 최적의 염화칼슘 농도와 L-크실룰로스 수율을 0.3 어금니로 결정하였다. 생촉매 재사용성을 평가했습니다.

이 그래프에서 고정 및 자유 결합 전체 세포 생체촉매의 7회 연속 재사용 주기에 대한 L-자일룰로스 생산은 각각 어두운 회색과 밝은 회색으로 표시됩니다. 고정 결합 전체 세포 생체 촉매에 의한 최대 L-자일룰로스 수율은 자유 결합 전체 세포 시스템보다 낮지만 고정화에 의해 재사용성이 향상됩니다. 7 번의 연속 재사용주기가 끝날 때, 고정 된 생체 촉매는 안정성을 유지하고 원래 L- 자일 룰로스 수율의 65 %를 유지했습니다.

개발 후, 이 기술은 바이오 촉매 분야의 연구자들이 완전한 다세포 생체 촉매의 수율과 보조 인자와 관련된 주요 반응을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.