Name: 예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 학습하세요 유전자 규제 요소인 인핸서를 예측하고 검증하는 통합 방법을 통해 전사 조절 메커니즘을 연구하세요. 이 프로토콜은 다양한 세포 모델 시스템에 쉽게 적용할 수 있어 유연한 연구가 가능합니다.

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저자는 원고에 대한 토론과 논평을 해주신 Bence Daniel 박사, Matt Peloquin, Endre Barta 박사, Balint L Balint 박사 및 Nagy 연구실 구성원들에게 감사의 뜻을 전합니다. L.N은 헝가리 과학 연구 기금(OTKA K100196 및 K111941)의 보조금으로 지원되며 유럽 사회 기금과 유럽 지역 개발 기금 및 헝가리 뇌 연구 프로그램(보조금 번호)이 공동 자금을 지원합니다. KTIA_13_NAP-A-I/9.

칩 서열 분석에 기초하여 선택 1. 향상제 <ol><li> http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/에서 RXR 칩-SEQ 원시 데이터 fastq 파일 (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz를) 다운로드 </li><li> 다운로드 우리의 경우 (정렬에 필요한 BWA 인덱스 파일의 압축을 풉니 다 : Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz 참고 : 생물 정보학 분석의 단계에 대한 자세한 내용은 https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts에 방문하여 아래 사용되는 스크립트를 다운로드 할 수 있습니다. </li><li> (: perform_alignment.sh 스크립트를 사용) mm10 게놈에 예를 들어 fastq 파일을 맞 춥니 다. 이것은 .bam 파일과 정렬의 통계 폴더를 생성합니다. 정렬 RXR 칩 서열 데이터 (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) 및 해당 인덱스 파일 (.bai) 여기에 있습니다 : http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ 참고 : BWA는 RELA를 정렬하는 소프트웨어 패키지입니다이러한 마우스 참조 게놈 같은 서열 데이터베이스에 상대적으로 짧은 서열 (예를 들어, 칩 SEQ 결과) (예 mm10) 13. </li><li> 피크 통화 및 드 노보 모티브 분석을위한 스크립트 (callpeaks.sh)를 실행합니다. 입력으로 .bam 파일을 사용합니다. 스크립트는 호머 findPeaks (14)에 기초한다. 주 : 출력 파일은 우리에게 등 총 피크 수, 농축 모티브의, 배경의 비율, 그리고 주제와 표적 서열에 대한 정보를 제공합니다. (그림 1). 일반적으로 여러 주제는 중요도의 순서에 따라 열거되어있다. </li><li> # 1 순위 모티브 (NR 절반`AGGTCA`)를 매핑 (: remap_motif.sh 스크립트를 사용) 참고 : 결과, 스크립트는 칩 - 피크가 관심의 전사 인자의 정규 결합 부위를 포함하는 게놈 영역을 커버하는 표시됩니다 .bed 파일을 생성합니다. </li><li> (mm_ES_RX을 다운로드하여 읽어 정렬 RXR 칩-서열의 결과를 시각화R_24h_ATRA.bam (또한 .bai 다운로드)) 및 통합적인 유전체학 뷰어 (IGV) (15)에 의해 AGGTCA 모티브 발생 (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed는) / 추정 RAR를 식별 RXR 결합 부위 (그림 2와 그림 3)입니다. 참고 : 다양한 칩 - 서열 데이터의 통합 정확하게 좋은 후보 강화제 (16, 17)을 예측 이상으로 도움이 될 것입니다. 최근의 연구는 활성 증강은 일반적으로 P300을위한 농축 및 H3K4me1 및 H3K27ac와 상관 관계, 또한 18 ~ 21을 권장함으로써 DNase의-I 과민를 표시하는 오픈 염색질 지역에 위치하는 것으로 나타났습니다. </li><li> 선택한 게놈 영역의 400 bp의 순서 및 후속 프라이머 설계를위한 이러한 시퀀스를 사용 - (가) (200)를 얻기 위해 IGV (15)에 &quot;관심 영역을 정의&quot;를 사용합니다. </li></ol> 2. 리포터 분석 주 : 루시페린 / 루시 페라 제를 사용하는 시스템전사 조절에 대해 매우 민감 기자 분석 등. 인핸서 활성을 루시퍼 라제 효소에 따라 검출 될 수있는 bioluminescense 결과 oxyluciferin하는 루시페린의 산화를 촉매하는 것이다 생성된다. 첫 번째 단계로서, 식별 된 추정 인핸서 서열은 리포터 벡터 (예 : 루시 페라 TK-22 또는 pGL3 NanoLuc)에 서브 클로닝한다. <ol><li> 프라이머 디자인 <ol><li> 23 : (http://bioinfo.ut.ee/primer3/ 사용할 수 있습니다 여기에) Primer3으로 추정 인핸서 지역의 400 bp의 - (200)의 증폭을위한 디자인 PCR 프라이머 </li><li> Primer3로 추정 결합 부위를 포함 IGV의 게놈 시퀀스를 복사 - 붙여 넣기 (단계 1.7 참조​​). 세트 제품의 크기 범위 250 - Primer3 300 bp의. </li><li> UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 PCR 프라이머의 유효성을 검사하는 것은 실리 PCR 도구에서 (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24입니다 주 : 이후 단계에서이 프로토콜은 HindII를 사용I와의 BamHI 제한 복제에 대한 효소. 확인 여부 AAGCTT 또는 GGATCC 제한 부위를 포함 할 UCSC에서 실리 PCR 도구에 의해 예측으로 PCR 증폭 순서 (예를 들어, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). </li><li> 상용 공급 업체에서 필요한 프라이머를 얻습니다. </li></ol></li><li> 게놈 DNA에서 증강 시퀀스의 PCR 증폭 <ol><li> 일차 전지 (예를 들어, 기본 배아 섬유 아세포)에서 템플릿 게놈 DNA를 정화. gDNA를 격리를위한 상업 키트를 사용하여 제조업체의 지침을 따르십시오. 참고 : gDNA를 높은 품질이 성공적으로 PCR 증폭을 위해 필수적이다. PCR은 gDNA를 행 쉽지 않은 경우, 적절한 BAC 클론을 사용할 수있다. </li><li> gDNA를 NG (100), 5 ㎕의 10 배 버퍼, 3 μl의 황산 (25 mM)을 5 μL의의 dNTP (2 mM의 각), 1.5 ㎕를 빨리 감기 프라이머 (10 μM), 1.5 μL의 계 프라이머를 포함하는 50 μl의 PCR 반응을 준비합니다 (10 μM) 1 μL의 DNA 폴리머 라제 <li> PCR을주기 설정 (2 분 95 ° C (20 초 95 ° C, 10 초를 58-65 ° C, 18 초 70 ° C) X25 반복, 2 분 70 ° C, 영원히 4 ° C). 프라이머의의를 고려하여 설정 어닐링 온도를 Tm 값을 예측했다. </li><li> 상업 PCR 정제 키트와 PCR 제품을 정화하고 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 위에 사용 된 프라이머로 PCR을 반복하지만, 그 (5)에 돌출을 추가로 클로닝하기위한 제한 부위를 도입 &#39;말단 (예를 들면, 빨리 감기 : 5&#39;-ATAT AAGCTT XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3&#39;(HindIII에) 계 : 5&#39;-TATA GGATCC의 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX -3 &#39;(을 BamHI)). </li><li> 불특정 PCR 제품을 확인하는 아가로 오스 겔에 PCR 제품의 5 μl를 실행합니다. 주 : 더 밴드가 감지되면, 전체 PCR 제품을 실행하고 상업 겔 추출 키트하여 적절한 대역을 정화. </li></oL&gt; </li><li> 제한 참고 : HindIII로와의 BamHI으로 절단한다 TK 프로모터 (22) 정제 된 PCR 제품과 벡터 (예를 들어, TK-루크)의 상류에 삽입 복제합니다. <ol><li> 1 μg의 정제 된 PCR 생성물의 HindIII로 1 μL (20 U / μL), 1 μL를 BamHI (20 U / μL), 5 ㎕의 10 배의 완충액을 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물을 준비한다. </li><li> 250 ㎕의 반응 혼합물을 함유 5μg 벡터 (TK 배낭 또는 다른 리포터 벡터), 5 μL를 HindⅢ (20 U / μL), 5 μL를 BamHI (20 U / μL), 5 ㎕의 감온 알칼리성 포스파타제 (1 U / μL)를 준비 25 μl의 10 배 버퍼입니다. 주 : 벡터의 AP 처리는 크게 단일 소화 벡터의자가 결찰함으로써 배경을 감소시킨다. </li><li> 다음 절단 PCR 제품 및 시판 PCR 정제 키트로 정제 벡터를 37 ℃에서 4 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션. </li></ol></li><li> Ligatio엔 <ol><li> 2 ㎕의 10 배 T4 DNA 리가 아제 버퍼, 10 ng의 TK-루크 벡터, 50 ng의 삽입 (소화 PCR 제품), 1 μL T4의 DNA 리가 아제 (400 U / μL) 및 뉴 클레아없는 물을 포함하는 PCR 튜브에 결찰의 반응을 설정 20 μL까지. 참고 : 반응이 삽입을 포함하지 않는 음성 대조군을 준비합니다. </li><li> 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하여 반응을 상하 소형 원심 분리기를 이용하여 간단히 PCR 튜브를 스핀 다운 한 후 10 분 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 열은 얼음에 진정 50 μl의 유능한 세포 (예, DH5α)에 변환을위한 제품의 5 μl를 사용하여 10 분 동안 65 ° C에서 비활성화. </li><li> 상용 키트와 함께, 박테리아를 변환 식​​민지를 선택하고 플라스미드 DNA를 분리 표준 열 충격 절차를 사용하십시오. 다음 단계 이전에 시퀀싱에 의해 모든 구조를 확인합니다. </li></ol></li><li> ES 세포의 형질 <ol><li> 48 웰 플레이트를 사용합니다. 200 ㎕를 0.1 % 젤라틴 오디오 솔루션을 추가셀 도금하기 전에 이온 / 웰 30 분. </li><li> 플레이트 배아 줄기 (ES) 세포를 형질 전환 전에 하루. / 잘 250 μL의 ES 미디어에 잘 당 3 × 104 세포의 밀도로 공급이없는 ES 세포와 플레이트를 사용합니다. </li><li> . 플라스미드 믹스를 준비 믹스 (각 믹스 치료 4, 4 레티노 산 처리 된 8 우물, 계산됩니다) 1 : 1,250 ng의 TK-루크 빈 (음성 대조군), 950 ng를 β 갈 락토시다 코딩 벡터 (βGal), 믹스 2 : 1250 NG TK-루크 Hoxa1 인핸서 (양성 대조군), βGal, 믹스 3 NG 950 : 1250 NG TK-루크 PRMT8 인핸서 (관심 지역), βGal NG (950). 주 : ES 세포는 목적하는 전사 인자를 발현 (RAR / RXR). 루시 페라 제 및 β - 갈 락토시다 측정시 이후 기본 값을 결정하는 형질 감염되지 않은 우물을 둡니다. </li><li> 106 μL에 (8 우물에 충분한) 총 부피를 혼합 각각의 플라스미드로 형질 품질 저하 혈청 미디어를 추가합니다. </li><li> 4.5 μL ES 품질 트랜 추가이온 시약은 위아래로 15 회 피펫 팅에 의해 조심스럽게 섞는다. RT에서 10 분 동안 형질 감염 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 잘 당 세포에 형질 믹스의 13 μl를 추가 피펫으로 잘 섞는다. 다시 인큐베이터 리간드 치료 전 (37 ° C) O / N로 세포를 놓습니다. </li><li> 세포 흡인에 의해 조심스럽게 용지를 제거하고 250 μl를 추가 신선한 미디어 / 웰 0.01 포함 - 차량으로 최종 농도 또는 DMSO로 1 μM 모든 트랜스 레티노 산 (RA)를. 48 시간 - 24에 대한 세포를 품어. 참고 : 레티노 산 민감한 빛입니다. </li></ol></li><li> 세포 용 해물의 제조 <ol><li> 5 배 용해 버퍼 (1.25 ㎖의 0.5 M 트리스, pH는 7.8, 희석 1 ml의 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT) (H 2 O), 10 ml의 0.1 M EDTA의 pH는 8.0, 50 ㎖ 글리세롤, 5 ml의 트리톤 X-100, 살균에 100 ㎖에 물 최대), 멸균 물을 사용 1x에서 20 ㎕의 1 M DTT / 10 ml에 추가하고 사용 전에 실온으로 평형을합니다. 분석의 날에 48 웰 플레이트 10 ml의를 준비합니다. </li&gt; <li> 세포 흡인에 의해 조심스럽게 용지를 제거합니다. 1X PBS로 한 번 세포를 씻어. 세포에 200 ㎕의 1 배 용해 버퍼 / 아니라 직접 추가합니다. </li><li> RT (화학 용해)에서 2 시간 동안 흔들어. -80 ° C (기계 용해)에서 접시에 세포 용 해물을 고정. 해물 며칠 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 해물을 해동. 해동 완료 후, 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에 세포 용 해물을 전송. 전송 β 갈 락토시다 제 분석 용 96- 웰 클리어 플레이트에 세포 용 해물 80 ㎕의 루시퍼 라제 및 측정을위한 백색 플레이트에 세포 용 해물 40 μL. 모든 거품을 형성하지 마십시오. </li></ol></li><li> β - 갈 락토시다 분석 참고 : 베타 갈 락토시다 아제 또는 다른 초 기자가 아닌 특정 실험 변동을 고려하기 위해 내부 통제로 사용되어야한다. <ol><li> β - 갈 락토시다 기판 버퍼를 준비 : 80.0 g 나 2 HPO 4 • 7H 2 O,H 2 O • 3.8 g의의 NaH 2 PO 4, 30.0 g의 KCl, • 7H 2 O 4, 멸균 물 1,000 ml의 구성 1.0 g의 황산. 7.4으로 산도를 조정합니다. 4 ° C에서 살균 (0.2 마이크론) 및 저장 필터 </li><li> 4 mg을 ONPG와 함께 1 ml의 β - 갈 락토시다 기판 버퍼를 혼합 (O 니트로 페닐-β-D-갈 락토시다). 그냥 사용하기 전에 버퍼 1 ㎖ 당 2- 머 캅토 에탄올 (βME)의 3.5 μl를 추가합니다. 80 ㎕의 세포 용 해물에 100 ㎕의 β - 갈 락토시다 기판 버퍼를 추가합니다. </li><li> 희미한 노란색이 개발 될 때까지 37 ℃에서 반응을 품어. 플레이트 리더와 수출 데이터를 OD 420 nm에서 흡광도를 참조하십시오. 주 : 시간이 일반적으로 더 이상 30 분 이상은 형질 전환 효율에 따라 달라집니다. </li></ol></li><li> 루시 페라 제 분석 <ol><li> 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 추가, 15.1 mg을 D-루시페린 소금, 82.7 mg의 ATP 소금, 185 mg의 황산 • 7H 2 O : 50 ml의 루시페린 기판 시약을 준비다음, 1.5 ml의 1 M HEPES 버퍼, 48.5 ml의 ATP없는 물, 소용돌이를 추가 모든 화합물이 완전히 용해해야합니다. -80 ° C에서 10 ml의 분취 량 - (5)를 유지합니다. </li><li> 시작하기 전에 RT 따뜻한 5 ㎖ 루시페린 기질 시약. 피펫 100 μL 기판 파쇄의 40 μl를 함유하는 백색 플레이트의 각 웰에 시약 즉시 발광 카운터 장치를 이용하여 신호를 측정한다. </li><li> 세중의 형질 적어도 3 개의 독립적 인 실험 활동을 얻습니다. </li><li> 각 측정 값으로부터 비 - 형질 감염된 세포에 대해 측정 된 평균 값을 감산하여 제 각 웰의 기본 정규화 루시퍼 라제 활성 및베이스 정규화 β 갈 락토시다 값을 계산한다. 그 후 루시퍼 라제 / β 갈 락토시다 제 활성의 비를 계산한다. </li></ol></li></ol> 증강 RNA의 3 특성 참고 : 증강 활동의 직접적인 지표는 최근 게놈 w 등장했다증강로부터 전사되는 NT 50 2000에서 크기에 이르기까지 많은 짧은 비 코딩 RNA를 식별하고, (eRNAs)을 증강 RNA를 지칭하는 IDE 연구 16,25,26 (그림 4). eRNA 유도 매우 인접 엑손 - 코딩 유전자의 유도와 연관. 따라서, 신호 의존 인핸서 활성은 RT-qPCR에 의해 여러 가지 조건 사이 eRNA 생산과 비교하여 생체 내에서 정량화 할 수있다. <ol><li> RT-qPCR에 의한 eRNA 검출 용 프라이머 설계를위한 가이드 라인 <ol><li> 2킬로바이트 거리에 주석 전사 시작 사이트에서 - 적어도 1.5있는 그 eRNA 측정을위한 게놈 영역을 선택합니다. 참고 : 중요한 유전자 내 인핸서에서 mRNA의 전사의 높은 수준을 감지 방향으로 eRNA의 정확한 정량을 방지, 유전자 내 인핸서에서 안티센스 eRNAs는 감지하고 extragenic 증강에 eRNAs에 수준에서 유사하다. </li><li> 일반적으로, 지역 (200) 사용 - 1,000 BP 이리저리센스 또는 안티센스 가닥 (그림 4, 그림 6)에 하나 프라이머 디자인에 대한 관심의 결합 부위 전사 인자의 중심을 해요. 참고 : GRO-SEQ, DNase의-SEQ, H3K4me1, H3K4me3 또는 H3K27ac 칩 - 서열 데이터가 더 정확한 프라이머 디자인에 사용할 수 있습니다 원하는 세포 유형 및 조건에서 사용할 수있는 경우. eRNAs는 H3K4me1 및 여기서 Me3 높은 수준의 특징으로 추정 인핸서 지역에서 전사한다. eRNAs의 발현은 긍정적으로 활성화 인핸서 히스톤 마크 H3K27ac의 농축와 상관 관계. </li><li> Primer3에 의해 eRNAs의 형광 염료 기반의 RT-qPCR에 측정을위한 디자인 PCR 프라이머 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) (23)에 따라 프라이머 디자인에 대한 안티센스 서열 (센스 가닥의 보완 역)을 생성합니다 : http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. 프라이머 디자인에 대한 감각 또는 안티센스 시퀀스의 300 bp의 - (200)를 삽입합니다. </li></ol></li><li> eRNA의 전사의 측정 </strong&gt; <ol><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 상업 산성 페놀 / 클로로포름 기반 추출 시약으로 처리 한 세포에서 총 RNA를 분리합니다. </li><li> 이전 역전사 반응에 그들을 사용에 고립 된 RNA를 치료하기 위해 DNaseI를 사용합니다. 전사를 반대하기 전에 제조업체의 권장 사항에 따라 DNase의를 비활성화. </li><li> DNase의 I 처리 후 RNA 농도를 측정하고 RT 반응 1,000 NG를 사용합니다. 높은 품질의 역 효소를 사용합니다. 주 : eRNAs 다수가 폴리아 데 닐화되지 않을 때, 역전사 랜덤 프라이머의 사용을 필요로한다. </li><li> 검색 역방향 표준 절차를 사용하여 RT-qPCR에 의해 eRNA을 전사. 정규화를위한 무 처리 의존 mRNA의 측정 (예를 들어, 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB). </li></ol></li></ol>

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최근 몇 년 동안 시퀀싱 기술의 발전으로 많은 세포 유형 및 조직에서 인핸서를 대규모로 예측할 수 있게 되었습니다 7-9. 위에서 설명한 워크플로를 통해 ChIP-seq 데이터를 기반으로 선택된 후보 인핸서의 1차 특성화를 수행할 수 있습니다. 자세한 단계와 참고 사항은 누구나 실험실에서 일상적인 인핸서 검증을 설정하는 데 도움이 됩니다.
루시페라아제 리포터 분석에서 가장 중요한 단계는 형질감염 효율입니다. 모든 실험에서 형질감염 효율을 추정하기 위해 GFP-구조물을 포함하는 것이 좋습니다. 신선하고 좋은 품질의 플라스미드를 갖는 것이 중요할 수 있으며 형질감염을 크게 향상시킬 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 모든 셀룰러 모델 시스템에 적용될 수 있습니다. 조직 특이적 인핸서의 특성화를 위해 적절한 세포 유형을 사용하는 것이 좋습니다. 따라서 루시페라아제 리포터 분석은 실험을 위해 선택된 세포가 효율적으로 형질감염 가능해야 함을 요구합니다. 대안적으로, 관심 ...

다세포 유기체의 발달은 발달 중인 조직에서 수천 개의 유전자의 정확하게 조절된 발현을 필요로 합니다. 유전자 발현의 조절은 대부분 인핸서(enhancer)에 의해 이루어집니다. Enhancer는 전사 인자(transcription factor, TF)와 결합할 수 있고 원거리에서 작용하여 표적 유전자1의 전사를 활성화할 수 있는 짧은 비암호화 DNA 요소입니다. 인핸서는 일반적으로 시스 작용하며 전사 시작 부위(TSS)의 바로 업스트림에서 가장 자주 발견되지만, 최근 연구에서는 인핸서가 훨씬 더 업스트림, 유전자의 3' 또는 인트론 및 엑손2 내에서 발견되는 예도 설명했습니다. 
척추동물 게놈에는 수십만 개의 잠재적 인핸서가 있습니다1. ChIP(chromatin immunoprecipitation)를 기반으로 하는 최근의 방법은 enhancer analysis3-9에 사용할 수 있는 전체 유전체에 대한 고처리량 데이터를 제공합니다. ChIP-seq 실험으로 얻은 데이터는 세포 및 조직 특이적 인핸서를 식별할 가능성을 크게 높이지만, 검출된 결합 부위가 반드시 직접 DNA 결합 및/또는 기능 인핸서를 식별하는 것은 아니라는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 새로 식별된 인핸서에 대한 추가 기능 분석이 필수적입니다. 이 작업에서는 추정 활성 인핸서 식별 및 검증의 기본 3단계 프로세스를 제시합니다. 여기에는 1) ChIP-seq 데이터의 생물정보학 분석에 의한 추정 전사 인자 결합 부위 선택, 2) 리포터 구성물에서 이러한 조절 서열의 클로닝 및 검증, 3) 인핸서 RNA(eRNA) 측정이 포함됩니다. 
배아 줄기 세포를 레티노산(RA)에 노출시키는 것은 만능 세포의 신경 분화를 촉진하기 위해 자주 사용됩니다 10. RA는 RA 수용체(RARα, β, γ)와 레티노이드 X 수용체(RXRα, β, γ)에 결합하여 효과를 발휘합니다. 이종이량체 형태의 RAR 및 RXR은 일반적으로 AGGTCA 서열(절반 부위라고 함)의 직접 반복으로 배열되어 전사를 조절하는 RA 반응 요소(RA-response elements)라고 하는 DNA 모티프에 결합합니다. 리간드 처리 실험을 통해 ES 세포 11,12에서 여러 레티노산 조절 유전자를 확인할 수 있었습니다. 그러나 이러한 유전자 중 많은 부분에 대한 인핸서 요소는 아직 설명되지 않았습니다. 여기에 설명된 워크플로우를 인핸서 식별 및 검증에 사용하는 방법을 보여주기 위해 배아 줄기 세포에서 두 가지 레티노산 의존성 인핸서의 선택 및 특성화를 단계별로 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA 중합효소</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & 티슈 키트&nbsp;</td><td>게놈 DNA 분리를 위한</td> <td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>PCR 제품 정제를 위한</td></tr><tr><td>젤 추출 키트&nbsp;</td><td>PCR 산물이 더 많은 경우 겔 추출을 위한</td> <td>Qiagen</td><td>28706</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>DNA에서 5'- 및 3'-인산기 방출</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>결찰</td></tr><tr><td>QIAprep 플라</td><td>스미드 분리용</td>스핀 Miniprep 키트 <td>Qiagen</td><td>27106</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES 배지</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES 배지</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>시그마</td><td>M7145</td><td>ES 배지</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333</td><td>ES 배지</td></tr><tr><td>베타 메르캅토에탄올</td><td>시그마</td><td>M6250</td><td>ES 미디어</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>형질주입 시약</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; 나는</td><td>transfection</td>All-trans-retinoic acid Sigma R2625 리간드, <td></td> RAR/RXR 96-well clear plate Greiner 655101 beta galactosidase assay 96-well white plate Greiner 655075 Luciferase assay D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 위한 transfection All-trans-retinoic acid Sigma R262 리간드를 위한 혈청 Medium Life Technologies <td>31985-062</td>를 줄였습니다</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>115144-35-9</td><td>Luciferase 분석</td></tr><tr><td>ATP 염</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>Luciferase 분석</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Luciferase 분석용</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td></tr><tr><td>Luciferase 분석용</td><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td> Na</tr><tr><td>2HPO4 &#8226; 7H2O</td> 베타 <td>갈락토시다아제 분석을 위한</td><td>시그마</td><td>431478-50G</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226; </td><td>베타 갈락토시다제 분석을 위한</td>H2O <td>Sigma</td><td>S9638-25G</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>베타 갈락토시다제 분석</td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P9541-500G</td><td>베타 갈락토시다제 분석</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&beta;-D-galactosidase)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>베타 갈락토시다제 분석</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA 분리</td></tr><tr><td>고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>eRNA</td></tr><tr><td>Rnase-free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase 처리</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR 마스터믹스</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade; 실시간 PCR 검출 시스템</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCR 기계</td></tr><tr><td>BioTek Synergy 4 마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td>발광 카운터</td></tr></tbody></table>

예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

배아 개발은 많은 유전자의 활성화와 억압을 포함하는 다단계 과정이다. 게놈 인핸서 요소는 세포 분화 동안 유전자 발현의 조직 및 세포 - 유형 특이 조절에 기여하는 것으로 알려져있다. 따라서, 자신의 식별 및 추가 조사는 세포의 운명이 결정되는 방법을 이해하기 위해 중요하다. 유전자 발현 데이터 (예를 들어, 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ) 및 염색질 면역 (칩) 기반 게놈 전체 연구 (칩 SEQ)의 결과의 통합은 이러한 조절 영역의 대규모 식별을 허용한다. 그러나, 세포 형 특정 증강 기능 검증은 생체 외 및 생체 내 실험 절차에 더 필요합니다. 여기에서 우리는 활성 강화제를 식별하고 실험적으로 검증 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 칩 서열 데이터 분석, 2)의 복제 및 EXPER 의해 조절 영역 1) 식별이 프로토콜을 포함하는 단계별 흐름을 제공한다imental 리포터 분석에서 확인 된 게놈 서열의 추정 규제 가능성 검증 및 인핸서 RNA 전 사체 수준을 측정하여 생체 내에서 증강 활성 3) 결정. 제시된 프로토콜은 실험실에서이 워크 플로를 설정하는 사​​람을 도울 수있을만큼 자세히 설명되어 있습니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 쉽게 적응 및 셀룰러 모델 시스템에서 사용될 수있다.

우리는 게놈 전체에있는 RA-조절 유전자가 근접 수용체 농축을 식별하기 위해 범 특정 RXR 항체를 사용했다. 레티노 산으로 처리 ES 세포에서 얻은 RXR 칩 서열 데이터의 생물 정보학 분석은 RXR 사이트를 점령 하에서 핵 수용체 절반 사이트 (AGGTCA) (그림 1)의 농축을 밝혔다. 생물 정보학 알고리즘을 사용하여 우리는 RXR 칩 - 서열 데이터에 반 사이트 (그림 2)의 모티브 검색 결과를 다시 매핑. 이 분석은 정확하게 정식 핵 수용체 결합 부위와 중복 된 그 칩 피크를 식별하는 데 도움을 주었다. IGV에서이 사이트의 시각화 Hoxa1, 이전에 특징 RAR / RXR 목표 (그림 2와 그림 3)의 근접 이들 전사 인자의 농축을 지적했다. 우리는 또한 신규 RA의 표적 유전자, 즉 PRMT8 (27)를 확인했다. 이...

이 작업에서는 활성 인핸서를 식별하고 실험적으로 검증하는 방법에 대한 실험적 워크플로를 제공합니다.

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

이 영상의 전반적인 목표는 인핸서(enhancer)라고 불리는 게놈 조절 요소를 식별하고 실험적으로 검증하기 위한 통합된 방법 세트를 제공하는 것입니다. 이 방법은 세포 분화 과정이나 외부 자극에 반응하여 일어나는 인핸서 선택 및 활용을 포함해, 생물학적 사건의 전사와 조절에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제시된 워크플로우의 주요 장점은 프로토콜을 쉽게 조정하여 어떤 세포 모델 시스템에서도 사용할 수 있다는 점입니다.절차의 단계를 시연하겠습니다. 우선, 기존의 chip seq 분석을 바탕으로 후보 인핸서를 선택하십시오. 게놈 브라우저를 사용하여 원하는 chip seq 실험 결과를 확인하고, 관심 유전자 인근의 결합 부위를 식별하십시오.선택한 게놈 영역의 200-400 base pair 서열을 얻기 위해 Define a Region of Interest를 선택하고, 해당 서열을 이후의 프라이머 설계에 사용하십시오. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 선택한 게놈 영역을 증폭하고 리포터 플라스미드 컨스트럭트에 클로닝하십시오. 인핸서 활성을 테스트하려면, 먼저 48-well 플레이트의 웰당 0.1% gelatin 용액 200 micro liters를 첨가하여 리포터 컨스트럭트를 마우스 배아줄기세포에 트랜스펙션하십시오.플레이팅 전 플레이트를 30분 동안 인큐베이션합니다. 트랜스펙션 전날, 웰당 3×10⁴ cells의 밀도로 ES 배지 250 µL에 피더-프리 배아줄기세포(ES cells)를 플레이팅합니다. 트랜스펙션 당일에 각 믹스당 8개 웰에 충분한 양의 플라스미드 믹스를 준비합니다.각 플라스미드 혼합물에 transfection quality reduced serum medium을 추가하여 부피를 106 µL로 맞춥니다. 그 다음, ES quality transfection reagent 4.5 µL를 첨가하고, 피펫팅으로 15회 조심스럽게 위아래로 섞어줍니다. transfection 혼합물을 상온에서 15분 동안 배양합니다.배양 후, 각 웰에 13 µL의 transfection mix를 첨가하고 피펫팅하여 충분히 혼합합니다. 그런 다음, lichen 처리 전까지 세포를 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. transfection 효율은 매우 중요한 단계입니다.다른 세포 유형을 사용하는 경우, 이 단계에 대한 최적화가 필요합니다. 컨텍스트 의존적 효과를 최소화하려면 인핸서 활성을 테스트하는 데 가장 적절한 세포 유형을 사용하십시오. 다음 날, 흡입법으로 배지를 조심스럽게 제거하고, 1 $\mu$M all trans retinoic acid 또는 용매로서 DMSO가 포함된 신선한 배지 250 $\mu$L를 웰당 추가합니다.세포를 24-48시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 용해 버퍼를 준비한 후, 세포에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 1X PBS를 사용하여 세포를 한 번 세척한 다음, 웰당 200 micro liters의 1X 용해 버퍼를 첨가합니다.실온에서 세포를 2시간 동안 흔들어 줍니다. 그 다음, 세포를 완전히 용해하기 위해 플레이트에 담긴 세포 용해물을 80 °C에서 동결시킵니다. 용해물을 완전히 해동한 후, 전자식 멀티 채널 피펫을 사용하여 세포 용해물 80 µL를 beta galactosidase 측정을 위한 96웰 투명 플레이트에 옮기고, 용해물 40 µL를 luciferase 측정을 위한 화이트 플레이트에 옮깁니다.beta galactosidase 분석을 수행하려면, beta gal 기질 버퍼 1 mL와 OMPG 4 mg을 혼합하십시오. 그 다음, 혼합물에 beta mercaptoethanol 3.5 µL를 첨가하고, 즉시 세포 용해물 80 µL에 버퍼 100 µL를 첨가하십시오. 옅은 노란색이 나타날 때까지 37 °C에서 반응물을 배양하십시오.플레이트 리더를 사용하여 420 nano meters에서 흡광도를 측정하고 데이터를 내보냅니다. 루시퍼레이스 분석을 수행하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 기질 시약을 준비한 후, 시작 전 루시퍼레이스 기질 시약을 상온으로 가온합니다. 그 다음, 40 micro liters의 세포 용해물이 들어 있는 화이트 플레이트의 각 웰에 100 micro liters를 피펫으로 분주합니다.루미네선스 측정기를 사용하여 즉시 신호를 측정하십시오. 최소 3회 이상의 독립적인 형질전환 및 실험을 통해 활성도를 얻으십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 두 분석 모두에 대한 계산을 수행하십시오.RT-qPCR을 통한 eRNA 검출용 프라이머를 설계하려면, 주석이 달린 모든 유전자 전사체로부터 최소 1.5~2 kb 떨어진 게놈 영역을 선택하십시오. 유전자의 상대적 방향을 확인하고, 센스(sense) 및 안티센스(anti-sense) 전사체의 위치를 결정하십시오. 인핸서 RNA 정량 분석용 프라이머를 설계하려면, 전사 인자 결합 부위의 중심에서 200~1,000 bp 거리의 영역을 선택하십시오.유전자가 마이너스 가닥에 위치한 경우, 플러스 가닥의 200-300 base pairs를 복사한 후 서열을 변환하여 역상보 서열(reverse complement sequence)을 얻으십시오. 그 다음, 이 서열을 사용하여 후속 프라이머 설계를 진행하십시오. Product Size Range는 80-150 base pairs 사이로 설정하십시오.eRNA 전사를 측정하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 처리된 세포에서 총 RNA를 분리한 후 표준 절차를 통해 RT-qPCR로 역전사된 eRNA를 검출합니다. 정규화를 위해 처리에 영향을 받지 않는 mRNA를 측정하십시오. 여기에서 보여주는 바와 같이, 레티노산으로 처리한 ES 세포에서 얻은 RXR chip-seq 데이터의 생물정보학 분석 결과, RXR 점유 부위 하단에서 핵 수용체 하프 사이트(nuclear receptor half site)의 농축이 확인되었습니다.생물정보학 알고리즘을 사용하여, half-site에 대한 모티프 검색 결과를 RXR chip seq 데이터에 다시 매핑하였습니다. 이 분석을 통해 표준 핵 수용체 결합 부위와 겹치는 chip 피크를 확인하였습니다. IGV를 통한 해당 부위의 시각화 결과, Hoxa1 근처에서 전사 인자의 농축이 나타났습니다.이전에 특성이 분석된 RAR RXR 표적입니다. 새로운 RA 표적 체인인 PRMT8의 처벌성 인핸서(punitive enhancer) 또한 확인되었습니다. 확인된 인핸서 영역을 TK luciferase 리포터 벡터에 클로닝하였으며, ES 세포에 이 컨스트럭트들을 트랜스펙션하였습니다.RA의 존재 및 부재 하에서 루시페라제 활성을 측정하였습니다. RA 반응 요소(RA response element, RARE)를 포함하는 구조체는 RA 처리 시 루시페라제 신호 강도가 증가한 반면, RARE가 없는 구조체는 유도되지 않았습니다. Hoxa1 RAR RXR 결합 인핸서의 sense 및 anti-sense eRNA 발현이 해당 유전자의 mRNA 발현과 상관관계가 있는지 확인하기 위해 Hoxa1 eRNA 수준 또한 측정하였습니다. 결과적으로 단기 RA 처리에 의해 인핸서 활성이 유도됨을 확인하였습니다.이 작업 과정을 숙달하면 설명된 인핸서 트랩 실험과 인핸서 정량화를 수행함으로써 며칠 내에 완료할 수 있으며, 이를 통해 인핸서 활성에 대한 강력한 기능적 근거를 제시할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 처벌성 인핸서(punitive enhancers)를 식별하고 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인핸서가 식별되고 검증되면, 검증된 인핸서에 의해 어떤 유전자가 조절되는가와 같은 추가적인 중요 질문에 답하기 위해 염색체 확인 캡처(chromosomal confirmation capture, CCC)와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

이 영상은 레티노산과 행잉 드롭 배양법을 이용하여 줄기세포를 신경전구세포로 분화시키는 방법을 보여줍니다.

레티노산을 이용한 배아체세포(Embryoid body cells into Neural Progenitors)를 이용한 신경전구세포(Embryoid body cells into Neural Progenitors Using Retinoic Acid)

이 비디오는 마우스 배아에서 레티노산 활성을 평가하는 기술을 보여줍니다. 마우스 배아에서 세포를 분리하면 세포를 레티노산(RA) 리포터 세포와 공동 배양합니다. 배아 세포는 RA를 생성하는데, 이는 리포터 세포에서 베타-갈락토시다아제 발현을 유도하여 배아 세포에서 RA 활성을 나타냅니다.

마우스 배아 세포에 의한 레티노산 생산을 연구하기 위해 공동 배양에서 리포터 세포 사용

리포터 세포주 시각화 추적 이종 집단의 관심의 세포를 분리 할 수​​있는 수단을 제공한다. 그러나, 유전자 - 표적 인간 배아 줄기 세포에서 종래의 상동 재조합을 사용하여 매우 비효율적이다. 여기서, 우리는 아연 핑거 클레아 향상된 상동 재조합을 사용하여 EGFP CNS 중뇌 특정 전사 인자 PITX3 궤적 타겟팅 기술한다.

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

여기서는 하류 어플리케이션 및 상기 분화의 개선을위한 결정적인 내배엽으로 분화 노력하고 인간 배아 줄기 세포의 정제를위한 방법을 설명한다.

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

소량의 조직에서 레티노산(RA) 수치를 정확하게 측정하는 방법은 존재하지 않습니다. 이 프로토콜은 RA 리포터 세포주를 사용하여 E8.5 배아 및 신경구에서 상대적 RA 수준을 쉽고 정량적으로 측정하는 방법을 설명합니다.

F9를 RARE-LacZ를 셀 기반 리포터 분석을 사용하여 E8.5 배아 및 Neurosphere 문화에서 상대 레티노 산 수준의 정량적 측정

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

침지된 비드 분석은 세포 분화 및 형태형성의 조절을 연구하기 위해 임의의 발달 시점에서 시험 시약의 표적화된 전달을 포함한다. 세 가지 다른 유형의 침지 된 구슬을 준비하고 닭 배아의 교차 숫자에 이식하기위한 모든 실험 동물 모델에 적용 가능한 상세한 프로토콜이 제시됩니다.

Soaked-Bead Assay를 사용한 닭 배아 발생 동안의 세포 분화, Morphogenesis, 및 패터닝 분석

학습하세요 유전자 규제 요소인 인핸서를 예측하고 검증하는 통합 방법을 통해 전사 조절 메커니즘을 연구하세요. 이 프로토콜은 다양한 세포 모델 시스템에 쉽게 적용할 수 있어 유연한 연구가 가능합니다.

예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

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