글리 칸 노드 분석 : 글리코 믹스에 대한 상향식 접근

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 샘플의 모든 글라이칸을 분해하는 동시에 단당류 조성 및 연결 정보를 보존하는 것입니다. Sick cyalalation과 같은 흥미로운 글라이칸 특징의 증류를 촉진하고 N-Acetylglucosamine을 단일 분석 신호로 이등분합니다. 이 방법은 특정 질병 상태에서 고유한 글라이칸 특징이 변경되는 것과 같은 글리코마이트 분야의 주요 질문에 직접 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 베타 1-6 분지 및 corfulcosulation과 같이 질병에서 변경되는 경향이 있는 글라이칸 특징이 여러 개의 온전한 글라이칸에 퍼지지 않고 단일 분석 신호로 증류된다는 것입니다. 일반적으로 개인은 이 방법을 수행해야 합니다.갓 과메틸화된 글라이칸의 부적절한 처리로 인해 N-아세틸시스테인의 불량한 수율로 어려움을 겪습니다. 먼저 각 생물학적 분석물 9마이크로리터를 별도의 1.5ml 시험관에 옮겨 샘플을 준비합니다.

각 샘플에 1마이크로리터의 탈이온수와 270마이크로리터의 고순도 DMSO를 추가합니다. 그리고 그것들을 소용돌이쳐서 격렬하게 섞으십시오. 샘플 준비 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수산화나트륨이 로드된 스핀 컬럼을 조립합니다.

분석 주사기를 사용하여 각 분석물에 105마이크로리터의 요오도메탄을 추가하고 즉시 튜브를 캡핑합니다. 샘플을 철저히 와류로 만듭니다. 이전에 준비한 스핀 컬럼의 플러그를 뽑고 2, 400 Gs.After에서 15 초 동안 원심분리하십시오.저장소 튜브와 풍요로운 것을 버리고 컬럼을 다시 연결하고 각 분석물에 대해 라벨을 붙인 새로운 튜브 세트 내부에 놓습니다.

1000마이크로리터 파이프 헤드를 사용하여 각 분석물 용액을 해당 스핀 컬럼으로 이동합니다. 분석물 용액이 추가되면 200마이크로리터 파이프 헤드 팁의 끝에서 약 2밀리리터를 압착하고 팁을 컬럼에 그대로 두어 교반기로 사용합니다. 파이프 헤드 팁을 사용하여 2-3분에 한 번씩 컬럼을 부드럽게 저어줍니다.

11 분 후에, 란의 플러그를 뽑고 2, 400 Gs.Immediately에 15 초 동안 그(것)들을 원심 분리해, 회전급강하 란을 제거하고 새로운 저장통 관에서 두어, 교류를 통해서 해결책을 저장하고 그러나 마개를 버리. 란에, 아세톤니트릴의 300 마이크로 리터를 추가하고 9, 600 Gs.Now에 30 초 옮깁니다 나트륨 인산염 완충기의 3.5 밀리리터를 포함하는 silanized 유리제 시험관으로 첫번째 permethylated 흐름을 통해서 해결책을 그(것)들을 원심분리하십시오. 전송된 supernaned가 명확하고 고체 물질이 전송되지 않았는지 확인하십시오.

플라스틱 튜브 바닥에 작은 흰색 펠릿이 형성되었을 것입니다. 명백한 고체 물질을 옮기지 마십시오. 그렇게 하지 않으면 N-아세틸시스테인-글루코사민 글리칸 노트의 수율이 떨어집니다.

모든 샘플이 이송된 후 배치의 모든 샘플을 즉시 와류로 회전시킵니다. 그런 다음 아세톤니트릴 관통 용액을 각 시험관의 나머지 액체와 결합합니다. 다시 말하지만, 이 단계에서 단단한 흰색 잔여물이 옮겨지지 않도록 하십시오.

다음 샘플로 이동하기 직전에 결합된 용액을 캡, 쉐이크 및 볼텍스합니다. 과메틸화 후 흄 후드 내부의 각 시험관에 1.2ml의 클로로포름을 추가합니다. 그런 다음 튜브의 뚜껑을 닫고 내용물을 세게 섞습니다.

층을 분리하기 위하여는, 3, 000 Gs.Use에 해결책을 짧게 분리기는 층의 대략 3 밀리리터를 남겨두고 최고 수성 층의 대부분을 추출하고 버리기 위하여 목초지 관 머리를 사용합니다. 3.5ml의 0.2몰 인산나트륨 완충액을 첨가한 다음 시험관을 캡, 혼합 및 원심분리합니다. 이 액체/액체 추출 단계를 총 3회 실행합니다.

최종 추출에서 약 1 밀리리터의 수성 층을 남깁니다. 이제 깨끗한 실란화 목초지 파이프 헤드를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 클로로포름 층을 깨끗하고 라벨링된 실란화 유리 시험관으로 조심스럽게 옮깁니다. 섭씨 75도로 설정된 예열된 증발 매니폴드에서 부드러운 질소 가스 흐름으로 샘플을 건조시킵니다.

가스 흐름이 액체 표면을 방해하되 튀지 않는지 확인하십시오. 샘플이 건조되면 가수분해할 준비가 된 것입니다. 각 샘플에 325마이크로리터의 2몰 트리플루오로 아세트산 또는 TFA를 추가하고 잘 섞습니다.

후속 가열 단계에서 TFA 증발 및 샘플 손실을 방지하기 위해 모든 샘플에 추가한 직후 각 샘플 튜브를 단단히 캡핑합니다. 섭씨 121도에서 2시간 동안 샘플을 배양하여 글라이칸을 가수분해합니다. 샘플이 배양되는 동안 다시 섭씨 75도에서 증발 매니폴드를 준비합니다.

배양 후 증발 매니폴드에서 일정한 질소 흐름으로 샘플을 건조시킵니다. 샘플을 자주 검사하여 가능한 최소한의 건조 시간을 사용하여 건조되었는지 확인하십시오. 각 샘플에 475 마이크로 리터의 10 그램 수소화붕 소나트륨을 첨가하십시오.

그런 다음 샘플을 철저히 혼합하여 잔류 물을 용해하십시오. 시험관의 뚜껑을 닫고 환원 반응이 1시간 동안 계속되도록 합니다. 다음으로, 각 샘플에 63마이크로리터의 메탄올을 추가합니다.

샘플을 혼합한 다음 질소 아래에서 섭씨 75도에서 건조시킵니다. 각 샘플에 125마이크로리터의 메탄올을 아세트산 용액에 추가합니다. 샘플을 혼합한 다음 질소 아래에서 섭씨 75도에서 다시 건조시킵니다.

샘플이 완전히 건조되었는지 확인하려면 진공 상태에서 20분 동안 두십시오. 건조 후 각 샘플에 18마이크로리터의 탈이온수를 추가합니다. 그런 다음 샘플을 짧게 원심 분리하고 침전물을 용해시키기 위해 잘 혼합합니다.

다음으로, 각 튜브에 250마이크로리터의 무수아세트산을 추가합니다. 튜브에 뚜껑을 씌우고 완전히 와류를 일으킨 다음 잔류물이 완전히 용해되도록 수조에서 2분 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 그런 다음 섭씨 50도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.

이제 각 샘플에 230마이크로리터의 농축 TFA를 추가합니다. 샘플을 캡핑하고 혼합한 후 내부 온도를 섭씨 50도로 10분 동안 배양합니다. 각 샘플에 1.8ml의 디클로로메탄을 넣고 잘 섞습니다.

다음으로, 튜브에 2ml의 이온수를 넣고 액체/액체 추출을 두 번 수행합니다. 실란화된 목초지 파이프 헤드로 디클로로메탄 층을 복구합니다. 자동 샘플러 바이알로 옮긴 다음 샘플을 섭씨 74도의 질소로 건조시킵니다.

GC-MS에 앞서 각 샘플을 120마이크로리터의 아세톤으로 재구성하고 뚜껑을 씌우고 철저히 혼합합니다. 분할 모드에서는 자동 시료 주입기를 사용하여 각 시료를 1마이크로 리터씩 GC 분할 모드 라이너에 주입합니다. ToF(Time of Flight) 질량 분석기의 경우 분당 0.8밀리리터의 일정 흐름 모드에서 40개의 분할 비율과 헬륨 가스를 사용하는 것이 좋습니다.

섭씨 325도에 도달하는 2단계 그래디언트를 사용하여 샘플을 분석합니다. 회피하는 샘플 구성 요소를 전자 이온화에 노출시킵니다. ToF(Time of Flight) 질량 분석기의 경우, 0.1초 펄스 합산 속도로 Z 40 - 800에 걸쳐 M 단편을 분석합니다.

이 프로토콜의 민감성을 입증하기 위해 생물학적 샘플을 신중하게 처리했습니다. 결과 크로마토그램은 비교 및 분석의 용이성을 위해 원하는 산물 피크 사이에 적절한 강도를 제공합니다. 그런 다음 동일한 시작 생물학적 샘플을 동일한 절차로 처리했습니다.

그러나 NAOH 컬럼을 통해 회전된 과메틸화 용액의 백색 잔류물은 액체/액체 추출을 위해 후속 혼합물로 운반되었습니다. 크로마토그램은 동일한 주요 시료 산물의 피크 intensity에 대한 다른 비율을 제공합니다. 직접 비교하면 그 차이는 극명합니다.

두 번째 크로마토그램에서 4-위치 연결된 N-아세틸글루코사민 피크의 명확한 함몰은 실패한 과메틸화 및 추출의 인식 가능한 특성입니다. 질병 상태에서 글라이칸 조성의 차이를 감지하기 위한 이 접근 방식의 유용성을 평가하기 위해 정상 혈장 샘플과 암 환자 혈장 샘플에서 추출된 이온 크로마토그램을 2-linked manos에 대해 정규화하고 오버레이합니다. 베타 1-6 분지화(beta 1-6 branching) 및 sick cyalalation과 같은 고유한 글라이칸 특징의 정량적 차이는 쉽게 드러납니다.

이 동영상을 시청한 후에는 상향식 글리코믹스 글라이칸 노드 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. corfulcosulation, sick cyalalation 및 glycanite를 단일 분석 신호로 이등분하는 것과 같은 흥미로운 글라이칸 특징의 증류를 촉진합니다.