2016년 6월 18일
사회적 아메바 Dictyostelium discoideum은 굶주리면 다세포 유기체로 발달 전이를 겪습니다. 진화적으로 보존된 단백질 코로나닌 A는 발달 시작에 중요한 역할을 합니다. 응집 분석법을 주요 방법으로 사용하여 초기 개발에서 코로나 A의 역할을 밝히는 것을 목표로 합니다.
이 실험 절차의 전반적인 목표는 Dictyostelium discoideum의 Coronin-A 의존성 조기 기아 반응을 조사하는 것입니다. 이 방법은 Dictyostelium discoideum의 초기 발달과 관련된 신호 경로 및 요인의 식별과 같은 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 초기 발달 신호전달에 관여하는 발달 유도 요인 및 단백질에 대한 자동화된 고처리량 스크리닝을 위한 도구를 제공할 수 있는 잠재력이 있다는 것입니다.
일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 세포 밀도, 순응 시간 및 개발 시간과 같은 분석에 내재된 여러 변수로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 160rpm의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 22도의 HL-5 배지가 포함된 삼각 플라스크에서 DH1.10 세포 또는 corA 결핍 세포를 성장시킵니다. 세포를 1 곱하기 10에서 4 사이, 두 곱하기 10에서 6 밀리리터 사이의 밀도로 유지하십시오.
세포 응집을 검사하기 위해 DH1.10 배경에서 생성된 10-50ml의 로그 상 성장 DH1.10 세포 또는 corA 결핍 세포를 수확합니다. 400g에서 3분 동안 원심분리한다. 그런 다음 세포가 BSS에 두 번 있었습니다.
그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 그런 다음 24웰 플레이트에 세포를 플레이트합니다. BSS에서 섭씨 22도에서 1시간 동안 부착하도록 합니다.
그런 다음 타임 랩스 현미경으로 세포 응집을 시각화하고 135초마다 이미지를 촬영합니다. DH1.10 세포 또는 DH1.10 corA 결핍 세포의 발달에 대한 외부에 적용된 순환 AMP 펄스의 영향을 조사하기 위해 10-50ml의 세포를 수확하고 400 배 g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 BSS에서 두 번 씻으십시오.
혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 그 후, BSS에서 밀리리터당 7개의 세포에 대해 10의 1배의 밀도로 세포를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 펄스를 적용하기 전에 섭씨 22도에서 160rpm으로 2시간 동안 배양물을 흔듭니다.
다음으로, 타이머로 제어되는 연동 펌프를 사용하여 순환 AMP 펄스를 적용합니다. 5시간 동안 6분 30초마다 5초 동안 주기적 AMP의 5초 펄스를 전달하도록 펌프를 프로그래밍합니다. 중요한 단계는 순환 AMP 주입의 팁이 용액에 지속적으로 잠기지 않고 셰이커에 의해 생성된 파동에 주기적으로 잠기도록 하는 것입니다.
순환 AMP 적용 후 혈구계를 사용하여 세포를 다시 계수합니다. 그런 다음 24웰 플레이트에 세포를 플레이트하고 BSS에서 1시간 동안 접착시킵니다. 16시간 후, 섭씨 22도에서 5x 주관식을 사용하여 명시야 현미경으로 세포 응집을 시각화합니다.
이 절차에서는 섭씨 22도에서 HL5 배지를 사용한 진탕 배양에서 로그 위상 DH1.10 세포 또는 DH1.10 corA 결핍 세포를 수집하여 새로운 컨디셔닝 배지를 준비합니다. 400 회 g에서 3 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 그런 다음 PBM에서 세 번 씻으십시오.
그 후, 혈구계를 사용하여 세포를 계수한 다음 10의 1 곱하기 10의 밀도로 PBM에서 밀리리터당 7개의 세포로 다시 현탁시키고 110rpm에서 섭씨 22도에서 20시간 동안 흔듭니다. 다음으로, 400 배 g에서 3분 동안 세포를 원심분리한 다음 컨디셔닝된 배지를 수집합니다. 그 후, 8, 000 회 g에서 원심 분리로 배지를 4 °C에서 15 분 동안
정화합니다.그런 다음 0.45마이크로미터 필터를 통해 조절된 매체를 여과하고 PBM으로 3배 희석합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세고 24웰 플레이트에 플레이트를 만들고 섭씨 22도에서 1시간 동안 접착시킵니다. 다음으로, 세포의 상등액을 미리 제조된 컨디셔닝된 배지와 교환합니다.
16시간 후, Five x 주관식을 사용하여 명시야 현미경으로 세포 응집을 시각화합니다. 여기서, Coronin-A가 결핍된 세포는 초기 발달에 결함을 보이며, Dictyostelium discoideum의 발달 주기 중 초기 단계인 다세포 응집체를 형성할 수 없었습니다. 이 그림에서, 식물성 야생형 세포와 corA가 결핍된 세포를 2시간 동안 세척하고 굶긴 후 15마리의 동물 또는 고리형 AMP를 사용하거나 사용하지 않고 5시간 동안 6분 30초마다 현탁 상태로 펄스링했습니다.
외인성 순환 AMP 펄스의 적용으로 Wild 유형 표현형이 완전히 복원되었습니다. 이 그림에서, 기하급수적으로 성장하는 Wild 유형 및 corA가 결핍된 세포를 PBM에서 세척하고, 다중 웰 플레이트에 파종하고, Wild 유형 또는 corA가 결핍된 굶주린 세포에서 얻은 컨디셔닝 배지에서 배양했습니다. 이미지는 세포를 파종한 후 16시간 후에 촬영되었습니다.
corA가 결핍된 딕티오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum)은 발달 유도에 필요한 모든 인자를 생산할 수 있었지만 이에 대응할 수 없었다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 배양 시간을 포함하여 20시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 다른 균주의 경우 세포 밀도, 접착 시간, 개발 시간과 같은 분석의 여러 변수를 조정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 Dictyostelium discoideum의 조기 기아 반응과 관련된 요인을 식별하기 위해 생화학적 분별 및 후속 단백질체 분석을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 컨디셔닝 미디어와 순환 AMP 펄스를 사용하여 수중 조건에서 Dictyostelium discoideum의 조기 발달을 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 연구는 사회성 아메바인 Dictyostelium discoideum의 초기 기아 반응에서 coronin A의 역할을 조사합니다. 이 연구는 기아 상태에서 유기체의 다세포화 전환에 관여하는 신호 전달 경로를 규명하는 것을 목표로 합니다.
Early-stage aggregation assays in Dictyostelium discoideum enable mechanistic de-risking of protein function upstream of key signaling cascades. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating the role of coronin A in multicellular development initiation. The method provides a robust platform for functional interrogation of signaling components relevant to developmental and cell signaling research portfolios.
This aggregation assay positions upstream of cAMP signaling, bridging early discovery biology with downstream screening and analytics in the developmental signaling workflow.