예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

이 비디오의 전반적인 목표는 인핸서(enhancer)라고 하는 유전자 조절 요소를 식별하고 실험적으로 검증할 수 있는 통합된 방법 세트를 제공하는 것입니다. 이 방법은 인핸서 선택 및 사용, 세포 분화 사용 또는 외부 자극에 대한 반응을 포함하여 생물학적 사건의 전사 및 조절에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제시된 작업 흐름의 주요 이점은 프로토콜을 모든 세포 모델 시스템에서 쉽게 조정하고 사용할 수 있다는 것입니다.

절차의 단계를 시연하겠습니다. 시작하려면 기존 칩 seq 분석을 기반으로 후보 인핸서를 선택하십시오. 게놈 브라우저를 사용하여 원하는 칩 염기서열 분석 결과(chip seq experiment)의 결과를 확인하고 관심 유전자에 근접한 결합 부위를 식별할 수 있습니다.

Define a Region of Interest(관심 영역 정의)를 선택하여 선택한 게놈 영역의 200-400 염기쌍 염기서열을 얻고 이 염기서열을 후속 프라이머 설계에 사용합니다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 선택한 게놈 영역을 리포터 플라스미드 구조체로 증폭 및 복제할 수 있습니다. 인핸서 활성을 테스트하기 위해 먼저 웰당 200마이크로리터의 0.1% 젤라틴 용액을 48개의 웰 플레이트에 첨가하여 리포터 구조를 대량 배아 줄기 세포에 transfection합니다.

전에 30분 동안 플레이트를 배양합니다. transfection 전날, 250 마이크로 리터의 ES 배지에서 250 마이크로 리터의 ES 배지에 웰당 4번째 세포에 3배의 밀도로 주입합니다. transfection 당일, 플라스미드 혼합물을 준비하여 각 혼합물에서 8개의 well을 만들 수 있도록 합니다.

각 플라스미드 혼합물에 transfection 품질의 감소된 혈청 배지를 추가하여 부피를 최대 106 마이크로 리터까지 가져옵니다. 그런 다음 4.5마이크로리터의 ES 품질 transfection 시약을 넣고 위아래로 15회 피펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다. transfection mix를 실온에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 형질주입 혼합물의 웰당 13마이크로리터를 세포에 첨가하고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다. 그런 다음 이끼를 처리하기 전날 밤 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다. Transfection 효율성은 중요한 단계입니다.

다른 셀 유형을 사용하는 경우 이 단계를 최적화해야 합니다. 가장 관련성이 높은 세포 유형을 사용하여 인핸서 활성을 테스트하여 상황에 따른 효과를 최소화합니다. 다음 날, 흡인에 의해 매체를 조심스럽게 제거하고 1 마이크로 몰 모든 트랜스 레티노산 또는 DMSO를 운반체로 포함하는 웰 당 250 마이크로 리터의 새로운 배지를 추가합니다.

24-48시간 동안 세포를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용해 완충액을 준비한 후 세포에서 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 1X PBS를 사용하여 세포를 한 번 상승시킨 다음 웰당 200마이크로리터의 1X 용해 완충액을 추가합니다.

실온에서 2시간 동안 세포를 흔듭니다. 그런 다음 완전한 세포 용해를 위해 플레이트에서 세포 용해물을 섭씨 80도에서 동결합니다. 용해물을 완전히 해동한 후 전자 다중 채널 피펫을 사용하여 80마이크로리터의 세포 용해물을 베타 갈락토시다아제의 경우 96웰 투명 플레이트로 옮기고, 루시페라아제 측정을 위해 40마이크로리터의 용해물을 흰색 플레이트로 옮깁니다.

베타 갈락토시다아제를 수행하려면, 베타갈 기질 완충액 1ml와 OMPG 4mg을 혼합합니다. 그런 다음 혼합물에 3.5 마이크로 리터의 베타 메르 캅토 에탄올을 첨가하고 즉시 80 마이크로 리터의 세포 용해물에 100 마이크로 리터의 완충액을 첨가하십시오. 희미한 노란색이 나타날 때까지 섭씨 37도에서 반응을 배양합니다.

플레이트 리더에서 420나노미터의 흡광도를 읽고 데이터를 내보냅니다. 루시퍼라제 분석을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 기질 시약을 준비한 후 시작하기 전에 루시퍼라제 기질 시약을 실온으로 예열합니다. 그런 다음 40마이크로리터의 세포 용해물이 들어 있는 흰색 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터를 피펫으로 주입합니다.

즉시 발광 카운터 기계를 사용하여 신호를 측정하십시오. 최소 3개의 독립적인 transfection 및 실험으로부터 활성을 얻습니다. Perform은 텍스트 프로토콜에 따라 두 분석에 대해 계산합니다.

RTCPR에 의한 eRNA 검출을 위한 프라이머를 설계하려면 주석이 달린 유전자 전사체로부터 최소 1.5-2킬로 염기 떨어진 게놈 영역을 선택합니다. 유전자의 상대적 방향을 확인하고 감각 및 반감각 전사체의 위치를 결정합니다. enhancer RNA 정량을 위한 프라이머를 설계하려면 transcription factor 결합 부위의 중심에서 200-1, 000 염기쌍 영역을 선택합니다.

유전자가 마이너스 가닥에 있는 경우, 양성 가닥의 200-300 염기쌍을 복사하고 염기서열을 변환하여 역보체 염기서열을 얻습니다. 그런 다음 후속 프라이머 설계에 이 시퀀스를 사용합니다. 제품 크기 범위를 80-150 염기 쌍 사이로 설정합니다.

eRNA transcription을 측정하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 처리된 세포에서 total RNA를 분리한 후 표준 절차를 사용하여 RTCPR에 의해 역전사된 eRNA를 검출합니다. 정규화를 위해 비처리 의존성 mRNA를 측정합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 레티노산으로 처리된 ES 세포에서 얻은 RXR 칩 염기서열 분석 결과, RXR 점유 부위 아래의 핵 수용체 절반 부위가 농축된 것으로 나타났습니다.

생물정보학(bioinformatics) 알고리즘을 사용하여 절반 부위에 대한 모티프 검색 결과를 RXR 칩 염기서열 데이터에 다시 매핑했습니다. 이 분석을 통해 표준 핵 수용체 결합 부위와 겹치는 칩 피크를 식별했습니다. IGV에서 부위의 시각화는 Hoxa1에 가까운 전사 인자의 농축을 나타냈습니다.

이전에 특성화된 RAR RXR 표적. 새로운 RA 표적 사슬인 PRMT8에 대한 징벌적 강화제도 확인되었습니다. 식별된 인핸서 영역을 TK 루시페라제 리포터 벡터로 클로닝하고, ES 세포를 이들 작제물로 형질주입시켰다.

루시페라제 활성은 RA의 부재 및 존재 유무에서 측정되었습니다. RA 반응 요소(RARE)를 포함하는 구성물은 RA 처리 시 증가된 루시페라제 신호 강도를 보인 반면, RARE가 없는 구성물은 유도되지 않았습니다. Hoxa1 RAR RXR 결합 인핸서의 센스 및 안티센스 eRNA 발현이 유전자의 mRNA 발현과 상관관계가 있는지 확인하기 위해 Hoxa1 eRNA의 수준도 측정했습니다. 그 결과, 인핸서 활성이 단기간의 RA 치료에 의해 유도된다는 것이 확인되었다.

일단 숙달되면, 이 작업량은 설명된 인핸서 트랩 실험 및 인핸서 정량화를 수행하여 며칠 내에 완료할 수 있으며, 인핸서 활성에 대한 강력한 기능적 증거를 제공할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 징벌적 강화제를 식별하고 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인핸서(enhancer)가 확인되고 검증되면, 염색체 확인 캡처(chromosomal confirmation capture, CCC)와 같은 다른 방법을 수행하여 검증된 인핸서에 의해 어떤 유전자가 조절되는지와 같은 추가적인 중요한 질문에 답할 수 있습니다.