에서 차 신경 발생 평가 Xenopus의 배아 사용하여 면역 염색

이 실험의 전반적인 목표는 발달 중인 xenopus 배아 뇌에서 다양한 신경 세포 집단을 빠르고 편리하게 시각화할 수 있도록 하는 것입니다. 이러한 방법은 xenopus 중추 신경계에서 신경 세포 분화 조절 과정을 관찰하는 것과 같은 1차 신경 발생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 실험 내에서 신경 줄기 세포 전구 세포 풀과 차별화된 1차 신경 풀을 동시에 관찰할 수

이 절차를 시작하려면 기포가 발생하지 않도록 플라스틱 또는 유리 피펫을 사용하여 유리 바이알에서 5-10개의 배아를 조심스럽게 흡인합니다. 배아를 장착 챔버로 옮기고 입체경으로 관찰합니다. 섹션 블록의 강성을 보장하기 위해 장착 챔버에 젤라틴 용액을 채우십시오.

다음으로, 한 쌍의 가는 끝 집게를 사용하여 배아를 나란히 배열합니다. 극저온 호환 마커를 사용하여 챔버 가장자리에 화살표를 그려 헤드 방향을 표시합니다. 여러 그룹의 배아에 대해, 해당 방의 가장자리에 각 그룹에 대한 설명을 적어둡니다.

그런 다음 드라이 아이스로 반쯤 채워진 거품 상자에 챔버를 수평으로 조심스럽게 놓습니다. 뚜껑을 닫고 장착 챔버가 5-10분 동안 한 번에 하나씩 얼도록 합니다. 그 후, 동결 절편을 진행하거나 면역원성을 잃지 않고 최소 1-2주 동안 섭씨 80도에서 냉동 샘플을 보관하십시오.

이 절차에서는 뭉툭한 막대기나 손가락으로 챔버 바닥을 눌러 챔버에서 얼어붙은 샘플 블록을 제거합니다. 그런 다음 샘플 보유 디스크에 조직 동결 매체를 몇 방울 떨어뜨립니다. 배아의 앞쪽 끝이 위를 향하도록 샘플 블록을 장착하고 장착된 블록을 약 1분 동안 또는 조직 동결 매체가 불투명해질 때까지 저온 유지 챔버 내부에 둡니다.

즉시 s를 설치하십시오.ample 블록의 바닥면이 위를 향하도록 하여 마이크로톰에 디스크를 고정합니다. 샘플 블록이 여전히 비교적 부드러울 때 블레이드를 사용하여 샘플 블록의 일부를 잘라냅니다. 그런 다음 샘플이 담긴 디스크를 마이크로톰에 최소 5분 동안 그대로 두어 온도가 평형에 도달할 수 있도록 합니다.

그 후, 반투명 젤라틴을 통해 올챙이의 머리가 보일 때까지 샘플 블록을 점차적으로 다듬습니다. 트리밍 속도를 높이려면 단면 두께를 늘립니다. 블레이드의 날카로움 및 각도와 같은 저온 유지 장치 성능을 모니터링하여 후속 섹션이 긴 스트립에서 생성되도록 합니다.

올챙이 머리가 보이면 저온 유지 장치의 설정을 다시 정상으로 조정하여 완성된 조각이 스트립을 형성할 수 있고 블레이드와 겹치거나 달라붙지 않도록 합니다. 그런 다음 올챙이의 머리가 거의 드러날 때까지 계속 다듬습니다. 샘플 섹션 수집을 시작하기 전에 스테이지의 잔여 부분을 모두 털어냅니다.

약 10-15 개의 섹션을 만들고 긴 스트립을 형성하도록합니다. 두꺼운 덮개 유리판을 옆으로 뒤집고 가는 끝 페인트 브러시를 사용하여 칼날에서 스트립을 부드럽게 제거합니다. 다음으로 장축이 블레이드와 평행하도록 스테이지에 배치합니다.

10-15 개의 섹션을 만들고 끊어지지 않고 긴 스트립을 형성하도록하십시오. 쉽지 않을 수 있으며 연습이 필요합니다. 한 가지 비결은 핸드휠에 속도를 너무 높게 적용하지 않는 것입니다.

오히려 핸드휠을 조심스럽고 천천히 돌리십시오. 그런 다음 실온에서 양전하를 띤 슬라이드 하나를 선택하고 연필로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 레이블이 있는 면이 아래를 향하도록 스트립에 빠르고 단단히 누릅니다.

그런 다음 저온 유지 장치 챔버에서 슬라이드를 제거합니다. 이 단계를 반복하여 각 슬라이드에 20-30개의 슬라이스를 병렬로 정렬합니다. 측면을 10분 동안 자연 건조한 다음 즉시 면역염색 절차를 진행하거나 면역염색 절차를 수행하기 전에 최대 3-6개월 동안 섭씨 80도의 슬라이드 상자에 슬라이드를 보관합니다.

여기에서 우리는 다음 이미지에 대한 위치 참조를 제공하는 데 사용되는 xenopus 올챙이의 전뇌, 중뇌, 후뇌 및 척수의 해당 단면 평면을 볼 수 있습니다. Anti-Sox 3, Anti-Acetylated Tubulin 및 DAPI로 염색된 해당 단면은 신경관 내 신경 필라멘트뿐만 아니라 신경 줄기 세포 풀의 상대적 위치를 보여줍니다. 다음은 Anti-MyT1 및 DAPI로 염색된 해당 단면으로, 신경관 내에서 분화된 1차 뉴런의 상대적 위치를 보여줍니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 드라이아이스의 샘플 블록에 충분한 냉각 시간을 보장하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 샘플 블록이 충분히 단단하지 않아 절단하기 어려울 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 발달 신경과학 분야의 연구자들이 제노푸스 중추신경계의 신경 분화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 절편을 만드는 방법을 잘 이해하고 이종신경계에서 특정 신경 세포 풀을 관찰할 수 있습니다.