Name: 머리와 목 편평 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 학습하세요 머리와 목 편평상피세포암에서 암 줄기세포를 분리하고 특성화하는 방법을. Hoechst 염료 유출 분석과 유세포 분석을 사용하여 CD44-high/ALDH-high 세포 집단을 식별하고, 종양 재발 및 치료 내성 연구에 활용할 수 있습니다.

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분류하는 동안 조언과 도움을 주신 UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8)의 유세포 분석 플랫폼의 Thibault Andrieu와 Sebastien Dussurgey에게 감사드립니다. 이 작업은 ETOILE 및 Labex-PRIMES(ANR-11LABX-0063)의 과학적 프레임워크 내에서 수행되었습니다.

모든 동물 절차는 동물 보호의 로컬 가이드 라인에 따라 수행 하였다. 이 연구의 모든 세부 사항은 CECCAPP, 프랑스 윤리위원회에 의해 승인되었다. 훽스트 (Hoechst) 염료 유출 분석에 의한 측면 인구 (SP) 1. 선택 <ol><li> 훽스트 33342 염료로 5 천만 세포를 염색. <ol><li> 한 &quot;훽스트 (Hoechst)&quot;라는 레이블이 붙은 튜브와 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;로 표시 한 두 개의 15 ml의에게 원뿔 바닥 멸균 튜브를 준비합니다. 멸균 5mm의 베라파밀 히드로 클로라이드 용액 10 ㎖를 준비한다. 줄기 세포 배양 배지 (CM)을 준비한다. <ol><li> 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) : F12 (1 : 3, V : V) 하이드로 코르티손의 소 태아 혈청, 5 % (FCS), 0.04 ㎎ / ℓ CSC (CM-CSC)에 대한 CM을 제조하기 위해, 다음과 결합 페니실린 100 U / ㎖, 0.1 g / L의 스트렙토 마이신, 및 표피 성장 인자 (EGFR) 20 μg의 / L. </li></ol></li><li> 층류 후드에서 세포를 Trypsinize. 의 세척, 용지를 제거terile 인산 완충 식염수 (PBS)와 75 cm² 플라스크에 대한 트립신 EDTA 1 ㎖ (0.5 g / L)를 추가합니다. 37 ° C에서 3 분을 품어. 부모 세포주 사용 배양액을 첨가하여 반응을 정지. 세포 계수기를 사용하여 세포의 수를 계산. <ol><li> 부모 세포주 (CM-P)에 대한 CM을 준비하려면 10 % FCS, 0.4 밀리그램 / 하이드로 코르티손의 L, 페니실린 100 U / ㎖ 및 0.1 g / 스트렙토 마이신의 L)와 DMEM을 보충합니다. </li></ol></li><li> CM-P 10 7 세포 / ml를 수득하는 단계 1.1.2에서 수득 된 세포 현탁액을 희석. 제조 된 2 튜브에 세포 현탁액을 분할 : 튜브 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;튜브 &quot;훽스트&quot;4 ㎖ (4 × 10 7 세포)에 100 μL (10 6 세포)를 넣습니다. </li><li> 샘플 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;에서, 5 mM의 베라파밀 염산염 용액 (최종 농도 0.5 mM)을 10 μL를 추가하고 부드럽게 혼합한다. (0.1 g / L의 최종 농도) 1g / L 훽스트 용액 5 μl를 추가합니다. 샘플 &amp; #에서(34) 훽스트는 &quot;1g의 5 μl를 추가 / L 훽스트 10 6 세포 당 용액 (200 μL 총) 이제부터, 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호 샘플을 유지.. </li><li> 1 시간 30 분 동안 37 ℃ 수욕에있는 모든 튜브 부화. 정착에서 세포를 방지하기 위해 부드럽게 매 15 분을 섞는다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 원심 분리기 튜브. 상층 액을 제거하고 1X PBS의 2 mL로 각각의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 원심 분리기 튜브. 상층 액을 제거합니다. PBS에 희석 재현 탁 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;5 ㎎ / ℓ 요오드화 프로피 듐 (PI) 500 μL의 펠릿을 완충액 5 밀리그램 / PBS 완충액에 희석 된 L PI 4 ㎖ 중의 &quot;훽스트&quot;펠릿. </li><li> 흐름 cytometer에 샘플 이해를 위해 튜브에서 하나의 셀 집계를 제거하고 수집하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 샘플 솔루션을 전송합니다. 얼음에 샘플을 유지하고 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 나는셀 정렬에 의해 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외 사이드 인구의 solation. <ol><li> 상기 다음 매개 변수를 정렬 유동 세포 계측법에 훽스트 부정적인 세포 분리를 수행 UV 레이저 (355 nm의), 블루 훽스트 (BP를 450/50)과 빨간색 훽스트 필터 (BP를 610/20)와 UV 레이저 경로 2 감지기, 2 집. <ol><li> 첫째, 염색 및 사이토 설정 흐름에 대한 긍정적 인 제어 역할을 샘플 &quot;훽스트 (Hoechst)&quot;를 분석한다. </li><li> &quot;도트 플롯&quot;를 클릭, &quot;글로벌 워크 시트&quot;창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여 (다섯 번째 오른쪽 그림 상단)와 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, FSC-A (앞으로 분산)과 가로축에, SSC-A (측면 분산 형) (그림 1A)를 선택합니다. 같은 방식으로, SCC-H 도트 플롯 대 SSC-W를 만듭니다. 이 두 번째 도트 플롯에, P1 영역을 만들려면 &quot;다각형 게이트&quot;(열네번째 오른쪽 그림 상단) (그림 1B) (33)을 클릭합니다. 참고 : P1 영역이됩니다하나의 세포를 포함하고 이중선을 구별. </li><li> 옵션 : P1에 문 PI 대 FSC-A를 작성하여 PI를 양성 세포를 제외합니다. 이 점 플롯에서 PI 긍정적 인 죽은 세포를 제외 할 PI 부정적인 인구 (P2)을 선택합니다. </li><li> &quot;글로벌 워크 시트&quot;창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여, &quot;도트 플롯&quot;을 클릭하고 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, 블루 훽스트-A를 선택하고 가로축에, 빨간색 훽스트-A. 인구에 오른쪽 클릭으로 &quot;연락처보기 인구&quot;및 P1을 선택합니다. 이 점 플롯에서 영역 (P2) 세포의 주요 인구 (그림 1C)의 왼쪽에있는 사이드 암으로 나타나는 음의 Hoechst 염색 측면 인구 (SP) 셀을 선택하기를 만듭니다. </li></ol></li><li> 샘플 &quot;훽스트 (Hoechst)&quot;를 분석하고 10,000 이벤트를 수집합니다. SP에 인구를 나타내는 게이트 P2가 잘 배치되었는지 확인하기 위해 샘플을 분석 &quot;훽스트 및 베라파밀&quot;(10,000 건)SP 인구 (그림 1D)의 실종을 관찰합니다. </li><li> 1.1.1.1 제조 CM-CSC 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브 내의 SP 훽스트 염료 음성 세포를 수집한다. </li><li> 셀의 정렬이 끝나면, 원심 분리기에서 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을, 상등액을 제거하고 CM-CSC 1 mL로 펠렛을 재현 탁. 세포 계수기를 사용하여 정렬 된 셀의 수를 계산하고, 배양 플라스크에 세포의 적절한 수를 전송할 수있다 (표 1 참조). CM-CSC를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2 분위기에서 품어. </li><li> 5 × 107 세포 (단계 3, &quot;세포 배양 방법&quot;참조)의 최소가 될 때까지이 통로의 최대 동일한 조건으로 배양 세포를 유지한다. </li></ol></li></ol> 측면 인구 조회 결과 순위에서 CD44 높은 / ALDH가 높은 하위 인구의 2 선택 <ol><li> ALDH 검출 키트 및 C와 SP 세포의 50 만 달러를 염색D44 항체. <ol><li> &quot;흠&quot;(튜브 A) &quot;CD44-APC&quot;(튜브 나) &quot;의 IgG1-APC&quot;(튜브 C), &quot;ALDH&quot;(튜브 라) &quot;ALDH 및 DEAB을 다음과 같이 일곱 15 ml의를 표시 멸균 튜브를 준비합니다 &quot;(튜브 전자),&quot;ALDH 및 CD44-APC &quot;(튜브 F),&quot;ALDH, DEAB 및 CD44-APC &quot;(튜브 g). 염색 동안 4 ° C에서 모든 튜브와 시약을 보관하십시오. </li><li> 4.5 (키트에 포함) 버퍼 1 mL 및 CD44-APC (알로 피코) 항체 (: 100 희석 1) 45 μL와 버퍼 A를 준비합니다. 버퍼 (1) 100 ㎕와의 IgG1-APC 항체의 1 μL (: 100 희석 1)와 버퍼 B를 준비합니다. 버퍼 (1)의 4 ml의 키트의 시약에 20 ㎕의 완충액 C를 준비한다. </li><li> 107 세포 / ml의 이전 정렬 세포 (단계 1.2.5)의 세포 현탁액을 준비한다. A, B 및 C, 및 튜브 F 4 ㎖ (4 × 107 세포)를 튜브 세포 현탁액 100 μL (10 106 세포)를 추가한다. 순간 튜브 D, E와 g에서 세포를 넣지 마십시오. </li><li> 5 분 동안 250 XG에 세포를 포함하는 튜브를 원심 분리기. diethylaminobenzaldehyde의 5 μL (DEAB), 튜브 전자와 g에 ALDH 억제제를 추가 상층 액을 제거하고 튜브 A, B 및 버퍼 (1) 100 ㎕에 C에서 펠렛을 재현 탁. <ol><li> 4 ml의 시약 C와 즉시 F 튜브를 Resuspend 세포는 튜브 D, E와 g에 100 μl를 전송합니다. 30 분 동안 37 ℃ 수욕에있는 모든 튜브 부화 알루미늄 박을 사용하여 직접 노광으로부터 보호한다. 침강 세포를 방지하기 위해 15 분 후 가볍게 볼 텍싱하여 세포 현탁액을 혼합한다. </li></ol></li><li> 이 순간부터, 얼음에 튜브를 유지하고 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호. 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 튜브가 뜨는을 제거합니다. </li><li> 4 mL 및 다른 관으로 버퍼 B. 100 ㎕와 버퍼 A. 재현 탁 관 C 100 ㎕와 b를 g 튜브에 재현 탁 튜브 F 1. 품어 10 분 4 °에서 버퍼의 100 μl를 추가;기음. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 튜브가 뜨는을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 다시 1 버퍼 1 ㎖ (튜브 F 4 ㎖) 및 원심 분리기로 한번 씻어. 뜨는을 제거합니다. 다시 일시 중지 4 mL 및 버퍼 (1) 1 ㎖에있는 다른 모든 튜브 튜브 F 펠렛을. </li><li> 사이토 흐름에 샘플 이해에 대한 적절한 튜브 단일 세포 집계를 제거하고 수집하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 샘플 솔루션을 전송합니다. </li></ol></li><li> 형광에 의한 CD44 고 / ALDH 높은 세포 인구의 격리 셀 정렬을 활성화. <ol><li> 수행 CD44 높은 / ALDH 상기 다음 매개 변수를 정렬 유동 세포 계측법에 정렬 높은 세포하십시오 FITC 필터 (30분의 530), 1과 블루 레이저 경로에 블루 레이저 (488 nm의)과 적색 레이저 (633 nm의), 1 검출기 APC에서 필터 (20분의 660), 2 집과 적색 레이저 경로 검출기. </li><li> 사이토 소프트웨어를 사용하여 점 플로 &quot;를 클릭t &quot;(다섯 번째 오른쪽 사진) 섹션 1.2.1.2에 기술 된 바와 같이, SSC-A 도트 플롯 대 FSC-A를 생성하는 세포 형태를 확인하고 SSC-H 대 SSC-W와 함께 단일 세포로 구성 인구를 선택 도트 플롯. </li><li> &quot;글로벌 워크 시트&quot;창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여, &quot;도트 플롯&quot;을 클릭하고 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, 이중 스테인드 인구를 선택하기 위해 APC-A 및 가로 좌표, FITC-A에를 선택합니다. ALDH 높은 세포 (그림 2A)을 선택 D와 E 튜브를 사용하여 게이트를 만듭니다. 참고 : 긍정적 인 세포 DEAB (그림 2B)로 처리 튜브 전자에서 사라집니다. <ol><li> 같은 차트에서 CD44 높은 세포 (그림 2C 및 2D)를 선택하기 위해 튜브 b와 c를 사용하여 제 2 게이트를 만들 수 있습니다. 양성 세포의 IgG1-APC를 포함하는 튜브에 사라진다. F와 G 튜브를 분석하고 CD44 높은 / ALDH을 &lt;포함하는 제 3 게이트를 만들SUP&gt; 높은 세포 (그림 2E 및 2 층). 주 : 양성 세포의 IgG1-APC (도 2d)를 포함하는 튜브에 존재하는 경우, 세포와 APC 염색 항체 사이의 상호 작용은 특정하지 않다. </li></ol></li><li> CM-CSC 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 높은 CD44 / ALDH에게 높은 세포를 수집한다. CM (19) 1 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브에 저 또한 CD44 저 / ALDH를 수집합니다. 참고 : 단계 1.1.1.1에 기술 된 바와 같이 CM-CSC를 준비합니다. </li><li> 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리하여 상층 액을 제거하고, CM-CSC 1 mL로 펠렛을 재현 탁. 정렬 된 셀의 수를 계산. </li></ol></li></ol> 3. 세포 배양 방법 <ol><li> 전술 한 바와 같이 셀의 두 분류 후에, 5 % CO 2, 37 ℃에서 CM-CSC와 적절한 배양 플라스크 (표 1)에 정렬 된 셀 플레이트. 18 ~ 24 시간 후,세포가 부착 된 경우 확인하고 배지를 변경합니다. 확대 식민지는 50 %의 합류보다 큰까지 3 일마다 배지를 변경합니다. </li><li> 문화 플라스크에서 세포를 Trypsinize하는 EDTA (표 1) - 트립신 0.5 g / L의 적절한 볼륨을 사용합니다. 37 ° C에서 세포에게 3-5 분을 품어. 트립신의 작용을 중지 CM-CSC (표 1)의 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 얻어진 세포와 판 CM-CSC와 175 cm² 문화 플라스크에 4 × 10 5 세포의 수를 계산합니다. 37 ° C에서 품어 5 % CO 2. 이 농도에서 24 시간의 배가 시간이 세포는 7 일 70 % 합류 할 것이다. </li><li> 그들은 3 구절을 시행하기 전에 시험 관내 또는 생체 내 실험에서 암줄 기세포를 사용합니다. </li></ol> 종양의 가능성과 CSC 특성 4. 확인 <ol><li> 종양 구 형성은 CD44 높은 / ALDH의 종양 가능성을 확인하기 위해높은 세포. <ol><li> 3.2에 기재된 바와 같이 세포를 Trypsinize. 5 분 동안 250 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 1 × 10 6 세포를 추가합니다. 뜨는을 제거하고 DMEM에서 펠렛 다시 일시 : F12 (3 : 1) rhEGF 처치의 매체 FCS 무료, 20 ng를 / ㎖, 헤파린 및 1 배 B27의 4 ㎎ / ℓ를. 37 ° C에서 6도 낮은 고정 플레이트 문화 플라스크에 세포를 품어 5 % CO 2. 주 : 사용을 DMEM : F12 (3 : 1) FCS의 5 %, 20 ng를 rhEGF 미 / ㎖, 4 밀리그램 / L 헤파린 및 1X B27 셀은 FCS없이 증가하지 않는 경우를 포함하는 매체. </li><li> (도 3a)를 파종 한 후 4 내지 10 일에서 광학 현미경으로 종양 형성 영역을 관찰한다. 참고 : 종양 구 직경이 35 개 이상의 μm의 수 있어야합니다. CD44 고 / ALDH 높은 세포는 CD44 저 / ALDH의 낮은에 비해 수와 크기면에서 더 빠르고 향상된 종양 구 형성을 표시합니다. </li></ol></li><li> 생체 내 종양 유발의 평가 후NOD-SCID 마우스에서 CD44 높은 / ALDH 높은 세포의 피하 주사. <ol><li> 정렬 후, 세 가지 농도 (104 세포 / ㎖, 105 세포 / ㎖, 10 6 세포 / ml)에서 PBS로 세포를 재 - 보류. 6 마우스의 우측 옆구리에 피하 영역 10 4 세포 / ㎖ (× 103 세포) 100 ㎕를 주입한다. 105 세포 / ㎖ (104 세포) 및 106 개 세포 / ㎖ (105 세포)를 위해 동일한 작업을 수행. 참고 : 10 3 세포를 테스트 할 수있는 것보다 낮은 희석. </li><li> 왼쪽 측면 지역에서 CD44 저 / ALDH 낮은 세포의 동일한 농도를 주입한다. 최대 10 주 동안 모니터 주입 된 마우스는 종양 진행 (19)을 볼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li>
<li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Dalerba, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+human+colorectal+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).</li>
<li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumorigenic+subpopulation+with+stem+cell+properties+in+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas.</a> Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).</li>
<li>Prince, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+cells+with+cancer+stem+cell+properties+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Soltanian, S., Matin, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and cancer therapy.</a> Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Normal+stem+cells+%27Jedi%27+that+went+over+to+the+%27dark+side.%27%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'.</a> Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+and+chemoresistance+of+CD133%2B+cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma.</a> Mol Cancer. 5, 67(2006).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+Cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Bertrand, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Head+and+Neck+Cancer+Stem+Cells+to+Overcome+Resistance+to+Photon+and+Carbon+Ion+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+tumor+stemness+by+increasing+the+invasive+and+tumorigenic+side+population+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction.</a> Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).</li>
<li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li>
<li>Chen, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+concept+in+progression+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer.</a> J Oncol. 2009, 894064(2009).</li>
<li>Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+oral+squamous+cell+carcinoma+possesses+tumor+stem+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes.</a> Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+CD133%28%2B%29+cancer+stem-like+cells+characterized+in+human+oral+squamous+cell+carcinoma+confer+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy.</a> Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).</li>
<li>Sun, S., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+neck+squamous+cell+carcinoma+c-Met%E2%81%BA+cells+display+cancer+stem+cell+properties+and+are+responsible+for+cisplatin-resistance+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis.</a> Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+putative+marker+for+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).</li>
<li>Lim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+traits+in+squamospheres+derived+from+primary+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas.</a> Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).</li>
<li>Yu, Q., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-localized+matrix+metalloproteinase-9+proteolytically+activates+TGF-beta+and+promotes+tumor+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.</a> Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).</li>
<li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-initiated+signaling+promotes+the+survival+and+self-renewal+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).</li>
<li>Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+properties+of+CD44%2B+cancer+stem-like+cells+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).</li>
<li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cucurbitacin+I+suppressed+stem-like+property+and+enhanced+radiation-induced+apoptosis+in+head+and+neck+squamous+carcinoma--derived+CD44%28%2B%29ALDH1%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells.</a> Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).</li>
<li>Clay, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-marker+identification+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+with+aldehyde+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase.</a> Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).</li>
<li>Meinelt, E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeinelt%2C+E+%22Technical+Bulletin%3A+Standardizing+Application+Setup+Across+Multiple+Flow+Cytometers+Using+BD+FACSDiva+Version+6+Software%22">Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software</a>. , BD Biosciences. (2012).</li>
<li>Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+one+of+the+markers+of+cancer+stem+cells+in+Hep-2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.</a> Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).</li>
<li>Fukusumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+as+a+novel+marker+of+therapeutic+resistance+and+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).</li>
<li>Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+as+a+molecular+marker+to+screen+cancer+stem+cells+in+hypopharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer.</a> Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).</li>
<li>Kanojia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+cancer+stem+cells+derived+from+primary+tumors+of+HER2%2FNeu+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice.</a> Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
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이 프로토콜은 다른 HNSCC 세포주에 적용되는 특정 세포주에서 CSC 추가의 성공적인 분리를위한 신뢰성있는 방법을 설명한다. 격리 된 머리와 목 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스 (19)에 이식하여 체외 및 기능 검증에 더 분자 특성화 다음에 적합하다. 그러나 일부 수정 측면 인구 또는 부모 세포주에 존재하는 CD44 고 / ALDH 높은 비율에 따라 테스트 할 수 있습니다. 사이드 인구 세포의 비율이 특정 세포주에서 너무 낮은 경우, 예를 들어, CD44 고 / ALDH 높은 분류를 직접 수행 할 수있다. 본 연구에 사용 된 마커는 CD133 CD10 고 (34) 또는 (35)로 높은 세포주에 적합한 다른 마커에 의해 연구 대체 될 수있다. 이 프로토콜은 두 개의 셀 sortings에 기초한다. SP + C...

머리와 목 편평​​ 세포 암 (HNSCC)는 전 세계 공통의 악성 종양이며, 현재 치료의 발전에도 불구하고, 고급 질환 환자는 예후가있다. 환자의 전체 5 년 생존율은 수술, 화학 - 방사선 요법 - 및 대상을 포함한 치료 적 접근법의 조합에도 불구하고 약 30 %이다. 최근의 연구는 항암 치료 한 다음 암 줄기 같은 세포의 생존 (암줄 기세포)에 국소 재발과 원격 전이 때문이다. 유방, 뇌, 전립선, 폐, 결장, 췌장, 간, 피부 2- 등 다양한 고형 종양 줄기 세포 특성 (미분화 상태,자가 재생과 분화 능력 및 텔로 머라 제 활성)을 제시 세포의 존재를지지 축적 증거가있다 10. 그러나, 암줄 기세포의 기원은 11, 12 불분명 남아 있습니다. 그들은 정상적인 줄기 세포 3,13 또는 dedifferen의 악성 변환으로 인해 발생할 수있는암줄 기세포와 같은 기능 14, 15를 취득 종양 세포의 tiation. 따라서 암줄 기세포에 관한 독특한 경로를 이해하는 것은 조기 진단과 저항 HNSCC의 치료에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 된 CSC는 종양 세포 16-19의 부피에 비해 종양의 재발을 초래 표준 화학 요법과 방사선 치료를 회피 내성 표현형을 갖고, 20 틈새 저산소에 지역화 된 것이 제안되어왔다. 다양한 요소 그러한 정지 성향 등 CSC 추가의 저항이, 강화 된 DNA 수리, 상향 조절 세포주기 제어 메커니즘 및 자유 라디칼 소거능 (21)을 설명하기 위해 제안되었다. 또한, 여러 가지 종양의 분자 경로 구체적 된 CSC (17)에서 활성화 될 수있다. 또한 대상-치료를위한 암줄 기세포의 지식을 개선하기 위해, 우리는 줄기 세포 관련 마커의 이질성에 때문에, 식별 및 암줄 기세포의 분리를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다암 (22)의 다양한 종류. HNSCC에서, 줄기 등을 종양 시작 세포와 같은 약물 유출 컨베이어 식 (23), CD44 높은, CD24 낮은 CD133 고, C-메트로 + 10, 24을 표현형으로 다른 CSC의 바이오 마커를 (발현하는 세포를 정렬하여 주 환자의 종양에서 고립 된, 25, 또는 ALDH 활성이 높은 26) 또는 CSC 속성이 squamospheres을 형성하는 주요 환자의 종양 양성. 그럼에도 squamospheres의 개수는 따라서 더 특성화 작은 샘플 크기 (27)을 연구주는 두 통로 후 급격히 감소한다. 따라서, 생체 외 분석이 잘 확립 된 세포주로부터 시작하는 CSC 추가의 기술을 개선하기 위해 실험을 설계하기 쉬운 해결책이다. 이 문서의 목적은 multiparametric 유세포 분석 A를 사용 HNSCC 세포주에서 암줄 기세포를 분리하는 방법을 제안하는 것이다차 셀 정렬. ALDH 활동 등 여러 암줄 기세포의 특성과의 상관 관계에서 CD44의 발현은, 사이드 인구 (SP) 표현형, 회전 타원체 형성 능력과 발암는 분리와 암줄 기세포의이 하위 집단의 특성을하는 데 사용됩니다. CD44, 세포 표면 당 단백질은 세포 부착 및 이동에 관여한다. CD44은 매우 머리와 목 암 모델 29-31에 포함 암줄 기세포 (28) 많은 고형 종양으로 표현된다. 또한, CD44 높은 세포는 10 수없는 생체 내에서 CD44 낮은 세포 반면, 이종 종양을 생성 할 수 있습니다. SP는 분석은 CSC 내에 과발현 막 수송 단백질의 ATP 결합 카세트 (ABC)를 통해 가정 훽스트 염료 22를 유출하는 세포의 미분 가능성에 기초한다. 이 분석은 대조 시료에서 베라파밀로 ABC 트랜스 포터 억제제의 사용을 포함한다. 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)는 마지막 ret 레티놀 변환에 관여하는 세포 내 효소초기 줄기 세포 분화 25, 26시 inoic 산. 높은 ALDH 활동 쇼 HNSCC (26)의 줄기와 같은 세포의 행동과 ALDH 높은 세포의 매우 적은 수를 나타내는 세포는 생체 내 26,32에 종양을 생성 할 수 있습니다. 이러한 마커 및 속성의 조합이 성공적으로 베르트랑 전자 t의 알에 의해 사용되었다. 시험관 내에서 광자하려면 다음 암줄 기세포의 생체 내 탄소 이온 방사선 (19)의 저항을 연구. 그들의 결과는 명확하게 다양한 세포 마커 및 속성의 조합이 단일 마커 방법보다 HNSCC 암줄 기세포 집단에 대한 유용한 연구를위한 더 선택적인 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>태아 송아지 혈청 골드</td><td>GE 헬스케어</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손 수용성</td><td>시그마-알드리치</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 너트 믹스 (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>용액은 매우 불안정하기 때문에 사용 직전에 준비해야 합니다</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), 비타민 A 제외</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>부식성, 급성 독성 (경구, 피부, 흡입) 카테고리 4</td></tr><tr><td>베라파밀 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>급성 독성(경구, 진피, 흡입) 범주 3</td></tr><tr><td>Propidium</td><td>Iodide Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>급성 독성(경구, 진피, 흡입) 범주 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stem Cell</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, 인간 항체</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, 인간 항체</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 쿨터 입자</td><td>벡크만 쿨터</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B 세포주</td><td>존 리틀의 선물 s</td> <td>Laboratory-FaDu</td><td></td></tr> <tr><td>세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>저 앵커리지 플레이트</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 소프트웨어 v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

두경부 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 진행에 대한 이해의 진보에도 불구하고, 5 년 생존율 인해 국소 재발 및 원격 전이 낮은 유지된다. 이러한 재발을 설명하기위한 하나의 가설은 고유의 화학 치료 및 전파 저항을 제시 암 줄기 유사 세포 (CSC 추가)의 존재이다. 새로운 치료 전략을 개발하기 위하여, 표적 치료의 효과를 검증 실험 모델을 가지고 있으므로 된 CSC의 동정 및 분리를위한 신뢰성있는 방법이 필요하다. 이를 위해 정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 수행되는 연속 된 두 셀 sortings (FACS)의 조합에 의존 HNSCC 인간 세포주에서 CSC 추가의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 첫 번째는 다른 사람의 사이에서 제외 따라서 카세트 (ABC) 트랜스 포터 단백질을 ATP가-바인딩 및 과발현하는 암줄 기세포의 특성을 기반으로, 같은 헥스 33342. 세포 같은 중요한 DNA 염료 번째로 정렬방법은 &quot;측면 인구&quot;(SP)로 식별됩니다. SP에 세포가 낮은 비율 부​​모 세포 (&lt;5 %)을 나타내는 바와 같이, 성장 단계는 제 2 셀 정렬 전에 수를 증가시키기 위해 필요하다. 다음 단계는 두 HNSCC 줄기 세포 특성은 세포 표면 마커 CD44 (고 CD44) 및 알데히드 탈수소 효소의 과발현 (ALDH 높음)의 높은 발현 수준을, 즉 보유 세포의 선택을 허용한다. 단일 마커의 사용 된 CSC, SP의 조합의 분리 수많은 제한 및 함정을 갖기 때문에, CD44 및 ALDH 마커는 생존 세포를 필요로 상기 분석 및 기능 분석을위한 된 CSC를 분리하는 유용한 도구를 제공 할 것이다. 암줄 기세포의 줄기 같은 특성은 마지막으로 tumorispheres의 형성과 β-catenin의 발현에 의해 시험 관내에서 확인되었다.

HNSCC 셀 라인에서 암줄 기세포의 분리 때문에 부모 세포주에서 암줄 기세포의 매우 낮은 비율의 두 개의 연속 정렬이 필요합니다. 첫 번째 분류는 약물 유출 수송에 의한 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외 할 암줄 기세포의 능력에 근거했다. 이 분류 전체 세포 인구 (그림 1) 1-5 %를 인수 결과. 의 Hoechst 염색 부정적인 셀 정렬하는 동안, SSC-A 도트 플롯 (그림 1A) 대 FSC-A를보고 크기와 정렬 세포의 과립을 확인합니다. 그리고, 인구 P1 (도 1b)를 SSC-H 도트 플롯 대 SSC-W를 사용하여 선택하여 이중선 및 세포 파편을 식별. 이 P1 인구에서 훽스트 블루 도트 플롯 대 헥스 레드-A를 만듭니다. &quot;훽스트 (Hoechst)&quot;라는 레이블이 붙은 튜브로, SP는 주요 세포 인구 (그림 1C)에서...

종양 재발과 치료에 대한 내성에서 암 줄기 세포의 역할을 이해하는 것은 지난 10년 동안 큰 관심사가 되었습니다. 이 논문은 두경부 편평 암종 세포주(HNSCC)에서 암 줄기 유사 세포의 하위 집단의 분리 및 특성화에 대해 설명합니다.

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 두경부 편평세포암(head and neck squamous cell carcinoma) 또는 HNSCC 세포주로부터 암 줄기세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 종양의 방사선 저항성을 극복하기 위해 화학요법을 어떻게 활용할 것인가에 대한 암 치료 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마커의 조합을 사용하여 HNSCC 세포주 유래 암 줄기세포에 대해 높은 특이성을 확보한다는 점입니다.시연 절차는 기술자인 Prescillia Battiston-Montagne과 저희 연구실의 박사인 Marion Gilormini가 진행하겠습니다. Hoechst 염료 유출 분석법으로 암 줄기세포 유사 세포의 사이드 팝업(side population)을 선택하려면, 먼저 원추형 튜브 하나에는 Hoechst라고 표시하고, 다른 하나에는 Hoechst and Verapamil이라고 표시하십시오. 그다음, HNSCC 세포 배양물을 멸균된 PBS로 세척한 후 1 mL의 Tripsyn EDTA를 첨가하십시오.37°C에서 3분 후, 신선한 세포 배양 배지를 사용하여 반응을 중단시키고 세포 수를 측정합니다. 배양액을 mL당 1×10⁷ cells로 희석하고 모세포주 배지를 채웁니다. 그 다음 Hoechst 및 Verapamil 튜브에 100 µL를 추가하고, Hoechst 튜브에 세포 4 mL를 추가합니다.다음으로, 10 µL의 5 mM Verapamil hydrochloride 용액을 Hoechst 및 Verapamil 샘플에 조심스럽게 혼합한 후, 두 튜브 모두에 세포 1 × 10⁶개당 5 µL의 Hoechst를 첨가합니다. 그 후 샘플을 알루미늄 호일로 감싸 37 °C에 둡니다. 15분마다 가볍게 섞어주며 90분 동안 반응시킨 후, 튜브를 원심분리하고 펠릿을 2 mL의 PBS에 재현탁합니다.원심 분리 후, Hoechst 및 Verapamil 펠릿은 PBS에 희석된 500 µL의 propidium iodide에 재현탁하고, Hoechst 펠릿은 동일한 용액 4 mL에 재현탁합니다. 이제 응집물을 제거하기 위해 샘플을 70 µm 셀 스트레이너로 걸러 FACS 튜브에 옮긴 후, 빛이 차단된 얼음 위에 보관합니다. 다음으로, Hoechst 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 유세포 분석기 소프트웨어의 Global Worksheet 창을 엽니다.Dot Plot을 클릭하여 Global Worksheet에 그래프를 생성하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터를 선택하십시오. 동일한 방식으로 측방 산란 폭(side scatter wide)과 측방 산란 높이(side scatter height)의 도트 플롯을 생성한 다음, 폴리곤 게이트(polygon gate)를 클릭하여 두 번째 그래프에 P1 영역을 설정함으로써 단일 세포를 선택하고 더블릿(doublets)을 구분하십시오. 다음으로, 적색 Hoechst 영역과 청색 Hoechst 영역의 도트 플롯을 생성하고 세포 위에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 P1 집단을 강조 표시하십시오.그 다음, 주요 세포군 왼쪽에 사이드 암(side arm) 형태로 나타나는 Hoechst 염색 음성 사이드 팝퓰레이션(side population) 세포를 선택하기 위해 P2 영역을 생성하고, Hoechst 샘플 이벤트 10,000개를 수집합니다. 사이드 팝퓰레이션을 나타내는 P2 게이트가 정확하게 설정되었는지 확인하기 위해, Hoechst 및 Verapamil 샘플 이벤트 또한 10,000개씩 수집합니다. 이때 사이드 팝퓰레이션이 사라져야 합니다.그런 다음 Hoechst 염료 음성 세포의 side population을 1 mL의 완전 암줄기세포 유사 세포 배지가 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브로 분리하십시오. 분리가 끝나면 세포를 원심 분리하고, side population 펠릿을 1 mL의 신선한 완전 암줄기세포 유사 세포 배지에 재현탁하십시오. 이어서 세포 수를 측정하고 적절한 수의 세포를 새로운 세포 배양 플라스크에 접종하십시오.분리된 side population 세포에서 CD44-high/ALDH-high 하위 집합을 선택하려면, 먼저 7개의 멸균된 15-milliliter 원추형 튜브에 표시된 대로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 분리된 세포를 줄기세포 배지에서 1×10⁷ cells/mL로 희석한 후, 모든 과정을 얼음 위에서 진행하며 unstained CD44-APC 및 IGG1-APC 튜브에는 100 µL의 세포를, ALDH 및 CD44-APC 튜브에는 4 mL의 세포를 각각 분취합니다. 세포를 원심 분리한 후, unstained CD44-APC 및 IGG1-APC 펠릿을 ALDEFLUOR 키트의 100 µL buffer one에 재현탁합니다.그 다음, ALDH, ALDH 및 DEAB, 그리고 ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브에 ALDH 억제제인 DEAB 5 µL를 각각 첨가합니다. ALDH 및 CD44-APC 튜브의 세포를 buffer one 4 mL와 키트 시약 20 µL가 포함된 시약 C 4 mL에 재부유시키고, 이 세포들 중 100 µL를 즉시 ALDH, ALDH 및 DEAB, 그리고 ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브로 옮깁니다. 이후 모든 튜브를 37 °C 항온 수조에 넣고 빛을 차단한 상태로 30분 동안 배양하며, 15분이 지난 후 부드럽게 볼텍싱하여 샘플을 혼합합니다.배양 종료 후, 모든 샘플을 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 그다음 모든 튜브를 얼음에 두고, ALDH 및 CD44-APC 펠렛은 4 mL의 buffer A에 재현탁하며, CD44-APC 및 ALDH DEAB 그리고 CD44-APC 펠렛은 동일한 버퍼 100 µL에 재현탁합니다. IGG1-APC 펠렛은 100 µL의 buffer B에, 염색하지 않은 ALDH 및 ALDH와 DEAB 튜브는 100 µL의 buffer one에 재현탁합니다.10분 후, 모든 샘플을 다시 원심 분리한 다음, ALDH 및 CD44-APC 샘플을 제외한 모든 샘플을 1 mL의 buffer one으로 세척하고, ALDH 및 CD44-APC 샘플은 4 mL의 buffer one으로 세척합니다. 두 번째 원심 분리 후, ALDH 및 CD44-APC 샘플을 제외한 모든 펠릿을 1 mL의 신선한 buffer one에 재부유시키고, ALDH 및 CD44-APC 샘플은 4 mL의 buffer one에 재부유시킵니다. 이제 ALDH 및 CD44-APC 튜브를 유세포 분석기에 로드하고, 이중 염색된 집단을 시각화하기 위해 APC by fitsy dot plot을 생성합니다.다음으로, ALDH-high 세포를 위한 게이트를 생성하기 위해 ALDH 튜브를 로드합니다. ALDH와 DEAB 튜브를 로드했을 때 양성 세포들이 사라져야 합니다. 동일한 그래프에서 CD44-APC 및 IGG1-APC 튜브를 사용하여 CD44-high 세포를 선택하기 위한 두 번째 게이트를 생성합니다.IGG1-APC 튜브를 로드하면 양성 세포들이 사라질 것입니다. 그런 다음 ALDH 및 CD44-APC 튜브와 ALDH DEAB 및 CD44-APC 튜브를 로드하여 CD44-high/ALDH-high 세포를 포함하는 세 번째 게이트를 생성하십시오. ALDH-CD44 이중 염색 튜브를 사용하여 이중 양성 세포에 마지막 게이트를 설정하십시오.그 다음 CD44-high/ALDH-high 세포를 1 mL의 완전 암 줄기세포 유사 세포 배지가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브에 분리하여 수집하고, 필요에 따라 CD44-low/ALDH-low 세포를 1 mL의 완전 세포 배양 배지에 수집합니다. 2차 분리 후, CD44-high/ALDH-high 세포를 완전 암 줄기세포 유사 세포 배지가 포함된 적절한 세포 배양 플라스크에 분주하여 세포 배양 인큐베이터에서 18~24시간 동안 배양합니다. 세포가 플라스크 바닥에 부착되면 배양 배지를 교체하고 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣습니다.CD44-high/ALDH-high 세포의 종양 형성 능력을 확인하기 위해, 시연된 바와 같이 암줄기세포 유사 단층 배양 세포를 트립신 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻고, 1×10⁶ 개의 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 원심 분리한 후, recombinant human epidermal growth factor heparin 및 B27이 첨가된 저혈청 배지에서 펠릿을 재현탁하고, 광학 현미경으로 종양 구체(tumor spheres)가 관찰될 때까지 세포 배양 인큐베이터 내의 저부착 페트리 접시에서 세포를 배양합니다. 새로운 세포주에 대해 처음으로 분리 작업을 수행하는 경우, in vitro 무혈청 배지에서 종양 구체를 형성하는 능력을 통해 해당 세포주의 종양 형성 능력을 확인해야 합니다.또한, QPCR을 통해 CD44-high/ALDH-high 세포에서 beta-catenin 및 기타 줄기세포 유사 마커의 높은 발현이 나타나야 합니다. CD44-high/ALDH-high 세포는 CD44-low/ALDH-low 세포와 비교했을 때 적은 양을 주입해도 체내에서 종양을 형성할 수 있어야 합니다. 숙련된 경우, 각 세포 분류 작업이 적절하게 수행된다면 5시간 이내에 완료될 수 있습니다.이 절차를 수행할 때 형광색소로 표지된 시료가 직사광선에 노출되지 않도록 보호하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 전이 과정에서 암 줄기세포의 관여에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 침습 이동 분석(invasion migration assays)과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 암 분야의 연구자들이 HNSCC 암에서 종양 탈출 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 다변수 유량 세포 분석 및 세포 분류법을 사용하여 HNSCC 세포주에서 암 줄기세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 종양 세포 및 DNA 삽입 제제를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 실험복과 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

이 비디오에서는 형광 활성화 세포 분류기(FAC)를 사용하여 두경부 편평 암종 세포주에서 암 줄기 유사 세포의 하위 집단을 분리하는 방법을 설명합니다. 세포의 분리된 측면 집단은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

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