Name: 전체 산 현장에서 하이브리드 방법 Lymnaea의 stagnalis (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 배우세요 Lymnaea stagnalis 배아와 유충의 고효율 탈낭 방법을 통해 전체 마운트 제자리 교잡으로 유전자 발현 패턴을 시각화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 발달생물학 및 진화발생학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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참고 : 다음 단계는 L.의 배아와 애벌레 단계에서 현장 실험의를 수행하기위한 우리의 방법을 간략하게 설명 공정이 단어 &#39;주의&#39;와 모든 적절한 안전 절차에 의해 지시 된 유해 화학 물질의 사용을 포함 stagnalis이. 채용한다. 유해 화학 물질에 대한 대표 MSDS 시트에 대한 링크는 보조 파일 (1)에 제공됩니다. 모든 시약에 대한 조리법은 보조 파일이 제공됩니다. 디 캡슐 레이션 장치의 1 회의 <ol><li> 이를 위해,도 2a에 도시 된 바와 같이 적절한 길이로 P1,000 팁 절단하여 (1 mm의 내경 및 3 mm의 외경)의 실리콘 튜브에 20 ㎖의 일회용 주사기를 연결한다. </li><li> 반전 큰 페트리 접시에 표준 현미경 슬라이드를 테이프. 도에 도시 된 바와 같이, 현미경 슬라이드에 바로 인접 실리콘 튜브 테이프60, 2C 및 2D. </li><li> 현미경 슬라이드에 뽑아 유리 바늘 나머지 부드럽게 바늘의 선단이 배관의 내부 직경을 가로 지르는 방향의 약 20 %가 돌출 될 때까지 상기 실리콘 튜브에 삽입 (도 2C 및 2D 참조). 바늘은 페트리 접시에 위치 테이프를 아래에 있으면. </li><li> 실리콘 튜브의 자유 단은 ​​캡슐화가 자료를 수집 다른 배양 접시에서 휴식을 허용합니다. </li></ol> 2. 시료 채취, 고정 및 캡슐화 참고 : 별도의 표시가없는 한, 모든 단계는 실온에서 수행된다. <ol><li> 조심스럽게 수족관의 벽에서 계란 문자열을 수집합니다. 이를 위해, 기판 떨어져 계란 문자열을 긁어 주걱으로 유연한 플라스틱의 평면 조각을 사용하고, 물에서 부동 달걀 문자열을 물고기 플라스틱 차 여과기를 사용합니다. 단도에서 제공하는 가이드를 사용하여 현미경으로 재 정렬1. </li><li> 종이 타월에 계란 문자열을 놓고 페더급 집게를 사용하여 산란 량을 따라 세로 절개를합니다. 계란 문자열에서 계란 캡슐 롤과 페더급 집게를 사용하여 종이 타월 주위를 밀어 각 캡슐에서 가능한 한 젤리 소재의 정도를 제거합니다. </li><li> 페더급 집게를 사용하여, 수돗물 5 ㎖를 포함하는 페트리 접시에 달걀 캡슐을 전송합니다. 이 접시에 원하는 발달 단계의 탈 젤리 계란 캡슐을 수집하기 위해 계속합니다. 계획 WMISH 실험 후 다음 단계로 진행에 대한 모든 개발 단계에서 충분히 캡슐을 수집합니다. </li><li> 선진 애벌레로 작업 할 때 고정하기 전에 그들을 마취시키다 (5 일 먼저 절단 (dpfc) 이상 게시). 참고 : 이것은 매우 어려운 현장 염색 패턴의 해석을하게 계약에서 근육을 방지 할 수 있습니다. <ol><li> 그들의 capsu 여전히 동안 (애벌레를 휴식이전 고정 30 분 • 6H 2 O의 MgCl 2의 2 %에 v / w 솔루션 레). </li><li> 정착액 솔루션에 자신의 달걀 캡슐에 여전히 여러 애벌레 동안 침지 및 현미경 자신의 반응을 모니터링하여 30 분 후 휴식의 정도를 평가합니다. 완전 이완 된 애벌레가 응답하지 반면 불완전 편안한 유충은 껍질에 철회 할 것입니다. 이 유충이 완화되고 나면 다음 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 계란 캡슐의 10 배 부피를 제공하는 밀봉 튜브로 넓은 구멍 플라스틱 피펫을 사용하여 난자 캡슐을 전송 (예., 정착 캡슐 1 ㎖는 10+ ml의 튜브를 필요). </li><li> 대기음만큼 관으로부터 가능한 한 액과 정착 계란 캡슐의 체적 배이다 정착액 용액의 부피로 교체한다. 조심스럽게 각 발달 단계 (그림 1 참조)에 해당하는 시간 동안 실온에서 정착액에 계란 캡슐을 회전합니다. </li><li> DiscontinUE의 회전과는 캡슐이 침몰하여, 적절한 폐기 용기에 정착액 솔루션을 대기음 할 수 있습니다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 0.1 % 트윈 -20 (PBTw)을 인산염 완충 식염수로 정착액 용액을 1,8- 회전 계란 캡슐 씻는다. PBTw을 대기음 두 번 반복합니다. </li><li> 배아 및 장치를 사용하여 캡슐에서 유충을 제거 튜브를 통해 유리 바늘 아웃에 과거 캡슐 튜브를 연결 한 후 불식. 그림 2 (자세한 내용은 섹션 1 참조) 20 ML의 주사기로 헤어 캡슐을 그립니다 컬렉션 접시. 주 : 일반적으로, 모든 캡슐의 대부분 (&gt; 90 %) 장치를 통해 하나의 패스를 필요로한다. 많은 경우에있어서, 캡슐 막의 손상되지만 배아와 유충 파열 캡슐 안에 남아있다. 단순히 주사기로를 그리기 다시 밝혀하여이 물질을 재 처리. </li><li> 마이크를 사용하여 1.5 ML 튜브에 디 캡슐화 배아와 애벌레를 수집ropipette (0에 대한 P20 - 삼일 오래 유충 및 팁의 끝 이전의 유충에 대한 P200은 차단). 참고 :이 단계에서 할 수있는 프로토콜 (몇 개월까지에 대한) 일시 정지. 이것은 필요한 경우 decapsuled 재료 저장 1.5 ㎖의 튜브 (다음 단계로 진행)에 수집한다. 그렇지 않으면 프로토콜 3 즉시 계속합니다. </li><li> 배아와 애벌레 튜브의 바닥에 가라 뜨는을 대기음 할 수 있습니다. PBTw에서 33 % 에탄올 (EtOH로)로 교체하고 5 앉아 보자 - 10 분. PBTw에서 66 % EtOH로 100 % EtOH로 반복합니다. RT에서 100 % EtOH로 두 번 유충을 씻으십시오. 100 %의 EtOH에서 -20 ° C에서 자료를 저장합니다. </li><li> 10 분 - 준비가 계속되면, 다시 수화물 100 %의 EtOH를 제거하고 PBTw에 66 % EtOH로 교체하여 샘플은 5 앉아 보자. 10 분 - 5 방치, PBTw에 33 % EtOH로 반복합니다. 마지막으로 모든 EtOH를 제거하기 위해 PBTw의 3 배 5 분 세척으로 세척한다. </li></ol> 3. 테-K, TEA 및 포스트 - Fi를xation 참고 : 우리는 빨리 시간이 중요한 솔루션을 교환 메쉬 바닥으로 가장 효율적이고 부드러운 방법을 작은 바구니에 다음 단계를 수행 찾을 수 있습니다. 이들은 집에서 만든 수 있지만, 우리는 Intavis InSituPro -Vsi 액체 처리 로봇 (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc)와 호환되는 바구니 (중간 크기)를 사용합니다. 이러한 바구니 쉽고 빠르게 교환 해결하기 위해, 12 웰 조직 배양 접시 (TCD)의 웰 사이에서 이동 될 수 있거나, 상기 용액은 잘 피펫을 사용하여 흡인 할 수있다. 대안 적으로, 모든 용액 교환 단순히 유충으로부터 상등액을 흡인하여이 바구니없이 수행 될 수있다. 이 경우에 완만 한 선회 운동 상등액은 웰의 에지로부터 제거 될 수 있도록 접시의 중앙에 모든 배아와 유충을 집중한다. 다음은 사용자가 용액 교류 바스켓을 이용하는 것으로 가정. <ol><li> 피펫을 사용하여, PBTw 2 ㎖로 12 웰 TCD에 앉아 바구니에 전송 배아와 애벌레. 참고 :. 추가 된 발달 단계에 따라 할 수있다 배아 및 / 또는 유충의 수는 있지만 엄지 손가락의 일반적인 규칙은 배아 / 애벌레 (즉, 무료로 공간의 25 % 이상을 유지하는 것입니다, 조사되고,하지 ) 바구니를 혼잡하게. </li><li> 적절한 테-K 용액 (도 1 참조) 2 ㎖, 2 ml의 0.2 %의 글리신 각각 다른 웰이 잘 인접를 준비한다. 테-K의 잘 포함하는 적당한 농도로 각각의 바구니를 이동하고 바로 타이밍을 시작합니다. </li><li> 10 분 후 잘 포함 0.2 % 글리신으로 각각의 바구니를 이동하고 5 분 동안 품어. 그런 다음 0.2 % 글리신과 두 번째 우물에 각 바구니를 이동하고 5 분 동안 품어. 3 ㎖ PBTw의 3 배 5 분의 교류와 글리신을 씻으십시오. </li><li> PBTw 솔루션을 제거하고 새로 제조 트리에탄올 아민 (TEA) 졸 한 번 샘플을 치료5 분주의에 대한의 ution은! 선동하지 마십시오. 5 분 동안 새로 제조 TEA 용액 3 ㎖로 교체하십시오. 선동하지 마십시오. 샘플에서 TEA 용액의 대부분을 흡인. 무수 초산 (TEAAA) 용액으로 새로 제조 트리에탄올 아민을 추가하고 5 분.주의 부화! 선동하지 마십시오. </li><li> 선택 사항 - 위의 단계가 배양되는 동안, TEAAA 솔루션의 또 다른 신선한 배치를 준비하고 위의 단계를 반복합니다. 참고 : TEAAA와이 두 번째 치료는 선택 사항이지만 완전히 배경을 생성하는 경향이 프로브 모든 배경을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 우물에서 흡입하여 TEAAA 솔루션을 제거하고 PBTw 3 ㎖로 교체합니다. 선동하지 마십시오. PBTw를 제거하고 PBTw 3.7 % 포름 알데히드의 3 ㎖를 적용합니다. 부드럽게 30 분 배양하는 동안 때때로 소용돌이 친다. </li><li> 우물에서 흡입하여 정착액을 제거하고 PBTw 3 ㎖로 교체합니다. 1.5 ML 튜브로 자료를 전송합니다. 아르 자형하이브리드 버퍼로 PBTw을 eplace 및 RT에서 5 분 동안 품어 -주의. </li><li> RT 핫 블록에 튜브를 배치하고, 원하는 혼성화 온도까지 온도를 설정한다. 참고 : 하이브리드 온도가 특정 프로브이며, 경험적으로 최적화 될 필요가있을 것이다, 그러나 우리는 55 ° C 좋은 온도 처음 재판을받을 수 찾을 수 있습니다. 블록이 혼성화 온도오고, 샘플은 약 15 분 동안 예비 혼성화 할 수 있도록 허용 (즉, 그 이상은 리보 프로브를 제조하는 데 소요되는 시간은 필요하지 않다). 적절한 볼륨 희석 된 리보 프로브의 (일반적으로 100 μl를) 준비합니다. 우리는 초기 범위 100 및 500 ng를 / ㎖의 일반적으로 시험 프로브 농도. 우리는 12에 따라 리보 프로브를 준비합니다. </li><li> 시료의 혼성화 완충액을 제거하고 샘플을 혼성화 완충액에 프로브를 추가한다. 100 μL (또는 적절한 부피 오버레이 혼성화 buffe 위에 상을 형성R)의 미네랄 오일. 주 : 미네랄 오일이 긴 혼성화 단계에서 형성됩니다 광범위한 결로를 방지 할 수 있습니다. 광범위한 축합 크게 혼성화 용액의 화학 프로브의 농도 모두를 변경한다. </li><li> 프로브와 10 분 동안 75 ℃로 샘플을 가열함으로써 표적 RNA를 변성하고 원하는 혼성화 온도로 열을 감소시킨다. (- 48 시간 24) 하이브리드는 12 시간 (O / N) 이상 최소 할 수있게합니다. </li><li> 혼성화 중에는 열 블록으로부터 하나의 튜브를 제거 유상을 방해하지 않고 유충 중단 엄지와 집게 손가락 사이에서 급속으로 회전하고, 가열 블록에 교체한다. 12 시간 정도 -이 한 번 매 6를 반복합니다. </li></ol> 4. 뜨거운 세척 및 면역 적를 참고 : 우리는 다음 단계의 액체 처리 로봇을 사용하지만,이 또한 쉽게 수동으로 수행 할 수 있습니다. 이 경우, 배아와 애벌레 소자민련은. 그들은에서 혼성화 된 1.5 ml의 튜브에 보관 이후의 모든 솔루션 교환은 흡입과 P1,000 피펫으로 추가됩니다. 수동으로 수행하는 경우 다음 단계의 각각은 각각의 용액 1 ㎖를 채용한다. <ol><li> 열 적절한 볼륨 배속, 2 배의 (3 ㎖ 각 샘플에 대한 각) 및 하이브리드 온도 1X 세척 솔루션을. </li><li> 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 4 배 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오. 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 2 배 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오. 하이브리드 온도에서 15 분 각각의 모든 샘플을 1X​​ 세척 버퍼에 세 번 씻으십시오. </li><li> 하이브리드 온도에서 1 배 나트륨 염화 나트륨 시트르산 버퍼 + 0.1 % 트윈 (SSC + 0.1 % 트윈) 한 번 모든 샘플을 씻으십시오. 샘플을 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 승 MAB를 반복 말레 산 버퍼 (MAB)이 1 배 SSC 솔루션을 교체 15 분 동안 1 배 SSC + 0.1 % 트윈에 두 번 모든 샘플을 세척하고 10 분 동안 앉아 보자금연 건강 증진 협회. 블록 솔루션 MAB를 교체하고 1.5 시간 동안 품어. </li><li> (1 : 블록 솔루션 항체의 10,000 희석) 항체 용액의 블록 솔루션을 교환하고 부드러운 교반과 함께 실온에서 12 시간 (O / N) 동안 품어. </li></ol> 5. 컬러 개발 및 장착 <ol><li> 항체 솔루션을 기음 10 분 각각 PBTw으로 15 회 반복한다. 1 배 알칼리성 인산 버퍼 (AP)와 PBTw를 교체하고 10 분 동안 품어. </li><li> 주의 - 상기 배양 단계로 진행하여 상기 AP 염색 액을 제조하는 동안 (보조 파일 2 참조). 잘 TCD로 자료를 전송하고 AP 염색 용액으로 1 배 AP 솔루션을 교체합니다. 시간의 길이는 발색 반응을 기록 할 수있는 장소를 차지하도록 현재 시간을 참고. 배경 잡음비가 최적이 될 때까지 염색 패턴의 발전을 모니터한다. </li><li> 색상 개발을 중지하려면, 해당 WAST에 처분합니다 (1 배 AP 염색 용액을 제거전자 용기), 그리고 PBTw 2 ㎖을 적용하고 현재 시간을 확인합니다. 5 분마다 두 번 더 PBTw와 린스. 1.5 ML 튜브로 자료를 전송하는 데 다음과 헹굼 중 하나를 사용합니다. </li><li> (이것은 또한 O / N을 수행 할 수 있습니다)에 PBTw를 제거하고 PBTw 3.7 % 포름 알데히드 1 ㎖을 적용하고 교반 또는 실온에서 적어도 30 분을 돌립니다. </li><li> PBT의 3 세척 (적절한 폐기물 용기에 폐기물 정착액을 폐기)와 정착을 씻으십시오. 탈 이온수에 50 ° C에서 샘플을 3 회 반복한다. 참고 :이 세척은 삭제 및 시각화 단계에서 표시 될 수 있습니다 염의 침전을 제거한다. </li><li> 벤질 알코올 (BB : 또한 머레이의 맑은로 알려진 BA) 또는 글리세롤 샘플이 벤질 벤조 에이트에 설치할지 여부를 결정합니다. 참고 : 우리는 더 강력한 청소 에이전트 BB를 선호 : BA를 L.로 stagnalis 배아는 다소 불투명하다. 샘플은 BB에 장착 할 수 있습니다 : BA 먼저 에탄올 시리즈를 통해 탈수해야합니다. 샘플은 60 %에 마운트 될글리세롤 바로 장착 될 수있다. </li><li> 피펫을 사용하여 : (BA 또는 60 % 글리세롤 BB) 장착 용액에 샘플을 전송합니다. BB에 설치시 : 참고는 BA이 잘 된 유리에 수행해야합니다 (BB : BA는 폴리 카보네이트 플라스틱을 녹여 것입니다). </li><li> 10 분 후 스페이서로 적층 된 커버 적절한 수의 (샘플 &lt;1 dpfc, 샘플이 된 커버&gt; 1 dpfc 1 커버 슬립)를 사용하여 슬라이드에 그들을 탑재 - 샘플이 5 취소 할 수 있습니다. 참고 : 전체 마운트는 지금 DIC 광학와 복합 현미경을 사용하여 몇 군데 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 방법은 Lymnaea stagnalis의 모든 개발 단계에서 아마도 다양한 발현 수준과 RNA 전 사체를 효율적으로 시각화 할 수 있습니다. 그들의 캡슐에서 배아 및 유충을 제거하려면 우리가 다른 encapsulated-보고 화학, 삼투압 충격 및 물리적 처리의 다양한 평가판을 모델 생물을 개발하고 있습니다. 그러나, 우리의 손에 우리는 여기에서 설명하는 방법은 배아와 유충 손상없이 거친 캡슐 막을 제거 만 높은 처리량 기술이다. 캡슐화 후, 재료 중 하나에 저장 될 수 있고, 또는 테-K의 단계 특정 요법으로 치료 한 후, 리보 프로브 (riboprobe) 혼성화. (일반적으로 프로브 농도와 혼성화 온도에 초점을) 추가 실험 최적화 작업은 각 프로브 / 타겟을 위해 요구 될 수있다. (정착 요법 및 테-K 치료에 더하여) 이들 파라미터는 일반적으로 가장 영향력있는 변수현장 실험에있는의 (고정 된 재료의 품질과 RNA 프로브는 높은 수준의 것을 가...

연체 동물은 과학 분야의 폭 넓은 다양성의 관심을 보유 동물의 그룹입니다. 자신의 형태 학적 다양성 (1)에도 불구하고, 종, 3 상업 의료 4 및 과학 문제 5-8의 넓은 범위와 관련 (종수 (2)의 관점에서 만 절지로 두 번째) 풍요 로움을 주장 할 수있다 상대적으로 적은 연체 동물 종들이있다 잘 갖추어 진 과학 모델과 실험실 환경에서 유지 보수가 용이 모두합니다. 많은 등의 신경 생물학 9, 생태 독성학 (10)과 최근 진화 생물학 11, 12 등의 분야에서 사용되는 하나의 연체 동물은 주로 때문에 광범위하게 배포 및 유지 보수의 극단적 인 용이성, Lymnaea의 stagnalis입니다. 는 &#39;모델&#39;유기체로서의 인기와 L. 사용할 발달 생물 학자 13-19, 분자 도구의 범위와 능력으로 사용의 오랜 역사에도 불구하고 stagnALIS 과학 사회는 훨씬 더 전통적인 동물 모델 (초파리, 마우스, 성게, 선충)의 뒤에 자리 잡고 있습니다. 분자 모델 쉘 형성을 유도 분자 메커니즘에 대한 관심에서 비롯된 우리의 욕망은 Lymnaea을 개발. 이 Lymnaea의 개발 기간 동안 유전자 발현의 효율적이고 일관성있는 민감한 시각화 허용하는 기술의 집합을 수정하는 동기를 부여. 현장 하이브리드의 전체 마운트 (WMISH)는 널리 모델 생물의 다양한 채용되며, 40 년 이상 20 사용되었습니다. 그 다른 guises에서 ISH 공간적 염색체 rRNA의, mRNA의 마이크로 RNA를 특정 유전자좌 국산화 사용될 수있다. 과제 중 하나는 이전 L.하는 WMISH 방법 정련 해결할 필요 stagnalis 부드럽게하고 효율적으로 추출하는 배아와 t에서 다양한 단계의 애벌레의 문제였다그는 그들이 퇴적 된 계란 캡슐. 이는 추출 또는 &#39;캡슐화&#39;는에 적합한 재료를 수집하기 위해 효율적으로 달성 할 필요가있는 동시에 형태 및 세포의 무결성을 유지하면서, 현장 실험에서 주어진. 다른 모델 생물도 캡슐화 개발을 겪는 동안, 우리 손에 그 종에 대해보고 된 방법 중 어느 것도 성공적 L.에 사용되지 않았다 stagnalis. 이 방법의 전반적인 목표는 따라서 다음과 같습니다 L.를 추출 stagnalis 높은 처리량 방식으로 그들의 캡슐에서 배아 및 유충 이미징을위한 만족스러운 WMISHsignals와 배아 및 유충을 준비하려면 WMISH 신호를 최적화 사전 하이브리드 치료를 적용합니다.

<table><tbody><tr><td>페더급 겸자</td><td>Ehlert & 파트너</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>Glasger&auml; tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Hilgenberg</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12 웰 조직 배양 접시</td><td>Carl Roth</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Carl Roth</td><td>P733.1</td><td>주의 - 암을 유발할 수 있습니다. 흡입, 피부 접촉 또는 삼키면 독성이 있음. 독성: 흡입, 피부 접촉 및 삼킬 경우 매우 심각하고 돌이킬 수 없는 영향을 미칠 위험이 있습니다.</td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td>주의 - 눈에 자극을 일으킵니다. 호흡기 및 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 먼지를 흡입하지 마십시오. 눈, 피부 및 의복과의 접촉을 피하십시오. 적절한 환기가 필요한 경우에만 사용</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>주의 - 흡입하면 해로울 수 있습니다. 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다. 피부를 통해 흡수되면 해로울 수 있습니다. 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 삼키면 해로울 수 있습니다.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll type 400</td><td>Carl Roth</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈 K30 (MW 40)</td><td>Carl Roth</td><td>4607.1</td><td>주의 - 흡입하면 해로울 수 있습니다. 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다. 피부를 통해 흡수되면 해로울 수 있습니다. 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 삼키면 해로울 수 있습니다.</td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 소 혈청 알부민</td><td>Carl Roth</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자</td><td>Carl Roth</td><td>5434.2</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>주의 - 부작용으로는 출혈, 국소 자극이 있습니다. 흡입, 섭취/접촉할 경우 알레르기 반응이 나타날 수 있습니다. 눈/피부/호흡기 자극성. 과민증 가능성. 임신 중 사산 위험을 증가시키는 것으로 보고되었습니다</td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Carl Roth</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>탈이온화 포름아미드</td><td>Carl Roth</td><td>P040.1</td><td>주의 - 눈과 피부에 자극적임. 흡입, 피부 접촉 또는 삼키면 해로울 수 있습니다. 태아에게 해를 끼칠 수 있습니다. 흡습성.</td></tr><tr><td>표준 포름아미드</td><td>Carl Roth</td><td>6749.3</td><td>주의 - 눈과 피부에 자극적입니다. 흡입, 피부 접촉 또는 삼키면 해로울 수 있습니다. 태아에게 해를 끼칠 수 있습니다. 흡습성.</td></tr><tr><td>트리에탄올아민</td><td>Carl Roth</td><td>6300.1</td><td>주의 - 증기나 미스트의 흡입을 피하십시오. 눈에 들어가지 않도록 하십시오. 피부에 장기간 또는 반복적으로 접촉하지 마십시오. 취급 후에는 철저히 씻으십시오.</td></tr><tr><td>무수아세트산</td><td>Carl Roth</td><td>4483.1</td><td>주의 - 피부와 눈에 심한 화상을 일으킵니다. 물과 격렬하게 반응함. 삼키면 유해합니다. 눈과 호흡기에 자극적인 증기</td></tr><tr><td>말레산</td><td>Carl Roth</td><td>K304.2</td><td>주의 - 눈 접촉(자극성), 섭취, . 피부 접촉 (자극성), 흡입 (폐 자극성)의 경우 위험합니다. 피부 접촉(투과기)의 경우 약간 위험합니다. 눈과 피부에 부식성이 있습니다.</td></tr><tr><td>벤질 벤조에이</td>트 <td>시그마</td><td>B6630-250ML</td><td>주의 - 흡입하면 해로울 수 있습니다. 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다. 피부를 통해 흡수되면 해로울 수 있습니다. 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 삼키면 유해합니다.</td></tr><tr><td>벤질 알코올</td><td>시그마</td><td>10,800-6</td><td>주의 - 삼키면 유해합니다. 흡입하면 유해합니다. 눈에 심한 자극을 일으킵니다.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>차단 분말</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti DIG Fab 단편 AP 결합</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>4-니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드 디메틸포름아미드&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>주의 - 태아에게 해를 끼칠 수 있습니다. 흡입 및 피부 접촉에 의해 유해함. 눈에 자극적입니다.</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>A155.3</td><td>주의 - 섭취하면 잠재적으로 유해합니다. 피부, 눈, 의복에 묻지 마십시오. 잠재적인 피부 및 눈 자극.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인</td><td>Carl Roth</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td>주의 - 눈과 피부에 자극을 일으킬 수 있습니다. 호흡기 및 소화기관 자극을 유발할 수 있습니다. 이 물질의 독성 학적 특성은 완전히 조사되지 않았습니다.</td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S</td><td>주의 - 흡입하면 유해할 수 있습니다. 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다. 피부를 통해 흡수되면 해로울 수 있습니다. 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 삼키면 해로울 수 있습니다.</td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이</td>트 <td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td>주의 - 삼키면 유해합니다. 피부와 접촉하면 독성이 있습니다. 피부에 자극을 일으킵니다. 눈에 심각한 손상을 일으킵니다. 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>디소듐 인산수소 이수화물 (Na2HPO4&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소칼륨 (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#8226; 2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>주의 - 눈, 피부, 호흡기에 자극을 일으킬 수 있습니다. 이 물질의 독성 학적 특성은 완전히 조사되지 않았습니다.</td></tr><tr><td>미네랄 오일&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-VSI&nbsp;</td><td>인타비스</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

전체 산<em&gt; 현장에서</em복족류 연체 동물 용&gt; 하이브리드 방법<em&gt; lymnaea의 stagnalis</em

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

현장 하이브리드의 전체 마운트 (WMISH는) 관심 (예 : 태아 또는 애벌레 같은)에 &#39;전체 마운트&#39;조직 준비 내의 핵산 분자 (보통의 mRNA)의 공간 해상도, 또는 발달 단계를 위해 할 수있는 기술이다. 따라서 매우 복잡한 후생 동물 게놈의 기능적 특성, 차세대 시퀀스 데이터의 범람에 병목이 더 있다는 반칙에 기여할 수 있기 때문에 WMISH은 매우 강력하다. 많은 시간은 종종 새로운 모델 시스템 WMISH 실험에 고유 한 각종 파라미터를 최적화하는데 필요한 기술의 개념적 단순함에도 불구하고; 조직 유형 및 발달 단계의 세포 및 생화학 적 특성의 미묘한 차이는 하나의 WMISH 방법은 모든 상황에 적합하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 우리는 일관 생성하고 다시 새로운 복족류 모델 Lymnaea의 stagnalis에 대한 WMISH 방법의 세트를 개발했다유전자의 모든 발달 단계에 걸쳐 범위에 대한 명확한 WMISH 신호. 이러한 방법은 개체 발생 창에 알 수없는 연대기 나이의 애벌레의 할당, 자신의 계란 캡슐에서 효율적으로 배아를 제거하고 유충, 각각의 개체 발생 창에 적절한 테-K 치료의 응용 프로그램 및 하이브리드, 이후 하이브리드 및 면역을 포함 단계. 이 방법은 주어진 RNA 전 사체에 대한 결과 신호는 프로브 특정 조정 (주로 농도와 혼성화 온도 프로브)을 추가로 정제 할 수있는 기반을 제공합니다.

도 3에 도시 된 대표적인 WMISH 염색 패턴이 상술 한 기술을 이용하여 생성하고, 쉘의 형성에 이르기까지의 분자 다양한 프로세스에 관여하는 유전자에 대한 공간 발현 패턴의 다양한 반영 하였다 (신규 유전자 1, 2, 3, 4) 개발 단계의 범위에 걸쳐 전사 조절 (Brachyury)으로 세포 - 세포 신호 (DPP)에 관한 것이다. 우리는 그들이 같은 것이라고 기대 이들 유전자의 발현 수준을 정량화하지 않은 반면 우리의 방법은 다양한 단계에서의 개발의 모든 단계에서 발현 유전자 산물의 광범위한 다양성에 대해 적용 할 수 있음을 나타내는 상당히 다양하다. 오직 여기에 제시된 유전자 (DPP) 중 하나는 이전 L. 설명 하였지만 stagnalis 21, 22. 우리가 여기서 제시 결과는 대부분이 이전 보고서와...

이 프로토콜의 목표는 전체 마운트 현장 교잡 및 후속 사전 및 사후 교잡 처리를 준비하기 위해 Lymnaea stagnalis 배아 및 유충의 고처리량 캡슐화 해제를 위한 일련의 방법을 사용자에게 제공하는 것입니다.

전체 산<em&gt; 현장에서</em복족류 연체 동물 용&gt; 하이브리드 방법<em&gt; Lymnaea의 stagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 담수 복족류인 Lymnaea stagnalis의 배아 및 유생 전체 표본에서 개별 유전자의 공간적 발현 패턴을 효율적으로 시각화하는 것입니다. 이 방법은 유전자가 어디에서 언제 발현되는지, 유전자 간에 어떻게 상호작용하는지, 그리고 그들의 잠정적인 기능은 무엇인지와 같은 진화발생생물학(Evo-Devo) 및 발달 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 난낭에서 배아 및 유생 시료를 쉽고 빠르게 효과적으로 제거할 수 있다는 점입니다.그 다음 이 재료를 보충 자료에서 제공하는 발달 로드맵에 따라 분류하고, 단계별 전-하이브리다이제이션(pre-hybridization) 과정을 통해 처리합니다. 이 절차를 시작하려면, 20-milliliter 일회용 주사기를 실리콘 튜브에 연결하십시오. 이어서, 표준 현미경 슬라이드를 커다란 역방향 페트리 접시에 테이프로 고정하십시오.그다음, 실리콘 튜브를 현미경 슬라이드 바로 옆에 테이프로 고정합니다. 그 후, 풀드 글라스 니들(pulled glass needle)을 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 그리고 니들 팁이 튜브 내경의 약 20% 정도 돌출될 때까지 실리콘 튜브 속으로 조심스럽게 삽입합니다.바늘이 제자리에 위치하면 페트리 접시에 테이프로 고정합니다. 실리콘 튜브의 자유단은 탈각된 물질을 수집할 다른 페트리 접시에 놓아둡니다. 수조 벽면에서 알 스트레인을 수집하려면, 평평하고 유연한 플라스틱 조각을 스패출러로 사용하여 기질에서 알 스트레인을 긁어냅니다.플라스틱 차 거름망을 사용하여 물 위에 떠 있는 알 덩어리를 건져냅니다. 그 후, 본 가이드에 따라 현미경 하에서 재료를 배치하고 분류합니다. 알 덩어리를 종이 타월 위에 올리고, 초정밀 핀셋을 사용하여 알 덩어리를 따라 세로로 절개합니다.그런 다음, 알 체에서 알 캡슐을 굴려 꺼내고, 종이 타월 위에서 캡슐을 문질러 젤리 물질을 최대한 제거합니다. 다음으로, 미세 핀셋을 사용하여 알 캡슐을 5 milliliters의 수돗물이 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 원하는 발달 단계의 젤리가 제거된 알 캡슐을 이 접시에 계속해서 수집합니다.다음 단계로 넘어가기 전, 계획된 WMISH 실험에 필요한 모든 발달 단계의 캡슐을 충분히 수집하십시오. 이제 고정 전, 첫 분할 후 5일 이상 된 유충을 2% w/v 염화마그네슘 육수화물 용액에 30분 동안 넣어 이완시킵니다. 30분 후, 몇 마리의 유충을 난낭에 넣은 채로 고정액에 담가 현미경으로 반응을 관찰함으로써 이완 정도를 확인하십시오.불충분하게 이완된 유충은 껍질 속으로 움츠러듭니다. 반면, 완전히 이완된 유충은 반응하지 않습니다. 유충이 충분히 이완되면, 광구 플라스틱 피펫을 사용하여 난낭을 난낭 부피의 10배 정도 되는 밀폐 튜브로 옮깁니다.다음으로, 튜브에서 가능한 한 많은 액체를 흡입하여 제거하고, 가라앉은 난낭 부피의 10배에 해당하는 고정액으로 교체합니다. 각 발달 단계별 적절한 시간 동안 실온에서 난낭을 고정액과 함께 부드럽게 회전시킵니다. 그런 다음, 회전을 중단하고 난낭이 가라앉을 때까지 기다립니다.고정액을 적절한 폐기물 용기에 흡입하여 제거합니다. 고정액을 PBTw로 교체하여 알 캡슐을 세척하고, 실온에서 5분 동안 회전시킵니다.PBTw를 흡입하고 두 번 더 세척합니다. 그 후, 장치를 사용하여 캡슐에서 배아와 유충을 제거합니다. 캡슐을 20-milliliter 주사기로 빨아들입니다.그런 다음 주사기를 튜브에 연결합니다. 튜브와 유리 바늘을 통해 캡슐을 배출하여 수집 접시에 담습니다. 이후 마이크로 파이펫을 사용하여 탈피된 배아와 유충을 1.5-milliliter 튜브에 수집합니다.그 후, 고정된 시료를 탈수하여 보관하거나 Proteinase K, TEA 및 후고정 단계를 수행합니다. 이 단계들이 완료되면 시료를 짧게 전하이브리드화하고 리보프로브(riboprobes)를 첨가합니다. Lymnaea stagnalis의 in situ 실험 최종 결과에 있어 적절한 Pro K 처리의 중요성은 매우 지대합니다.이는 0에서 500 µg/ml까지, 서로 다른 발달 단계에 따라 필요로 하는 Pro K 농도 범위가 넓다는 점에 반영되어 있습니다. 하이브리드화 과정 중, 히트 블록에서 튜브 하나를 꺼냅니다. 오일 층을 흐트러뜨리지 않고 유충을 부유시키기 위해 엄지와 검지 사이에서 빠르게 회전시킨 후, 다시 히트 블록에 넣습니다.이 절차를 6~12시간마다 한 번씩 반복하십시오. 여기에 제시된 유전자 발현 패턴은 다양한 발달 단계의 유충을 사용하여 생성되었습니다. 모든 시료는 Murray's Clear로 마운트하여 이미징하였습니다.각 이미지의 우측 상단에 대략적인 연령이 표시되어 있습니다. 시야의 방향은 우측 하단에, 유전자 상동성은 좌측 하단에 표시되어 있습니다. 이러한 결과는 껍질 형성부터 전사, 세포 간 신호 전달에 이르기까지 다양한 분자 과정에 관여하는 유전자들의 발현 패턴을 보여줍니다.모든 경우에 독특하고 명확한 세포 염색 패턴이 관찰되며, 결과는 한 실험 내의 개별 유충 간에 매우 일관적이고 실험 간 재현성 또한 매우 높습니다. 숙달되면 이 기법의 총 실제 작업 시간은 2일 미만이 소요됩니다. 대부분의 시간은 하이브리다이제이션을 위한 배아 및 유충 시료의 수집과 준비, 그리고 결과 이미지 촬영에 소요됩니다.이 절차를 수행할 때는 하이브리다이제이션 온도, 프로브 농도 및 하이브리다이제이션 시간과 같은 중요한 파라미터에 대해 모든 리보프로브마다 미세한 조정이 필요할 가능성이 높다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발 이후, 우리는 이전의 전사체 및 단백질체 스크리닝을 통해 확인된 껍질 형성에 관여하는 일련의 유전자들을 상당히 정확하게 특성화할 수 있었습니다.

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