의 조기 기아 응답에 Coronin (A)의 기능 조사

본 실험 절차의 전반적인 목표는 Dictyostelium discoideum의 Coronin-A 의존적 초기 기아 반응을 조사하는 것입니다. 이 방법은 Dictyostelium discoideum의 초기 발달에 관여하는 신호 전달 경로 및 인자의 식별과 같이 발생생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 발달 유도 인자 및 초기 발달 신호 전달에 관여하는 단백질의 자동화 및 고속 대량 스크리닝을 위한 도구를 제공할 가능성이 있다는 점입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 세포 밀도, 부착 시간, 발색 시간 등 분석법 자체에 내재된 여러 변수로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 HL-5 배지가 담긴 삼각 플라스크에서 DH1.10 세포 또는 corA 결핍 세포를 22 °C, 160 rpm의 진탕 배양기에서 배양하십시오. 세포 밀도는 1×10⁴에서 2×10⁶ cells/mL 사이로 유지하십시오.

세포 응집을 조사하기 위해, 대수 성장기(log-phase)의 DH1.10 세포 또는 DH1.10 배경에서 생성된 corA 결핍 세포를 10~50밀리리터 수확하십시오. 이를 400 x g에서 3분간 원심분리하십시오. 그다음 BSS로 세포를 두 번 세척하십시오.

그 후 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 이어서, 세포를 24 웰 플레이트에 분주합니다. BSS 내에서 22 °C의 온도로 1시간 동안 세포가 부착되도록 둡니다.

그런 다음, 타임랩스 현미경으로 세포 응집을 시각화하고 135초마다 이미지를 촬영합니다. 외부에서 가해준 cyclic AMP 펄스가 DH1.10 세포 또는 DH1.10 corA-결핍 세포의 발달에 미치는 영향을 조사하려면, 10에서 50 mL의 세포를 수확하여 400 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 그 후, BSS로 두 번 세척합니다.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 그 후, BSS에서 세포 밀도가 1×10⁷ cells/mL가 되도록 세포를 재현탁합니다. 그런 다음, 펄스를 가하기 전 22 °C에서 160 rpm으로 2시간 동안 배양액을 흔들어 줍니다.

다음으로, 타이머로 제어되는 연동 펌프를 사용하여 cyclic AMP 펄스를 가합니다. 5시간 동안 6분 30초마다 5초 동안 cyclic AMP 펄스가 전달되도록 펌프를 프로그래밍합니다. 중요한 단계는 cyclic AMP 주입 팁이 용액에 계속 잠겨 있지 않고, 셰이커에 의해 생성된 파동에 따라 주기적으로만 잠기도록 하는 것입니다.

cyclic AMP 처리 후, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 다시 측정합니다. 그 다음, 세포를 24웰 플레이트에 분주하고 BSS 내에서 1시간 동안 부착시킵니다. 16시간 후, 22 °C에서 5배 대물렌즈를 이용한 명시야 현미경으로 세포 응집을 관찰합니다.

본 절차에서는 22 °C에서 HL5 배지를 사용하여 진탕 배양한 대수 성장기 DH1.10 세포 또는 DH1.10 corA 결핍 세포를 수집하여 신선한 조건화 배지를 준비합니다. 세포를 400 ×g에서 3분 동안 원심 분리하십시오. 그 후, PBM으로 세포를 3회 세척합니다.

그 후, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하십시오. 그런 다음, 세포를 1×10⁷ cells/mL 밀도로 PBM에 다시 현탁하고 22 °C에서 110 rpm으로 20시간 동안 흔들어 섞어줍니다. 다음으로, 세포를 400 ×g에서 3분 동안 원심분리한 후, 조건화 배지를 수집하십시오. 이후 4 °C에서 8,000 ×g로 15분 동안 원심분리하여 배지를 청징화합니다.

그 다음, 컨디셔닝 배지를 0.45 micrometer 필터로 여과하고 PBM으로 3배 희석합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하고, 24 웰 플레이트에 분주한 뒤 22 °C에서 1시간 동안 부착시킵니다. 이어서, 세포의 상층액을 미리 준비한 컨디셔닝 배지로 교체합니다.

16시간 후, 5배 대물렌즈를 사용하여 명시야 현미경으로 세포 응집을 시각화합니다. 여기서 Coronin-A가 결핍된 세포는 초기 발달 과정에서 결함을 보이며, Dictyostelium discoideum의 발달 주기 중 초기 단계인 다세포 응집체를 형성하지 못했습니다. 이 그림에서, 영양 세포 상태의 야생형 및 corA 결핍 세포를 세척하고 2시간 동안 기아 상태로 둔 후, 현탁액 상태에서 5시간 동안 6분 30분 간격으로 15 animal 또는 cyclic AMP를 처리하거나 처리하지 않았습니다.

외생적 cyclic AMP 펄스를 적용하자 야생형 표현형이 완전히 회복되었습니다. 이 그림에서는 지수 성장기의 야생형 및 corA 결핍 세포를 PBM으로 세척한 후, 멀티웰 플레이트에 접종하고 야생형 또는 corA 결핍 기아 세포로부터 얻은 조건 배지에서 배양하였습니다. 이미지는 세포 접종 16시간 후에 촬영되었습니다.

corA 결핍 Dictyostelium discoideum은 발달 유도에 필요한 모든 인자를 생성할 수 있었으나, 이에 반응하지는 못했습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 배양 시간을 포함하여 20시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 균주에 따라 세포 밀도, 부착 시간, 발달 시간과 같은 분석의 여러 변수를 조정해야 한다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.

이 절차에 이어 생화학적 분획 및 후속 프로테오믹스 분석을 수행하여 Dictyostelium discoideum의 초기 기아 반응에 관여하는 인자들을 식별할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 조건 배지 또는 cyclic AMP 펄스를 사용하여 침전 조건에서 Dictyostelium discoideum의 초기 발달을 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.