Name: 방법은 섬유 아세포 마이그레이션의 규정에 Mrp4 함유 Macromolecular의 단지를 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 학습하세요 섬유아세포 이동에서 MRP4의 역할과 고분자 상호작용체를 규명하는 방법을. 이 연구는 세포 이동 신호전달 경로와 조직 재생 치료에 대한 새로운 통찰을 제공합니다.

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R01-DK080834 및 R01-DK093045의 지원을 받았습니다. 원고를 편집해 주신 CCHMC Medical Writer J. Denise Wetzel에게 감사드립니다.

1. 독창성 통로 분석 <ol><li> 업로드 단백질 상호 작용 체의 데이터 집합 <ol><li> 자신의 고유 한 유전자 식별자 (질량 분석 데이터를 얻을으로 바람직 유전자 기호 및 유전자 식별 번호)와 스프레드 시트에 대한 관심의 단백질 / 유전자를 삽입합니다. </li><li> 유전자 식별 번호에 대한 스프레드 시트에서 하나의 컬럼과 관측 값에 대한 하나의 컬럼을 지정합니다 (예 :., 접어 변화 또는 p 값). 열 머리글을 볼 수있는 &#39;열 머리글을 포함&#39;옵션을 선택합니다. </li><li> 업로드 데이터 세트 탭을 클릭하고 위에서 언급 한 스프레드 시트를 선택하여 IPA의 데이터 집합을 업로드합니다. 유연한 형식 탭을 선택하고 유전자 식별자의 적절한 범주를 선택합니다. 참고 : 데이터 세트의 유연한 형식은 업로드에 대한 형식 사양을 극복한다. </li><li> 데이터 집합이 나타나면, ID 및 관찰 열을 선택합니다. 확인 대량 특검팀에 의해 식별 단백질 (MRP4의 상호 작용 체의 모든ectrometry) 데이터 집합 요약 탭을 선택하여 매핑됩니다. 데이터 집합 이제 원하는 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 참고 :이 연구에 사용 된 IPA 기능의 부분적인 사용이 설명되어 있습니다. <ol><li> 고유 식별자로 자신의 유전자 이름으로 MRP4의 상호 작용 체를 업로드 한 후, 새를 클릭 IPA 소프트웨어의 왼쪽 상단 메뉴의 핵심 분석을 선택합니다. </li><li> 실험 종류에 따라 강도의 발현 컷오프 값을 설정 ((100)의 강도 값은 분석을 위해 권장). </li><li> 제어 및 실험 조건이 참여하고 비교 분석을 수행 할 필요가있는 경우 데이터 세트 파일의 일부로 포함 할 경우 데이터 집합을 준비하는 동안 식의 접이식 변화를 계산한다 (1.5 배 변화의 컷 - 오프 값은 일반적으로 분석을 권장합니다 ). 주 : 코어 분석 종료 후, 해석의 여러 부분을 얻을 수있다. 첫 번째 탭은 일의 요약 정보를 보여줍니다전자는 전체 분석과 다른 사람의 사이에서 최고 정식 경로, 상류 규제, 분자 및 세포 기능 및 네트워크를 제안한다; 모든 신뢰 수준 (p 값)에 기초하여 계산 된 P 값의 오름차순으로 배열. </li><li> 그림으로 중첩 교차 이야기를 보여 (열린 경로 옵션을 사용하여) 주요 정식 경로와 같은 큰 분자 네트워크를 열고 신호 전달 경로에 영향을 미쳤다. majorly의 p 값에 따라 포함되는 정식 경로의 목록을보고 하였다 (p &lt;0.05 중요한 것으로 간주된다). 참고 : 표준 경로에 대한 중요성 값은 오른쪽 꼬리 피셔의 정확한 시험에 의해 계산된다. 중요성은 혼자 우연에 의해 정식 경로로 데이터 세트에서 분자 협회의 확률을 나타냅니다. </li><li> 각 경로에 관여하는 단백질의 목록 중 입력 단백질 (질량 분석에 의해 식별 MRP4의 상호 작용 체)를 확인합니다. 참고 :이 OPTIO를 사용하여N, 상기 셀룰러 네트워크 액틴 세포 골격 신호 입력 단백질이 맞지 주요 영향 경로 및 방법 (도 1)는 것을 관찰 하였다. 이 방법은 분자 네트워크 밀접하게 관련된 시험 단백질에 의해 영향을받을 수있는 식별 할 수 있습니다. </li><li> 잠재적 포커스 분자의 수에 기초하여 특정 단백질 네트워크에 연결되어있는 상단 질환 및 기능을 식별하는 분석에서 네트워크 탭을 사용한다. , 스코어 값이 네트워크 등의 일부로서 결정되는 공지 된 단백질에 기초하여 주어진 문헌 지식 및 실험 증거를 통해 셀룰러 조립 조직 네트워크 및 데이터 세트로부터 식별되는 분자를 집중하고, 네트워크의 일부가된다 :. 참고 . 이제부터, 네트워크는 포커스 분자의 수에 기초하여 처음에 여과 얻는다. </li></ol></li></ol> 2. 높은 콘텐츠 현미경 <ol><li> 세포의 준비 주 : 모든 세포 배양 작업은 수평 유동 세포 배양 후드 아래 시행 하였다. <ol><li> 상처 치유 분석을위한 마이크로 플레이트 96 웰을 사용합니다. </li><li> 코트 (PBS에서 재구성) 1 % 피브로넥틴 용액으로 마이크로 플레이트, 2 시간 동안 37 ° C에서 표준 CO 2 인큐베이터에서 접시를 유지한다. </li><li> - / -과 Mrp4 + / + 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs에) 인큐베이터에서 25 cm² 세포 배양 플라스크에서 성장, 4 배 트립신 EDTA 용액 1ml를 사용하여 5 분 동안 세포를 PBS로 1 회 세척하고,를 Trypsinize Mrp4 제거합니다. </li><li> 완전 배지와 완전 배지 5ml에이를 재현 탁 (DMEM은 10 % FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 함유) 세포를 세척 하였다. </li><li> 우물에서 피브로넥틴 솔루션을 대기음. 혈구 세포를 이용하여 카운트하고 각 웰에 (셀 수는 세포 유형에 따라 최적화 될 필요가있다) 30,000 세포 종자. </li><li> 표준 100 % 합류로 세포 성장CO 24 시간 동안 37 ° C에서 2 배양기. </li></ol></li><li> 만들기 상처 <ol><li> 모든 우물이 솔루션으로 가득해야합니다. 상처 제작 도구의 손상을 방지하기 위해 PBS로 사용하지 않는 우물을 입력합니다 (예 :., WoundMaker). </li><li> 100 % 세포의 합류를 확인한 후, 상기 금속 기판에 상처 제작 공구 내부의 96 웰 플레이트를 놓고 아래 96- 웰 핀 블록을 누른다. </li><li> 어떤 빠질 세포를 제거하고 완전 배지 100 μl를 추가 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 시험 화합물을 추가 - H-89 (50 μM 1 : 완전한 미디어 DMSO에 50 mM의 주식을 사용하여 1,000 희석) 또는 Latrunculin B (1 μM 1 : DMSO에 1 mM의 주식을 사용하여 전체 미디어와 1,000 희석)이 단계에서 . </li><li> 37 ° C에서 독자 내부의 분석 플레이트를 놓고 실험 기간 동안 마이그레이션을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 모니터링 셀 마이그레이션 참고 : 셀 마이그레이션 현미경 및 소프트웨어 홍보를 사용하여 측정 하였다하이 콘텐츠 현미경 시스템 ovided. 상처 자동 현미경으로 모니터하고 소프트웨어에 의해 등록되도록 96 웰 마이크로 플레이트의 용도. <ol><li> 일정 검색 탭을 사용하여 마이그레이션 분석에 대한 분석 플레이트를 매 시간마다 스캔 소프트웨어를 설정합니다. 적어도 15 분 전에 평형화 촬상을 허용하도록 리더 내부 분석 플레이트를 배치 한 후 시작 시간을 선택한다. </li><li> 트레이를 선택하고 선종 (96 웰 마이크로 플레이트) 실험 유형 (스크래치 상처)를 선택합니다. </li><li> 10X 목표를 선택하고, 위상차 영상 매개 변수를 선택합니다. 편집 스캔 패턴 옵션을 사용하여 스캔 할 필요가있는 우물을 선택합니다. </li><li> 속성 탭을 선택하고 접시 맵을 설정하여 치료 그룹 및 복제를 지정합니다. 스캔은 실험 조건에 따라 언제든지 정지 될 수있다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 <ol><li> 스캔이 완료되면 분석 판의 용기보기 탭을 선택합니다. 지분석 작업 유틸리티를 선택 출시 새로운 분석 작업에 오. </li><li> 작업 유형으로 스크래치 상처를 설정하고 분석 (24 시간 시점 0 시점)의 시간 범위를 선택합니다. </li><li> 선택 우물은 우물에 한 번의 클릭으로 분석을 위해 선택하고 분석을 시작하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. 분석이 완료되면, 그래픽 그래프 옵션으로 수출을 사용하여 각 시점에서 각 웰에 대한 상대 상처 밀도 (RWD) 데이터를 시각화. </li><li> 각각의 잘보기 이미지 탭을 사용하여 서로 다른 시간 포인트에 해당하는의 위상 대비 이미지 세트를 볼 수 있습니다. 판지도를 클릭하여 특정 잘 선택한 시간 범위 탭에서 특정 시점을 선택하고보기 이미지 탭을 클릭합니다. </li></ol></li></ol> 3. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) <ol><li> 세포의 준비 <ol><li> (2.1 절에 설명 된대로)와에 보관 1 % 피브로넥틴 용액 100 ㎕와 코트 35mm 유리 바닥 요리2 시간 동안 37 ° C에서 표준 CO2 인큐베이터. </li><li> 완전 배지에 HEK293 세포의 플레이트 종자 동수의 피브로넥틴 용액 (10,000 세포 / 플레이트) 대기음. </li><li> 24 시간 동안 37 ° C에서 표준 CO 2 배양기에서 피브로넥틴 코팅 유리 바닥 요리 60 ~ 70 %의 합류로 세포를 성장. </li></ol></li><li> 형질 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 상용 형질 전환 시약을 사용하여 모든 일시적 형질 감염을 수행한다. </li><li> 나누어지는 각 35mm 요리에 대한 두 개의 1.5 ml의 멸균 원심 분리기 튜브에 완전한 매체의 250 μL. </li><li> 하나의 튜브와 5 μL의 DNA (pmAKAR3 또는 pmAKAR3-TA)의 2 μg의 다른 튜브에 형질 전환 시약 (2.5은 DNA 농도를 배)를 추가합니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 튜브를 인큐베이션 한 다음 형질 감염 시약을 함유하는 튜브로 희석 DNA 옮긴다. </li><li> 철저하게 혼합하고 37 부화또 다른 30 ​​분 동안 C를 °. </li><li> 셀 오프 매체를 기음과 PBS로 한번 씻어. 세포에 10 % FBS를 함유하는 항생제없이 DMEM F-12 배지 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 각 플레이트의 세포 미디어와 DNA 지질 복합체의 507 μl를 추가 부드럽게 혼합하고, 48 시간 동안 37 ° C에서 CO 2 배양기에서 유지. 각각의 접시에 10,000-50,000 세포에 대한 DNA (1 μg의 / μL 주) 5 ㎕를 지질의 2 μg의를 사용합니다. </li></ol></li><li> 라이브 셀 이미징 <ol><li> 형질 감염 48 시간 후, 행크의 균형 잡힌 염 용액으로 두 번 성장 배지를 제거하고 세포를 세척 (HBSS은 37 ℃ 예열 기음). 사용자 정의 만든 37 ° C의 내부 FRET 영상에 대한 반전 넓은 필드 현미경 시스템에서 세척 된 세포에 1.9 ㎖의 HBSS의 최종 볼륨을 추가하고 마운트 챔버를 유지했다. 이 시스템에서, 여기 광은 50 %의 광 transmiss와 감광 필터 감쇠 300 W 크세논 램프에 의해 제공된다 : 참고이온. </li><li> 60X 목표를 사용합니다. 수동으로 세포에 초점 현미경을 사용하여보기의 최적의 필드를 설정합니다. 소프트웨어에 초점 &quot;F&quot;옵션을 사용하여 컴퓨터 화면에 뷰의 선택한 필드를 활성화합니다. FRET 측정을 수행하기위한 적절한 필터 집합 (a 25분의 430 nm의 여기 필터, 더블 이색 성 빔 스플리터 설정 CFP / YFP 필터, 및 두 개의 발광 필터 FRET 대 (30분의 470 내지위한 CFP 및 30분의 535 나노 미터)을 선택 수동으로. </li><li> 처음 열 불소 탭을 클릭 한 다음 채널 옵션 CFP / YFP / FRET에 확인하여 형광을 시각화합니다. 카메라 탭의 강화 도구를 사용하여 신호 강도를 향상. </li><li> 신호 강도의 포화를 회피 pmAKAR3 또는 pmAKAR3-TA 발현 세포를 선택. FRET 측정을 시작 캡처 창을 사용하십시오. </li><li> 시간 경과 옵션 및 설정 30 초 간격으로 30 분 동안 한 번 스캔을 선택합니다. 프렛 옵션을 확인하고 100 밀리 초에서 노출 시간을 설정합니다. 이미지 레이블를 입력D의 Enter 키를 눌러 측정을 시작하기 시작합니다. </li><li> 다섯 시점과 기준의 확립 후, 30 분의 총 세포를 플레이트에 영향을주지 않고 세포 포스 콜린 25 μM (HBSS 100 ㎕ 희석 에탄올 중 10 μM 스톡, 5 μL)를 첨가하고, 감시한다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 참고 : 데이터 분석을 위해 사용 비율 계량 계산 모듈을. <ol><li> 이미지 창 왼쪽에있는 선택 도구를 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 고체 사각형을 선택합니다. 셀 무료 영역에서 이미지 필드에 사각형을 드래그하고 마우스 오른쪽 배경 공제의 목적을 위해 배경으로 설정하도록 클릭합니다. </li><li> 마스크로 이동 옵션 &#39;새 마스크를 만들&#39;사용합니다. 선택 도구로 이동하여 수동으로 측정하여 선택 셀 주위에 마스크를 그릴 드롭 다운 메뉴에서 펜을 선택합니다. 조건 당 적어도 4-6 셀을 선택합니다. </li><li> 마스크 탭을 선택하고 마스크 통계를 수행합니다. </li><li> &#39;전체 마스크&#39;를 확인 교차 채널 옵션을 선택 기증자 정규화 FRET (N-FRET) (FRET / CFP)를 확장합니다. 상기 n 값은 FRET 세포막의 PKA 활동 나타낸다. </li><li> 룩업 테이블과 규모 표시 줄을 주석을 사용하여 타임 스탬프를 추가합니다. </li></ol></li></ol>

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세포 이동은 상처 치유를 포함한 많은 중요한 생리학적 사건에서 없어서는 안 될 역할을 하는 복잡한 과정입니다1,2. 비정상적인 세포 이동은 종양 전이 및 혈관신생과 같은 치명적인 사건을 유발할 수 있습니다24,25. 따라서 정상적인 신체 기능을 유지하기 위해서는 세포 이동의 미세 조절이 필요합니다.
고함량 현미경18을 사용하여 MRP4 결핍 MEF가 야생형 섬유아세포에 비해 더 빠르게 이동한다는 것을 입증했습니다14. 기존의 스크래치 상처 분석과 달리 여기의 현미경은 자동화된 편리하고 일관되며 처리량이 높은 방식으로 상처 치유 분석을 수행합니다. 소프트웨어는 i) 상처 폭의 변화, ii) 상처 영역 내 세포 합류의 변화, iii) 상대 상처 밀도(RWD)의 세 가지 개별 지표를 기반으로 세포 이동률을 분석합니다. RWD는 상처 부위 외부의 공간 세포 밀도에 비해 상처 부위 내부의 공간 세포 밀도를 측정...

세포 이동은 복잡한 여러 단계의 프로세스입니다. 연구는 이주 세포 중 선행 및 후행 가장자리에 편광되는 것으로 나타났습니다. 셀 몸이 앞으로 이동하는 세포 외 기질에 부착함으로써, 리딩 엣지가 필요한 견인을 제공합니다. 마지막으로, 가장자리 자료를 후행 후면 첨부 파일 및 마이그레이션주기 1, 2를 완료합니다. 효율적인 세포 이동에 대한 세포 편광은 세포 내 신호의 공간 분리에 의해 조절된다. 이러한 캠프와 같은 셀룰러 두 번째 메신저는 미세 조정 방향 셀 마이그레이션 3,4에 필요한 신호 이벤트의 구획화을 중재. 최첨단 캠프와 캠프에 의존 키나제 PKA 활동의 우선 축적은 방향성 세포 이동 5,6의 핵심 역할을한다. 이러한 라스 관련 C3의 보툴리눔 독소 기판 (RAC) 및 세포 분열 조절 단백질 (42) 동족체 또는 Cdc42, PK 작은 GTP 아제를 인산화함으로써,A는 최첨단 액틴 관련 단백질 2/3 ARP (2/3)를 활성화하고 lamellipodia 7-9의 형성을 유도한다. PKA는 항 - 캡핑 화제 인산화, 혈관을 확장하여 막 신축 10,11의 진동주기를 조절하는, 인 단백질 (VASP)를 자극. 막 - 결합 유출 운송 (3)에 의해 전) 합성 아데 닐 레이트 사이 클라 제, 포스 포에 의해 ⅱ)의 악화, 그리고 ⅲ) 교통으로 : 세포에서 캠프 레벨은 세 가지 주요 프로세스에 의해 조절된다. 다제 내성 단백질 4 (MRP4), 순환 뉴클레오티드의 내생 유출 수송 등의 막 수송, 기능의 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 가족의 일원. 따라서, MRP4는 세포 내 캠프 수준을 조절할 수 있으며, 캠프에 의존하는 세포는 11 ~ 13 신호. - / -, 섬유 아세포는 순환 뉴클레오티드의 상대적으로 높은 수준을 포함하고 빠른 C를 마이그레이션 우리는 이전 Mrp4에 있음을 보여 주었다Mrp4 + / + 섬유 아세포 (14)에 ompared. 우리는 또한 섬유 아세포 이전에 주기적 뉴클레오티드의 이상성 효과를보고했다. 이전의 연구에 근거하고 Mrp4는 우리의 발견 - / - 섬유 아세포 마이그레이션 과정 중 더 편광 캠프를 포함, 우리는 섬유 아세포의 이동이 MRP4 매개 규제 캠프 의존한다는 가설을 세웠다. 하류 메커니즘을 이해하기 위해 직접 아직 다각적 접근했다. 관련 및 MRP4와 상호 작용의 단백질을 식별하기 위해, 우리는 이상 MRP4을 표현하는 HEK293 세포에서 MRP4 함유 고분자 복합체를 면역. 질량 분석기를 사용하여, 우리는 여러 MRP4 - 상호 작용하는 단백질을 확인하고 독창성 통로 분석 (IPA)를 사용하여 자신의 상호를 분석 하였다. IPA는 (구조 및 기능 모두) 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하고 특히 생리와 병리에 자신의 기여를 탐구하는 유용한 도구입니다문헌과 실험 증거 (15, 16)에 따라 이벤트. IPA는 캠프 및 cGMP의 분자 (17) 신호 키 어디 F-액틴은 세포 이동의 맥락에서 MRP4의 주요 다운 스트림 대상이라고 지적했다. 이러한 데이터는 더 높은 콘텐츠 현미경으로 확인 하였다. 높은 콘텐츠 현미경 캡처하고보다 편리하고 정확하고 높은 처리량 방법 (18) 이러한 세포 이동과 같은 세포 행동을 분석 할 수 있습니다. 고 함량 현미경 데이터는 섬유 아세포 이동에 MRP4의 효과가 완전히 PKA 17 액틴 세포 골격 또는 억제의 중단에 폐지되어 보였다. 또한, 우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 실시간으로 세포를 이전에 PKA 역학을 모니터링 PKA 센서 기반의 사용. FRET 기반 키나제 센서는 일반적으로 CFP와 YFP의 형광 19-21에 의해 형벌 특정 인산화 기판 펩타이드로 구성되어 있습니다. pmAKAR3는 향상과 나된다mbrane는 forkhead 관련 도메인 1 (FHA1)와 PKA 기판 순서 LRRATLVD 5,22를 포함 FRET 기반 PKA 센서를 대상으로. PKA 촉매 서브 유닛이 증가하여 pmAKAR3의 인산화는 CFP와 YFP (19) 사이의 신호를 FRET. 센서로 지질 개질 영역의 삽입은 특히 막 구획 23, PKA 역학 모니터링 세포막에 타겟팅. pmAKAR3를 사용하여, 우리는 증명이 Mrp4 마이그레이션의 첨단 - / - 결과적으로 세포의 리딩 엣지 (17)의 대뇌 피질 굴지의 형성을 증가 Mrp4 + / + 섬유 아세포,보다 더 편광 PKA의 활성을 나타내 섬유 아세포. 함께, 이러한 이벤트는 MRP4의 부재에서 더 나은 휴대 편광 빠르게 방향 세포 이동의 결과. 우리의 구체적이고 직접적인 방법은 MRP4 주요 다운 스트림 대상을 식별하는 중요한을 제공하지만, 같은섬유 아세포 마이그레이션 MRP4 의존 규제의 아직 미개척기구.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen(캘리포니아주 칼즈배드)&nbsp;</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (캘리포니아주 칼즈배드)&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well IncuCyte Image-Lock 마이크로플레이트&nbsp;</td><td>Essen BioScience</td><td>4493</td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin B</td><td>Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스).</td><td></td><td>DMSO</td></tr><tr><td>H-89</td><td>Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)</td>에 L5288 재고<td>BML-EI196</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시에 재고&nbsp;</td><td>(MatTek 코퍼레이션; Ashland, MA)</td><td>P35G-1.5-20-C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스).</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 환원 혈청 배지</td><td>인비트로겐(캘리포니아주 칼즈배드)&nbsp;</td><td>31985-088</td><td></td></tr><tr><td>FRET 현미경 시스템</td><td>올림푸스 도립 현미경 (IX51)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CCD 카메라&nbsp;</td><td>일본 하마마츠</td><td>ORCA285</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook software 5.5</td><td>Intelligent Imaging Innovation (콜로라도주 덴버)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis software</td><td>IPA, QIAGEN Redwood City,Forskolin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Tocris (Ellisville, MO).&nbsp;</td><td>1099</td><td>100% EtOH</td></tr><tr><td>DMEM F-12 재고&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen (캘리포니아주 칼즈배드)&nbsp;</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen (캘리포니아주 칼즈배드)&nbsp;</td><td>14025-134</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen(캘리포니아주 칼즈배드)&nbsp;</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA 용액(TE)</td><td>인비트로겐(캘리포니아주 칼즈배드)&nbsp;</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로겐(캘리포니아주 칼즈배드)&nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>년

방법은 섬유 아세포 마이그레이션의 규정에 mrp4 함유 macromolecular의 단지를 공부하기

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

약제 내성 단백질 4 (MRP4)은 막 수송의 ATP 결합 카세트 가족의 일원이며, 주기적 뉴클레오티드의 내생 유출 수송이다. 세포 내 사이 클릭 염기 농도를 조절함으로써, MRP4는 세포 이동을 포함한 다수의 환상 뉴클레오티드 - 의존성 세포 사건을 조절할 수있다. 이전에는 MRP4의 부재, 섬유 아세포 세포가 세포 내 환상 뉴클레오티드의 더 높은 수준을 함유 빠르게 마이그레이션 수 보였다. 이러한 발견의 기본 메커니즘을 이해하기 위해서, 우리는 직접 아직 다각적 인 접근 방식을 채택했다. 먼저, 질량 분광법에 의해이어서 면역을 사용 MRP4 과발현 세포 시스템에서 MRP4 잠재적 상호 작용 단백질 복합체를 격리. MRP4의 상호 작용 체에 고유 한 단백질을 식별 한 후, 우리는 신호 전달의 맥락에서 이러한 단백질 - 단백질 상호 작용의 역할을 탐구하는 독창성 통로 분석 (IPA)을 이용했다. 우리는 포를 밝혀세포 이동에 MRP4의 효과의 주요 중재자로 세포 이동에 MRP4 단백질 복잡하고 확인 F - 굴지의 tential 역할. 이 연구는 또한 철새 현상의 핵심 선수로 캠프 및 cGMP의의 역할을 강조했다. 높은 콘텐츠 현미경을 사용하여, 우리는 세포 마이그레이션 분석을 수행하고 섬유 아세포의 이동에 MRP4의 효과가 완전히 캠프에 의존 키나제 A (PKA)의 액틴 세포 골격 또는 억제의 중단에 의해 폐지되는 것을 관찰했다. 실시간 마이그레이션 셀에 변조 신호 시각화하기 위해, 우리는 PKA 활성을 측정하기위한 FRET 기반 센서를 활용 발견, Mrp4 마이그레이션의 첨단 근처 더 편광 PKA 활동의 존재 - / -에 비해 섬유 아세포, Mrp4 + / 섬유 아세포를 +. 이것은 차례로 피질 액틴 형성을 증가 이전의 과정을 증대. 우리의 접근 방식은 MRP4 하류 작용하는 단백질의 식별을 가능하게하고 이상 우리에게 제공섬유 아세포 마이그레이션 MRP4 의존 조절에 관여하는 메커니즘의보기.

섬유 아세포 이동에 MRP4의 효과를 연구하기 위해, 우리는 높은 함량 현미경 (14)을 이용하여 상처 치유 검정을 사용 하였다. 정확한 상처에서 격리 MEFs에의 합류 단일 층에 만들어진 하나 Mrp4 - / - 또는 Mrp4 + / + 마우스, 이미지는 24 시간 동안 1 시간 간격으로 촬영 하였다. Mrp4 + / + MEFs에 (그림 2)에 비해 MEFs에 - / - 우리는 Mrp4에 대한 높은 이동 속도를 관찰했다. Mrp4 + / + MEFs에이 상처를 덮도록 약 20 시간을 요구하는 반면, MEFs에 - / - 상처가...

MRP4는 세포 이동에 최근에 밝혀 역할 등 다양한 주기적 뉴클레오티드 종속 신호 이벤트를 조절한다. 우리는 섬유 아세포 이전의 미세 조정 조절에 중요​​한 역할을 고유 MRP4의 상호 작용 체의 식별 결과 MRP4의 하류 분자 표적을 해명하기 위해 직접하지만, 다각적 인 접근 방법을 설명합니다.

방법은 섬유 아세포 마이그레이션의 규정에 Mrp4 함유 Macromolecular의 단지를 공부하기

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 MRP4에 의한 cyclic AMP 의존적 섬유아세포 이동 조절을 관찰하는 것입니다. 고접촉 현미경(High contact microscopy)은 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, MRP4는 약물 내성을 부여할 뿐만 아니라 세포 내 cyclic nucleotide 농도를 조절함으로써 세포 이동과 같은 생리적 과정을 조절할 수 있습니다. 오늘 시도할 FRET 이미징의 주요 장점은 cyclic AMP와 cyclic AMP 의존적 인산화효소의 세포 내 역동성을 실시간으로 모니터링할 수 있다는 점입니다. 고접촉 현미경의 시사점은 신약 개발에 활용될 수 있다는 것입니다. 시스템과 모든 기기의 설정이 완료되면, 이 플레이트 기반 작업에는 인위적인 개입이 필요하지 않습니다. 이 방법은 세포 이동에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 지질 세포 비교란 고접촉 이미징, 면역 세포 살상, 세포 희석, 혈관 신생, 세포 증식, 화학 주성 및 treatese phyllite와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 세포 배양 후드 내에서 고접촉 현미경을 위한 세포를 준비하려면, 1% fibronectin PBS 용액을 사용하여 96-well plate의 웰을 코팅하십시오. 플레이트를 37°C CO2 인큐베이터에서 배양하십시오.

methods-to-study-mrp4-containing-macromolecular-complexes-regulation

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

본 논문은 특정 리간드에 leukocytes의 chemotactic 응답을 확인하고 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 세포 표면 수용체와 cytosolic 단백질 사이의 상호 작용을 식별하는 방법을 설명합니다.

Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

시간 경과 현미경 검사법과 이미지 처리 기술은 48시간 동안 환경적으로 통제된 생물 반응기에서 섬유아세포 매개 젤 다짐 및 피브린 섬유 재정렬을 관찰하고 분석하는 데 사용되었습니다.

섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

이 프로토콜은 확산 세포의 가장자리에서 돌출부의 동적 매개 변수 (돌출부, 수축, 주름)를 측정하는 것을 목표로합니다.

라이브 셀 현미경을 사용하여 확산 중 셀 에지 돌출 역학 측정

학습하세요 섬유아세포 이동에서 MRP4의 역할과 고분자 상호작용체를 규명하는 방법을. 이 연구는 세포 이동 신호전달 경로와 조직 재생 치료에 대한 새로운 통찰을 제공합니다.

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