머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

이 절차의 전반적인 목표는 두경부 편평 세포 암종 또는 HNSCC 세포주에서 암 줄기 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 종양 방사선 저항을 극복하기 위해 화학 요법을 사용하는 방법에 대한 암 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 HNSCC 세포주에서 암 줄기 세포의 높은 특이성을 달성하기 위해 마커 조합을 사용한다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 우리 기술자인 Prescillia Battiston-Montagne와 제 연구실의 박사인 Marion Gilormini가 맡을 것입니다. Hoechst 염료 유출 분석에 의하여 암 줄기 모양 세포의 옆 집단을 선정하기 위하여는, 첫번째 표지: 1개의 원뿔 관 Hoechst 및 1개의 Hoechst 및 Verapamil. 다음으로, HNSCC 세포 배양액을 멸균 PBS로 세척한 다음 Tripsyn EDTA 1ml를 첨가합니다.

섭씨 37도에서 3분 후 신선한 세포 배양 배지로 반응을 중지하고 세포를 계수합니다. 배양액을 10배로 10배로 희석하여 밀리리터당 7번째 세포를 만들고 모세포주 배지를 완성합니다. 그런 다음 Hoechst 및 Verapamil 튜브에 100마이크로리터를 추가하고 Hoechst 튜브에 4ml의 셀을 추가합니다.

다음으로, 10 마이크로 리터의 5 밀리 몰 베라파밀 하이드로 클로라이드 용액을 Hoechst 및 Verapamil 샘플에 부드럽게 혼합 한 다음 1 곱하기 10 당 5 마이크로 리터의 Hoechst를 두 튜브에 6 번째 셀로 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도에 놓습니다. 90분 후 15분마다 부드럽게 혼합하여 튜브를 원심분리하고 펠릿을 2ml의 PBS에 다시 현탁시킵니다.

중앙 원심분리 후, Hoechst 및 Verapamil 펠릿을 PBS의 프로피듐 요오드화물 500마이크로리터와 Hoechst 펠릿 4ml에 재현탁합니다. 이제 70미크론 세포 스트레이너를 통해 샘플을 FACS 튜브로 필터링하여 응집체를 제거하고 샘플을 빛으로부터 보호된 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, Hoechst 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 유세포 분석기 소프트웨어에서 Global Worksheet 창을 엽니다.

Dot Plot을 클릭하여 Global Worksheet에 그래프를 생성하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 전방 및 측면 산점도 매개변수를 선택합니다. 같은 방식으로 측면 산란 높이 점도표로 측면 산점도를 만든 다음 다각형 게이트를 클릭하여 두 번째 그래프에서 P1 영역을 만들고 단일 셀을 선택하고 이중선을 구별합니다. 다음으로, 파란색 Hoechst 영역 점도표로 빨간색 Hoechst 영역을 만들고 셀을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 P1 모집단을 강조 표시합니다.

그런 다음 P2 세포의 주요 집단의 왼쪽에 사이드 암으로 나타나는 세포의 부정적인 Hoechst 염료 측 집단을 선택하고 Hoechst 샘플 이벤트 10, 000을 수집합니다. 측면 모집단을 나타내는 P2 게이트가 올바르게 배치되었는지 확인하려면 10, 000개의 Hoechst 및 Verapamil 샘플 이벤트도 수집합니다. 사이드 개체군이 사라져야 합니다.

그런 다음 Hoechst 염료 음성 세포의 측면 개체군을 1밀리리터의 완전한 암 줄기 유사 세포 배지가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브로 분류합니다. 종류가 끝나면 세포를 스핀 다운하고 측면 집단 펠릿을 1 밀리리터의 신선한 완전한 암 줄기 모양의 세포 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 세고 적절한 수로 새로운 세포 배양 플라스크에 파종합니다.

분류된 측면 집단 세포에서 CD44-high/ALDH-high 하위 집합을 선택하려면, 먼저 표시된 대로 7개의 멸균 15ml 원추형 튜브를 레이블합니다. 다음으로, 분류된 세포를 줄기세포 배지의 1밀리리터당 7개 세포에 10배 희석하고 100마이크로리터의 세포를 염색되지 않은 CD44-APC 및 IGG1-APC 튜브에, 4밀리리터의 세포를 ALDH 및 CD44-APC 튜브에 모두 얼음 위에서 분취합니다. 세포를 스핀다운하고 염색되지 않은 CD44-APC 및 IGG1-APC 펠릿을 ALDEFLUOR 키트의 버퍼 100마이크로리터에 재현탁합니다.

그런 다음 ALDH 억제제 DEAB 5마이크로리터를 ALDH 및 DEAB, ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브에 추가합니다. 키트의 버퍼 1 4ml와 시약 20마이크로리터를 포함하는 시약 C 4ml에 ALDH 및 CD44-APC 튜브의 세포를 재현탁하고 이러한 세포 100마이크로리터를 ALDH, ALDH 및 DEAB, ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브로 즉시 이동합니다. 그런 다음 모든 튜브를 섭씨 37도의 수조에 30분 동안 넣고 빛으로부터 보호하십시오.ample은 15분 후에 부드러운 소용돌이로 혼합합니다.

배양이 끝나면 모든 샘플을 원심분리하고 상등액을 버립니다. 그런 다음 모든 튜브를 얼음 위에 놓고 ALDH 및 CD44-APC 펠릿을 4ml의 버퍼 A, CD44-APC 및 ALDH DEAB 및 CD44-APC 펠릿 100마이크로리터에 재현탁합니다. IGG1-APC 펠릿을 100마이크로리터의 버퍼 B에 재현탁시키고 염색되지 않은 ALDH 및 ALDH 및 DEAB 튜브를 100마이크로리터의 버퍼 1에 재현탁합니다.

10분 후 모든 샘플을 다시 스핀다운한 다음 ALDH 및 CD44-APC 샘플을 제외한 모든 샘플에 대해 1ml의 버퍼 1로 세척하고 4ml의 버퍼 1로 세척합니다. 두 번째 원심분리 후, 4ml의 버퍼 1에 재현탁된 ALDH 및 CD44-APC 샘플을 제외한 모든 펠릿을 1ml의 새로운 버퍼 1에 재현탁합니다. 이제 ALDH 및 CD44-APC 튜브를 유세포 분석기에 로드하고 APC by fitsy dot plot을 생성하여 이중 염색 모집단을 시각화합니다.

다음으로, ALDH 튜브를 로드하여 ALDH 상위 셀에 대한 게이트를 만듭니다. ALDH 및 DEAB 튜브가 로드되면 양성 세포가 사라져야 합니다. 동일한 그래프에서 CD44-APC 및 IGG1-APC 튜브를 사용하여 두 번째 게이트를 생성하여 CD44 상위 셀을 선택합니다.

IGG1-APC 튜브가 로드되면 양극 세포가 사라집니다. 그런 다음 ALDH 및 CD44-APC 및 ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브를 로드하여 CD44-high/ALDH-high 셀을 포함하는 세 번째 게이트를 만듭니다. 이중 염색 ALDH-CD44 튜브를 사용하여 이중 양성 세포에 마지막 게이트를 배치합니다.

그런 다음 CD44-high/ALDH-high 세포를 1ml의 완전한 암 줄기 유사 세포 배지가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브로 분류하여 원하는 대로 1ml의 완전한 세포 배양 배지에서 CD44-low/ALDH-low 세포를 수집합니다. 두 번째 분류 후, CD44-high/ALDH-high cell을 cell culture incubator에서 완전한 암 줄기 유사 세포 배지가 있는 적절한 세포 배양 플라스크에 18-24시간 동안 플레이트합니다. 세포가 플라스크 바닥에 부착되면 배양 배지를 교체하고 플라스크를 인큐베이터로 되돌립니다.

CD44-high/ALDH-high 세포의 종양 가능성을 확인하기 위해 입증된 바와 같이 암 줄기 모양의 단층을 트립신화하여 단일 세포 현탁액을 얻고 6개의 세포에 10의 1배를 15ml 원뿔형 튜브로 전달합니다. 세포를 회전시킨 후, 재조합 인간 표피 성장 인자 헤파린과 B27이 보충된 혈청이 낮은 배지에 펠릿을 재현탁시키고 광학 현미경으로 종양 구체가 관찰될 때까지 세포 배양 인큐베이터의 저고정 페트리 접시에 세포를 배양합니다. 새로운 세포주에서 처음으로 분류를 수행하는 경우, in vitro에서 무혈청 배지에서 종양 구체를 형성할 수 있는 능력으로 입증된 세포주의 종양 가능성을 확인해야 합니다.

또한, QPCR은 CD44-high/ALDH-high 세포에 의한 베타-카테닌 및 기타 줄기 유사 세포 마커의 높은 발현을 입증해야 합니다. CD44-high/ALDH-high cell은 CD44-low/ALDH-low cell에 비해 소량 주입 시 in situ 종양을 형성할 수 있어야 합니다. 일단 숙달되면 각 세포 분류가 제대로 수행된다면 5시간 내에 완료할 수 있어야 합니다.

이 절차를 시도하는 동안 형광 표지 샘플을 직사광선 노출로부터 보호해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 침입 이동 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 전이 과정에서 암 줄기세포의 관여에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 암 분야의 연구자들이 HNSCC 암에서 종양 탈출 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 다중 파라미터, 유세포 분석 및 세포 분류를 사용하여 HNSCC 세포주에서 암 줄기세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 종양 세포와 삽입하는 DNA 제원을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하려면 항상 실험복과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.