Name: 공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 학습하세요 알긴산 구슬에 공동 고정화된 전체 세포 생체촉매를 이용한 L-자일룰로스 생산 방법을 통해 보조인자 재생 및 재사용성을 향상시키는 효율적인 생명공학 기술입니다.

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이 연구는 교육 과학 기술부 (NRF-2013R1A1A2012159 및 NRF-2013R1A1A2007561), 건국 대학교의 교육부에 의해 투자 한국 연구 재단 (NRF)과 화학 공학 및 MCubed의 부서를 통해 기초 과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다 미시간 대학의 프로그램.

1. 전체 세포 생체 촉매의 제조 참고 : 재조합 E. pET28a- SpNox 31 pET28a- HjLAD 28 대장균 형질 세포 이하 E.라고도 대장균 SpNox 및 E. 대장균 HjLAD, 각각. <ol><li> E.의 단일 식민지의 예방 37 O C, 250 rpm에서 대장균 루리아 - 베르 타니 (LB) 카나마이신 (50 μg의 / ml)로 보충 매체의 3 ㎖에 HjLAD 및 보육 통 O에 품어 / N. </li><li> 1 문화를 희석 : / ㎖ 카나마이신 50 μg의 37 O를 C 부화 포함 신선한 LB의 200ml에 100, 250 rpm으로 외경까지 600 ~ 0.6에 도달한다. </li><li> 배양액에 0.1 mM의 이소 프로필 β-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 HjLAD 단백질 발현을 유도하고 16 O C, 16 시간 동안 180 rpm으로 배양한다. <ol><li> 또한, 25 O C, 200 RP에서 유도을 수행만약 L 생합성 크실 로스 6 HR (하기 단계 2)를위한 m 당일 행한다. </li></ol></li><li> 유도 E. 수확 4 오 ℃에서 20 분 동안 3,200 XG에 원심 분리하여 대장균 HjLAD 세포 뜨는을 취소하고 세포 펠렛을 처리하기 위해 2 단계로 진행합니다. </li><li> E. 1.4 - 병렬로 수행은 1.1 단계 대장균 SpNox. </li></ol> 2. 생합성 커플 링 E.에 의해 L 크실 로스 대장균 HjLAD 및 E. 공동 인자의 재생에 대한 대장균 SpNox <ol><li> E.의 세포 펠렛을 재현 탁 대장균 HjLAD 및 E. 콜라이 SpNox 별도로 5.0 g 건조 세포 무게 (gDCW) / L의 세포 밀도로 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)이다. 참고 gDCW 600 나노 미터 (OD 600)에서 측정 된 광학 밀도 사이의 상관 관계는, 실험을 용이하게 확립 할 수있다. 에 사용되는 수식이 프로토콜은 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 - 다른 분석기에 따라 다를 수 있습니다 0.0965. </li><li> 5.0 gDCW / L E. 600 μl를 혼합 대장균 HjLAD, 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 SpNox, 14 mL의 20 mM의 NAD + 100 ㎕, 2 M의 L-아라 비니 150 μL 둥근 바닥 튜브 및 50 mM 트리스 - 염산 550 μL를 첨가하여이 용액에 반응 부피를 가지고 (PH 8.0) . 주 : 두 전체 세포 생 촉매의 양의 비는 제품의 생합성을 향상시키기 위해 최적화 될 수있다. 서술 된 시스템, E.의 비로 대장균 SpNox : E. 대장균 HjLAD 1 = 1이 L 크실 로스 생합성 (그림 1B)를위한 최적의 것으로 밝혀졌다. </li><li> 30의 C O 8 시간 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 4 O C에서 원심 분리 한 후 상등액을 수집 3,200 XG에 10 분 A에 대한차 아래 3 단계에 설명 된대로 L 크실 로스 생산을 정량화로 진행합니다. </li></ol> L 크실 로스 정량 3. 비색 분석 <ol><li> 기음 1.5 ML 튜브로 단계 2.4에서 수집 반응 상층 액 100 ㎕. </li><li> 1.5 % 시스테인 50 μL, 70 % 황산을 900 ㎕의 에탄올에 용해 된 0.1 % 카바 졸 50 μl를 첨가하고, 튜브를 3 회 반전시켜 부드럽게 혼합한다. </li><li> 입출력 37 C, 20 분 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 560 나노 미터 (560)에서 반응 혼합물의 흡광도를 측정한다. <ol><li> 560는 A 기록이 1 이상이면, 반응 액을 희석한다. </li></ol></li></ol> 칼슘 알긴산 비즈에서 재조합 전체 셀 촉매의 고정화 (4) <ol><li> 100 ml의 증류수에 4g의 알긴산 나트륨을 녹인다. 의를 추가하여 알긴산 용액을 제조물에 대한 비난의 알긴산은 덩어리의 형성을 방지 할 수 있습니다. 필요한 경우 혼합물을 가열한다. </li><li> 5.0 gDCW / L E.의 600 μl를 추가 대장균 HjLAD 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 SpNox 1.2 ml의 4 %의 알긴산 단계 4.1 제조 및 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 피펫 팅하여 세포와 알긴산 섞는다. </li><li> 연속 교반하면서 100 ㎖ 비이커에 (염화칼슘 2) 솔루션을 바늘을 이용하여 주사기에 알지네이트 / 세포 현탁액을 대기음 및 0.3 M 염화 칼슘에 적가 혼합물을 추가합니다. 주 : 알긴산 물방울이 완전히 잠길 수 있도록 알긴산 비드 형성을 위해 사용 CaCl2를 용액의 부피가 충분해야한다. 또한, 주사​​기 바늘과 염화칼슘 수용액의 표면 사이의 거리를 균일하게 구상 비드의 형성을 보장하기 위해 최적의 범위로 유지되어야한다. 거리의 최적 범위는 실험을 결정할 수있다아군과 바늘의 내부 직경에 따라 다르다. 예상 된 바와 같이, ~ 15 ± 5 cm의 거리가 0.6 cm (내경) 주사기 바늘에 대해 최적 인 것으로 밝혀졌다. </li><li> 가교 겔 비드를 형성 할 수 있도록 교반없이 실온에서 3 시간 - 2에 대한 염화칼슘 2 용액에 구슬을 둡니다. </li><li> 조심스럽게 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 CaCl2를 용액을 부어 구슬을 방해하지 않고 CaCl2를 용액을 경사 분리하고, 또 다른 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 CaCl2를 용액에 남아있는 비드 옮긴다. </li><li> CaCl2를 과도 캡슐화되지 않은 세포를 제거하기 위해 50 mM Tris-HCl (pH8.0)을 10 ㎖로 3 회 비드 버퍼 씻는다. 노트: 주어진 단계에서 그들을 파열 것이다 이렇게 같은 구슬을 원심 분리하지 않습니다. 5 분 - 솔루션에서 구슬을 분리하기 위해, 현탁액 3 그대로 방치한다. 비드 바닥에 침전되고 세척 완충액 경사 분리 될 수있다다른 용기에. <ol><li> 사용 된 세척 버퍼를 버리지 마십시오. 단계 4.5에서 수집 CaCl2를 사용한 용액과 사용하는 트리스 -HCl의 세척 완충액 (30 ㎖)을 풀. </li></ol></li><li> 미 고정 E. 펠렛 풀링 된 CaCl2를 트리스 - 염산 용액을 원심 분리하여 대장균 세포는 20 분 동안 3200 × g으로 46 단계에서 수집. 단계 2.1에 기재된 바와 같이 고정화 효율을 결정하기 gDCW / L의 펠릿 캡슐화되지 않은 세포의 밀도를 계산한다. </li><li> 튜브로 단계 4.6에서 세척 구슬을 전송합니다. 단계 2.2에 따라 - 3.4 세포 펠렛 대신에 세정 비드를 모두 사용하여 L 크실 로스 생합성을 평가. </li></ol> L 크실 로스 생산을위한 고정화 생체 촉매 5. 안정성 분석 <ol><li> 단계 4.8에서 비드를 수집한다 (단계 4.6에 기재된 바와 같이)를 원심 분리없이 50 mM 트리스 -HCl (pH 8.0) 완충액 10 ㎖로 두 번 세척 하였다. </li><li> 모든 사용3.4 - 단계 2.2에 기재된 바와 같이 세정 비드의 반응을 수행한다. </li><li> 생산 사이클의 원하는 수의 5.2 각 사이클에서, 반응 상층 액 제조 L 크실 로스의 양을 측정 - 반복 단계 5.1. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다. 이 신문은 알긴산 비드에 고정화 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 생성하는 자세한 방법을보고하는 것을 목적으로한다. 과학 참신은 이전의 연구 (16)에보고되었다.

최근 기술의 발전은 생명 공학 산업에서의 시장 가치의 점진적인 상승의 결과로, 재조합 biotherapeutics의 상용화에 서지을 사용할 수있다. 하나는 이러한 발전은 확장 성 산업 시스템 (38)을 구축에 큰 약속을 보여 주었다 재조합 미생물의 대사 공학의 출현이다. 대부분의 프로세스에서와 같이, 유전자 조작 된 미생물에 의해 생산 된 재조합 생 분자의 성공적인 상업화는 시스템 (39)의 제조 수율에 크게 의존한다. 이것은 생 촉매 효소 지향 진화 생 촉매 활성 셋을 향상시키기 위해 구현 된 &quot;무차별&quot;유전 (39)의 신속한 개발을 주도하고있다. 그러나, 레 독스 경로 특정 대사 경로에 대한 단순한 생체 촉매 개선 OTH의 큰 영향으로 인해 생산의 경제 화에 영향을 충분하지이러한 고가의 보조 인자로서 어 필수 반응 요구. 스케일 업에도 향상된 생 촉매와 같은 시스템, 단지 생산 비용을 증가시키는 역할을한다. 따라서, 추가적인 전략...

3 - 미생물을 이용한 환원 전체 세포의 생체 내 변화는 상업적 및 치료 중요한 생체 분자 하나의 화학 - 효소 합성을위한 광범위한 방법이되고있다. 7 - 그것은 절연 효소의 사용을 통해 여러 장점, 특히 비용 집약적 인 하류 정제 공정의 제거 및 연장 된 수명 (4)의 증명을 제공한다. 보조 인자가 제품의 형성에 요구되는 경로를 생 촉매를 들어, 전체 - 셀 시스템은 저렴 전자공 공동 5,8,9 기질의 첨가를 통해 원위치 팩터 재생에 제공 할 가능성이있다. 13 - 그러나, 이러한 능력은 희귀하거나 고가 공동 기판 (10)의 화학량 론적 농도를 반응에 필요로 감소된다. 함께 전체 세포의 가난한 재사용으로,이 확장 가능하고 연속의 produ의 설립을 방해ction 시스템. 이러한 보조 인자 - 의존 생물 전환을위한 전체 전지 시스템의 전략적 변형은 상기 한계를 극복해야한다. 특히, 협력 작업 전체 세포 생체 촉매의 조합은 상당히 품은 효소 (14)의 생산성 및 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다. 종종 상업적 제품의 대량 생산을 가능하게하는 중요한 요인은 공동 고정화 미생물 생 촉매 (15)에 의해 더 최적화 될 수있다. 우리는 최근 L 크실 로스 생산 (16)에 대한 보조 인자 재생 및 생 촉매의 고정화를 모두 할 수있는 간단하고 재사용 가능한 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이 연구에서,이 시스템은 개선 된 생물 전환 수율 및 생체 촉매의 재사용을 위해 두 가지 전략을 적용하는 실험 절차를 설명하기위한 예로서 사용되었다. L 크실 로스는 CIA 요원에 속하는생물학적으로 유용한 분자의 SS는 희소 당을 이름. 희귀 설탕은 자연에서 매우 드물게 발생 고유 단당류 또는 당 유도체, 그러나 생리 활성 분자 (17, 18)의 인식 요소로 중요한 역할을한다. 그들은 감미료, 기능성 식품의 잠재적 인 치료제 (19)에 이르기까지 다양한 응용 프로그램이 있습니다. L 크실 로스 여러 α-글루코의 전위 억제제로서 사용될 수 있으며, 또한 간염이나 간경변 17, 20의 지표로서 사용될 수있다. 전체 셀 시스템 L 크실 로스에 자일리톨 고효율 변환 판토 이전에보고되었다 (21, 22)는, 알칼리 게 네스 SP ananatis. 701B 23 바실러스 창백 Y25 24,25 대장균 26. E.에서 대장균은, 그러나, 높은 인해 하나 이상의 초기 자일리톨 농도 전위 억제 효과가 낮은 (&lt;67 mM)을 자일리톨의 농도 (26)를 통해서만 이루어졌다자일리톨-4-탈수소 효소 활성 21,26에서 00 밀리미터. 크실 로스 및 자일리톨 간의 열역학적 평형 강력 자일리톨 25, 27의 형성을 선호하는 것으로 나타났다. 또한, 크실 로스 수율 시츄 팩터 재생 시스템에서의 부재에 제공되어야하는 고가의 보조 인자의 양에 의해 제한된다. 함께, 이러한 요인 L 크실 로스 생합성 지속 시스템에 확장 가능성을 제한한다. 이러한 한계를 극복하고 L 크실 로스 생물 전환 수율을 향상시키기 위해, 보조 인자의 재생 전략은 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 확립함으로써 제를 사용 하였다. 구체적으로, L- 아라 비니 -4- 탈수소 Hypocrea의 jecorina 행 (EC 1.1.1.12) (HjLAD) 진균의 L-아라비 이화 경로의 효소, L-크실 로스 (28, 29)에 L-아라 비니의 전환을 촉진하기 위해 선택된 . 많은 생합성 효소와 같은 주요 limitatioHjLAD의 N은 상기 전환을 수행하기 위해 고가의 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드의 보조 인자 (NAD +, NADH의 산화 된 형태)의 화학량 론적 양을 필요로한다는 것이다. 연쇄상 구균 화농 (SpNox)에서 발견 된 NADH 산화 효소는 높은 보조 인자 - 재생 활동 (30, 31)를 표시하는 것으로 나타났다. SpNox, E.의이 속성을 활용 L 크실 로스의 제조 HjLAD를 발현하는 대장균 세포와 결합 된 E. NAD +의 재생에 SpNox 발현 대장균 세포는도 1a에 도시 된 커플 링 반응에 의해 도시 된 L 크실 로스 생산을 촉진한다. 최적의 조건 150 mM의 L-아라 비니의 초기 농도를 사용에서 최대 L 크실 로스 수익률은 훨씬 더 효율적으로 문헌에보고 된 것보다이 시스템을, 96 %에 달했다. 전 세포 고정화 전략은 상기 결합 biocatalyt의 재사용을 향상시키기 위해 다음의 이용했다IC 시스템. 전체 세포 고정화 일반적으로 사용되는 방법은 고체 매트릭스, 고분자 네트워크 (32)의 가교 / 함정 수사 및 캡슐에 연결 흡착 / 공유를 포함한다. 이러한 방법 중, 세포 고정화에 가장 적합한 방법은 칼슘 알기 네이트 비드에 캡슐화된다. 그들의 가벼운 겔화 특성, 불활성 수성 매트릭스와 높은 다공성 캡슐화 된 생물학적 (33)의 생리 학적 특성과 기능을 보존하는 데 도움이. 따라서, 결합 된 생 촉매 시스템은 E. 모두 포함 HjLAD 또는 SpNox 은닉 대장균 세포는 7 일주기 이후에 첫 번째 사이클의 전환 수율 65 %를 유지 국지적 고정화 생체 촉매 시스템이 잘 작동 안정성을 입증 L 크실 로스 생산의 다수의 사이클을 사용하는 칼슘, 알기 네이트 비드에 (도 2) 고정화 연속 재사용 자유 전지 시스템은 거의 그 촉매 활성을 잃고있다.

<table><tbody><tr><td>LB 육수&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>피셔</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)</td><td>시그마 알드리치</td><td>I6758-10G</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>B-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>N7004-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-아라비니톨</td><td>시그마 알드리치</td><td>A3506-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320501-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5132</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>알긴산 나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Excella E24 셰이커 인큐베이터</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary 60 UV-Vis 분광 광도계</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810R</td><td>Eppendrof</td><td></td><td></td></tr><tr><td>비커,</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>, Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle</td>, <td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pioneer, 분석 및 정밀 계량 저울,</td><td>오하우스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

우리는 최근 개선 된 생산 수율 및 지속적인 합성을위한 보조 인자 재생 및 생 촉매 고정화의 능력으로, 간단한 재사용과 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이것과는 E. 설명이 이루어진 상기 시스템의 발전을위한 실험 절차 기능적으로 보완 효소를 발현 대장균 균주. 함께,이 두 효소는 생물 반응의 제품 수율 향상을위한 고가의 보조 인자의 재생을 중재하기 위해 공동으로 작동 가능하게 작동 할 수 있습니다. 또한, 칼슘, 알긴산 비드의 전체 세포의 밀봉하여 결합하는 생 촉매 시스템의 고정 된 형태를 합성하는 방법이보고되어있다. 예를 들어, 우리는 E. 결합하여 L-아라 비니에서 L 크실 로스의 개선을 제시 생합성 효소 L-아라 비니 NADH 탈수소 효소 혹은 산화 효소를 발현하는 대장균 세포. 최적의 조건에서 (150)의 초기 농도를 사용하여밀리미터 L-아라 비니는 최대 L 크실 로스 수율은 문헌에보고 된 것보다 높은 96 %에 도달. 자유 전지 시스템은 거의 완전하게 촉매 활성을 상실하는 동안 결합​​ 전체 세포 생 촉매의 고정 된 형태는 연속적으로 재사용 7 사이클 이후 첫 번째 사이클에서 얻어진 수율은 65 %로 유지하는 우수한 작동 안정성을 보여 주었다. 따라서, 여기에보고 된 방법은 L 크실 로스의 산업 생산뿐만 아니라, 일반적으로 보조 인자의 사용을 요구하는 다른 부가가치 화합물을 향상시킬 수있는 두 가지 전략을 제공한다.

보조 인자의 재생을 가능하게하기 위해, L 크실 로스 합성 E. 함유 결합 전체 세포 생 촉매 시스템 행했다 대장균 HjLAD 및 E. 대장균 SpNox 세포. 다양한 파라미터의 최적화에 따라,이 시스템의 재사용 칼슘 알기 네이트 비드에 (도 2)를 고정함으로써 개선되었다. 커플 링 E.에 의해 공동 인자 재생에 L 크실 로스 생산 대장균 HjLAD 및 E. 대장균</stro...

예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 생산 수율과 재사용성을 향상시키기 위해 알긴산 비드에 고정화된 결합 전세포 생체촉매 시스템의 사용법을 시연하는 것입니다. 본 연구에서는 생체촉매 고정화, 안정성, 보조인자 재생 및 전세포 생체촉매와 같은 생체촉매 분야의 핵심 질문들에 답하였습니다. 이 기술의 주요 장점은 보조인자 의존적 경로를 통해 많은 중요한 생체분자의 생산을 개선할 수 있는 단순하면서도 유연한 접근 방식을 제공한다는 점입니다.본 프로토콜에서는 두 가지 재조합 E coli 균주가 사용됩니다. NADH oxidase를 발현하는 SpNOx E coli와 L-arabinitol dehydrogenase를 발현하는 HjLAD E coli입니다. 두 E coli 균주에 대한 절차가 동일하므로, HjLAD E coli를 대상으로만 시연하겠습니다.15 µg/mL의 Ket-A-My-Sin이 첨가된 3 mL의 LB 배지에 HjLAD E coli 단일 콜로니를 접종하고, 진탕 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 15 µg/mL의 Ket-A-My-Sin이 포함된 200 mL의 신선한 LB 배지에 배양액을 1:100 비율로 희석하고, OD 600이 약 0.6에 도달할 때까지 37 °C, 250 RPM에서 배양합니다. 배양액에 0.1 mM IPTG를 첨가하여 HjLAD 단백질 발현을 유도하고, 25 °C, 200 RPM에서 6시간 동안 배양합니다.3200 ×g, 4 °C에서 20분간 원심분리하여 유도된 세포를 수확합니다. 상층액을 제거하고, 다음 섹션에서 설명하는 방식대로 세포 펠릿 처리를 진행합니다. 이 절차를 시작하기 위해, HjLAD E coli와 SpNox E coli의 세포 펠릿을 각각 50 mM Tris-Hcl 버퍼에 세포 밀도가 L당 건조 세포 중량 5 g이 되도록 현탁합니다.14 mL 라운드 바텀 튜브에 5 g dry cell weight/L HjLAD E. coli 600 µL, 5 g dry cell weight/L SpNOx E. coli 600 µL, 20 mM NAD+ 100 µL, 그리고 2 M L-aribinitol 150 µL를 혼합합니다. 50 mM Tris-HCl 550 µL를 첨가하여 반응 부피를 2 mL로 맞춥니다. 반응 혼합물을 30 °C, 200 RPM에서 8시간 동안 배양합니다.8시간 후, 혼합물을 3200 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하고 반응 상층액을 수집합니다. 비색법으로 L-xylulose 생성량을 정량하기 위해, 수집한 상층액 100 µL를 1.5 mL 튜브에 취합니다. 여기에 1.5% cysteine 50 µL, 70% sulfuric acid 900 µL, 그리고 에탄올에 용해된 0.1% Kar-Piz-All 50 µL를 첨가하고, 튜브를 세 번 뒤집어 가볍게 섞어줍니다.반응 혼합물을 37 °C에서 200 RPM으로 20분 동안 배양합니다. 분광광도계를 사용하여 560 nm에서 반응 혼합물의 광학 흡광도를 측정합니다. 4% alginate 용액을 준비하여 고정화 프로토콜을 시작합니다.0.8g의 알긴산 나트륨을 20mL의 증류수에 넣고, 혼합물을 가열하여 알긴산 나트륨을 녹입니다. 4% 알긴산 용액 1.2mL에 리터당 5g 건조 세포 중량의 HjLAD E coli 600µL와 리터당 5g 건조 세포 중량의 SpNOx E coli 600µL를 첨가합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 파이펫팅으로 세포와 알긴산을 부드럽게 혼합합니다.균일한 크기, 형태 및 강도를 가진 알긴산 비드를 형성하려면, 모든 비드를 충분히 덮을 수 있는 부피의 염화칼슘 용액에 세포-알긴산 현탁액을 최적의 거리에서 천천히 한 방울씩 첨가하는 것이 중요합니다. 바늘을 사용하여 주사기로 알긴산 세포 현탁액을 흡입한 후, 지속적으로 교반 중인 100 milliliter 비커 내의 0.3 molar 염화칼슘 용액에 혼합액을 한 방울씩 첨가하십시오. 가교 결합이 일어날 수 있도록 교반 없이 실온에서 2~3시간 동안 비드를 염화칼슘 용액에 그대로 둡니다.비드가 흐트러지지 않도록 주의하며 염화칼슘 용액을 15 mL 원심분리관에 조심스럽게 부어 제거합니다. 남은 비드를 다른 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다. 과도한 염화칼슘과 캡슐화되지 않은 세포를 제거하기 위해, 50 mM Tris-HCl 완충액으로 비드를 세척합니다.비드에 버퍼 10 milliliters를 추가하고, 현탁액을 3~5분 동안 가만히 둡니다. 비드가 바닥에 가라앉으면 버퍼를 다른 용기에 따라냅니다. 이러한 방식으로 비드를 3회 세척합니다.어느 단계에서도 비드를 원심 분리하지 마십시오. 원심 분리 시 비드가 파열될 수 있습니다. 사용한 Tris-HCl 세척 버퍼를 버리지 마십시오. 이전에 수집한 염화 칼슘 용액과 함께 사용한 세척 버퍼 30 milliliters를 함께 회수하십시오.회수된 염화칼슘 및 Tris-HCl 용액을 3200 ×g에서 20분 동안 원심분리하여 고정되지 않은 E coli 세포를 펠렛화합니다. 세척된 비드를 튜브로 옮깁니다. 이어서, 세포 펠렛 대신 세척된 비드 전체를 사용하여 세포 펠렛에 대해 입증된 절차에 따라 L-xylulose 생합성을 평가합니다.L-xylulose 생산을 위한 고정화 생촉매의 안정성을 평가하기 위해, 형성된 비즈를 수집합니다. 그리고 앞서 설명한 대로 원심분리 없이 10 mL의 50 mM Tris-HCl 완충액으로 2회 세척합니다. 세척된 모든 비즈를 사용하여 앞서 시연한 것과 같이 L-xylulose 생산 반응을 수행합니다.앞서 시연한 바와 같이, 비색 분석법을 통해 L-xylulose 생산량을 정량합니다. 원하는 횟수만큼 L-xylulose 생산 반응을 반복하고, 각 사이클의 반응 상층액에 생성된 L-xylulose의 양을 측정합니다. 이 결합된 전세포 생촉매 시스템에 의해 L-xylulose 생산이 증대됩니다.150 millimolar의 L-aribinitol 초기 농도에서, HjLAD E coli 생촉매만을 사용했을 때 79%의 L-xylulose 수율을 얻었습니다. 이와 비교하여, HjLAD E coli와 SpNOx E coli 세포를 1:1 비율로 사용했을 때는 96%의 L-xylulose 수율을 나타냈습니다. 생촉매 고정화 효율에 영향을 미치는 변수들을 평가한 결과, 알긴산나트륨 농도가 1%에서 3% 범위로 증가함에 따라 효율이 증가하는 것으로 나타났습니다.하지만 2%보다 높은 알긴산나트륨 농도는 L-xylulose 수율의 감소를 초래합니다. 알긴산나트륨 농도를 2%로 설정했을 때, 고정화 및 L-xylulose 수율을 위한 최적의 염화칼슘 농도는 0.3 M로 결정되었습니다. 생촉매의 재사용성을 평가하였습니다.이 그래프에서 고정화된 결합 전세포 생촉매와 유리 결합 전세포 생촉매의 7회 연속 재사용에 따른 L-xylulose 생산량이 각각 진한 회색과 연한 회색으로 표시되어 있습니다. 고정화된 결합 전세포 생촉매의 최대 L-xylulose 수율은 유리 결합 전세포 시스템보다 낮지만, 고정화를 통해 재사용성이 향상되었습니다. 7회의 연속 재사용 주기 끝에 고정화된 생촉매는 안정성을 유지했으며, 초기 L-xylulose 수율의 65%를 유지하였습니다.이 기술이 개발된 이후, 생촉매 분야의 연구자들은 완전한 다세포 생촉매의 수율과 보조인자가 관여하는 주요 반응을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

immobilization-multi-biocatalysts-alginate-beads-for-cofactor

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

다음 섹션에서 우리는 생명 의학 애플 리케이션에서 사용할 수 알지네이트요 microspheres의 준비 절차를 설명합니다. 우리는 특히 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로서 세포 및 단백질 캡슐의 이중 목적 multilayered 알지네이트요 microspheres를 만들기위한 기술을 설명합니다.

바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 알긴산 Microspheres의 생성

이 동영상은 신경독성 아밀로이드-베타 분비 세포를 캡슐화하는 고분자 마이크로비드를 제조하는 방법을 보여줍니다. 세포-폴리머 현탁액은 마이크로비드 제조 장치를 통해 처리되며, 칼슘 가교를 통해 폴리머 겔화가 이루어지며 세포 주위에 구형 마이크로비드를 형성합니다. 이 폴리머는 세포 증식을 가능하게 하는 동시에 통제된 장기 아밀로이드-베타 방출을 가능하게 하여 알츠하이머병에 축적되는 것을 시뮬레이션합니다.

알츠하이머병 모델링을 위한 아밀로이드-베타 방출 고분자 마이크로비즈 제작

우리는 순차적으로 온 - 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 - 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.

역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

여기에서는 복강 내 지방 조직에서 열 생산을 위해 지질을 소비하고 비만 마우스의 에너지 소산을 증가시키는 이화 세포의 캡슐화 프로토콜을 제시합니다.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

우리는 동축 노즐을 사용하여 만능 줄기 세포(PS 세포)를 알기네이트 하이드로겔 캡슐에 캡슐화하는 방법을 확립했습니다.  이는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다.  이 기술은 PS 세포의 대량 생산과 줄기 세포 틈새 시장에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

헤파린과 프로타민으로 제조된 자체 조립 고분자 전해질 복합체(PEC)를 알긴산 비드에 증착하여 골생성 성장 인자의 방출을 가두고 조절했습니다. 이 전달 전략은 척추 융합 응용 분야에서 BMP-2 선량을 20배 줄일 수 있습니다. 이 문서에서는 PEC의 이점과 제조를 설명합니다.

헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합

이질적인 세포 집단을 가진 하중지지 조직의 엔지니어링 및 분석은 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 하나의 구조 내에서 다양한 세포 집단의 공동 배양을 위한 플랫폼으로서 이중층 알기네이트 하이드로겔 디스크를 만드는 방법을 설명합니다.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

이 동영상과 원고는 단순 교반 용기를 사용하여 큰 배치로 생산할 수있는 0.5 % ~ 10 % 알긴산 염 비즈로 포유류 세포를 캡슐화하는 유제 기반 방법을 설명합니다. 캡슐화 된 세포는 시험 관내에서 배양 되거나 세포 치료 응용을 위해 이식 될 수 있습니다.

간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

이 프로토콜은 세포를 고정화시키는 알긴산의 신속한 물리적 겔화에 의한 세포 캡슐화 방법을 예시한다. 얻어진 마이크로비드는 시간이 지남에 따라 아밀로이드-β의 제어되고 지속적인 분비를 허용하고 시험관 내 및 생체 내 모델에서 분비 된 아밀로이드-β의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

알츠하이머 병 모델링에 사용하기 위한 아밀로이드-β-분비 알긴산 마이크로비드 의 제조

여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

학습하세요 알긴산 구슬에 공동 고정화된 전체 세포 생체촉매를 이용한 L-자일룰로스 생산 방법을 통해 보조인자 재생 및 재사용성을 향상시키는 효율적인 생명공학 기술입니다.

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

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